Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Samenvatting

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Samenvatting

Rotavirussen zijn een grote en evoluerende populatie van gesegmenteerde dubbelstrengs RNA-virussen die ernstige gastro-enteritis veroorzaken bij de jonge van vele zoogdier- en vogelsoorten, waaronder mensen. Met de recente komst van rotavirus omgekeerde genetica systemen, is het mogelijk geworden om gerichte mutagenese te gebruiken om rotavirus biologie te verkennen, te wijzigen en te optimaliseren bestaande rotavirus vaccins, en rotavirus multitarget vaccin vectoren te ontwikkelen. In dit rapport beschrijven we een vereenvoudigd reverse genetica systeem dat het mogelijk maakt de efficiënte en betrouwbare herstel van recombinante rotavirussen. Het systeem is gebaseerd op co-transfection van T7 transcriptie vectoren uitdrukken full-length rotavirus (+)RNAs en een CMV vector codering van een RNA capping enzym in BHK cellen constitutief produceren T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotavirussen worden versterkt door het overzien van de getransfecteerde BHK-T7 cellen met MA104 cellen, een aap niercel lijn die zeer tolerant is voor virusgroei. In dit rapport beschrijven we ook een aanpak voor het genereren van recombinante rotavirussen die een apart fluorescerend reporter-eiwit uitdrukken door de introductie van een 2A translationeel stop-herstartelement in genoomsegment 7 (NSP3). Deze aanpak voorkomt het verwijderen of wijzigen van een van de virale open leesframes, waardoor de productie van recombinante rotavirussen die volledig functionele virale eiwitten behouden terwijl het uitdrukken van een fluorescerend eiwit.

Inleiding

Rotavirussen zijn belangrijke oorzaken van ernstige gastro-enteritis bij zuigelingen en jonge kinderen, evenals de jongen van vele andere zoogdier- en vogelsoorten¹. Als leden van de Reoviridae familie hebben rotavirussen een gesegmenteerd dubbelstrengs RNA (dsRNA) genoom. De genoomsegmenten bevinden zich in een niet-gehulde icosahedralvirion gevormd uit drie concentrische lagen eiwit^2. Op basis van sequencing en fylogenetische analyse van de genoomsegmenten zijn negen soorten rotavirus (A−D, F−J) gedefinieerd³. Deze stammen die rotavirussoort A omvatten, zijn verantwoordelijk voor de overgrote meerderheid van de menselijke ziekte⁴. De introductie van rotavirusvaccins in kindervaccinatieprogramma's die in het laatste decennium beginnen, is gecorreleerd met een aanzienlijke vermindering van de mortaliteit en morbiditeit van het rotavirus. Het meest in het bijzonder is het aantal sterfgevallen door rotavirus gerelateerde sterfgevallen bij kinderen gedaald van ongeveer 528.000 in 2000 tot 128.500 in 2016^4,5. Rotavirus vaccins zijn geformuleerd uit levende verzwakte stammen van het virus, met 2 tot 3 doses toegediend aan kinderen door 6 maanden oud. Het grote aantal genetisch diverse rotavirusstammen die circuleren bij mensen en andere zoogdiersoorten, in combinatie met hun vermogen om snel te evolueren door middel van mutagenese en herassortiment, kan leiden tot antigene veranderingen in de soorten rotavirussen infecteren kinderen^6,7,8. Dergelijke veranderingen kunnen de werkzaamheid van bestaande vaccins ondermijnen, waardoor ze moeten worden vervangen of gewijzigd.

De ontwikkeling van volledig plasmid-gebaseerde omgekeerde geneticasystemen die manipulatie van om het even welk van de 11 rotavirusgenoomsegmenten toelaten werd slechts onlangs bereikt⁹. Met de beschikbaarheid van deze systemen is het mogelijk geworden om moleculaire details van rotavirusreplicatie en pathogenese te ontrafelen, verbeterde screeningsmethoden met hoge doorvoer voor anti-rotavirusverbindingen te ontwikkelen en nieuwe potentieel effectievere klassen van rotavirusvaccins te creëren. Tijdens de replicatie van het rotavirus leiden afgetopte virale (+)RNA's niet alleen de synthese van virale eiwitten, maar dienen ze ook als sjablonen voor de synthese van progeny dsRNA genoomsegmenten^10,11. Alle rotavirus reverse genetica systemen beschreven tot op heden vertrouwen op de transfection van T7 transcriptie vectoren in zoogdier cellijnen als een bron van cDNA-afgeleide (+)RNAs gebruikt bij het herstellen van recombinant virussen^9,12,13. Binnen de transcriptievectoren worden virale cDNO's over de hele lengte geplaatst tussen een upstream T7-promotor en een downstream hepatitis deltavirus (HDV) ribozyme, zodat virale (+)RNA's worden gesynthetiseerd door T7 RNA polymerase die authentieke 5' en 3'termini (figuur 1A) bevatten. In de eerste generatie reverse genetica systeem, recombinante virussen werden gemaakt door transfecting baby hamster niercellen uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) met 11 T7 (pT7) transcriptie vectoren, elke regiesynthese van een uniek (+)RNA van de simian SA11 virusstam, en drie CMV promoter-drive expression plasmiden, één die het aviaire reovirus p10FAST-fusie-eiwit codeert en twee coderingssubeenheden van het vacciniavirus D1R-D12L capping enzymcomplex⁹. Recombinant SA11 virussen gegenereerd in transfected BHK-T7 cellen werden versterkt door toezicht met MA104 cellen, een cellijn tolerant voor rotavirus groei. Een aangepaste versie van de eerste generatie reverse genetica systeem is beschreven dat niet langer gebruik maakt van steun plasmiden¹². In plaats daarvan genereert het gewijzigde systeem met succes recombinante rotavirussen door bhk-T7-cellen te transfecteren met de 11 SA11 T7 transcriptievectoren, waarbij het voorbehoud is dat vectoren voor de virale fabriek (viroplasma) bouwstenen (niet-structurele eiwitten NSP2 en NSP5) worden toegevoegd op niveaus die 3 keer hoger liggen dan de andere vectoren^14,15. Gewijzigde versies van het omgekeerde genetica systeem zijn ook ontwikkeld die het herstel van de menselijke KU en Odelia stammen van rotavirus^16,17ondersteunen . Het rotavirus genoom is opmerkelijk vatbaar voor manipulatie door omgekeerde genetica, met recombinant virussen gegenereerd tot op heden met mutaties geïntroduceerd in VP4¹⁸, NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21, en NSP5^22,23. Onder de meest nuttige virussen die tot nu toe zijn gegenereerd, zijn die welke zijn ontworpen om fluorescerende reporter eiwitten (FPs)^{9,12,,21,24,25}uit te drukken .

In deze publicatie bieden we het protocol voor het omgekeerde geneticasysteem dat we in ons laboratorium gebruiken om recombinante stammen van SA11 rotavirus te genereren. Het belangrijkste kenmerk van ons protocol is co-transfection van BHK-T7 cellen met de 11 pT7 transcriptie vectoren (gewijzigd om 3x niveaus van de pT7/NSP2SA11 en pT7/NSP5SA11 vectoren) en een CMV expressie vector codering van de Afrikaanse varkenspest virus (ASFV) NP868R capping enzym²¹ (Figuur 2). In onze handen leidt de aanwezigheid van de NP868R plasmid tot de productie van hogere titers van recombinante virussen door getransfecteerde BHK-T7 cellen. In deze publicatie bieden we ook een protocol voor het wijzigen van de pT7/NSP3SA11 plasmide zodanig dat recombinante virussen kunnen worden gegenereerd die niet alleen het segment 7 eiwitproduct NSP3 uitdrukken, maar ook een aparte FP. Dit wordt bereikt door het Open Leeskader (ORF) van NSP3 in het pT7/NSP3SA11 plasmide opnieuw te ontwerpen en een downstream 2A translationeel stop-restart-element te bevatten, gevolgd door een FP ORF (Figuur 1B)^24,26. Door deze aanpak hebben we recombinante rotavirussen gegenereerd die verschillende FP's uitdrukken: UnaG (groen), mKate (verrood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)^24,27,28. Deze FP-expressing rotavirussen worden gemaakt zonder de NSP3 ORF te verwijderen, waardoor virussen worden opgedaan die naar verwachting een volledige aanvulling van functionerende virale eiwitten zullen coderen.

Protocol

1. Onderhoud van de mediavoorbereiding en celcultuur

1. Verkrijgen baby hamster niercellen constitutief uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) en Afrikaanse groene aap nier MA104 cellen.
   OPMERKING: BHK-T7 (of BSR-T7) cellen zijn niet commercieel beschikbaar, maar zijn een gemeenschappelijke cellijn van laboratoria met behulp van omgekeerde genetica om RNA-virusbiologie te bestuderen. De BHK-T7 cellijn die in dit protocol werd gebruikt, werd verkregen van Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), een mede-ontwikkelaar van de originele BHK-cellijn die T7 RNA polymerase²⁹uitdrukt. MA104 cellen zijn verkrijgbaar bij European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) en van American Type Culture Collection (ATCC).
2. Bereid de volgende cultuurmedia voor in een steriele omgeving, bij voorkeur een biologische veiligheidskast van klasse II. Bewaar de media in het donker bij 4 °C en warm tot 37 °C vlak voor gebruik.
   OPMERKING: Bronnen van mediacomponenten zijn opgenomen in de tabel van materialen.
   1. Om DMEM onvolledig medium voor te bereiden, combineert u 500 mL van dulbecco's gemodificeerde Eagle's minimum essentiële medium (MEM) met 4,5 g/L glucose en 1% glutamine met 5 mL van 100x pen-strep.
   2. Om DMEM compleet medium voor te bereiden, combineert u 500 mL DMEM onvolledig medium met 25 mL foetaal runderserum (FBS).
   3. Voor de bereiding van GMEM onvolledig medium, combineren 500 mL van Glasgow minimum essentieel medium, 5 mL van 100x glutamine, 50 mL van tryptose-fosfaat bouillon (TPB), 5 mL van 100x niet-essentiële aminozuren (NEAA), en 5 mL van 100x pen-strep.
   4. Om GMEM compleet medium voor te bereiden, combineer t.o.v. 500 mL GMEM onvolledig medium met 25 mL warmte-geïnactiveerde FBS.
   5. Om GMEM+G compleet medium voor te bereiden, voeg je 10 mL van 50 mg/mL geneticin (G418) toe aan 500 mL gmem compleet medium.
   6. Om mkb-onvolledig medium voor te bereiden, combineer tuur 500 mL van Joklik's gemodificeerde Eagle's MEM, 5 mL van 100x glutamine, 50 mL TPB, 5 mL van 100x NEAA en 5 mL van 100x pen-strep.
3. Cultuur MA104 cellen in T75 of T175 kolven met respectievelijk 12 of 25 mL DMEM compleet medium. Om MA104-cellen te passeren die 100% samenvloeiing hebben bereikt, spoelt u de celmonolayer 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), dissocieert met trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) oplossing, en opnieuw opschorten in 5 (T75 kolf) of 10 mL (T175 kolf) van DMEM onvolledig medium.
   1. Plaats 0,5−1,0 mL geresuspendeerde cellen in verse kolven en breng het juiste eindvolume door dmem compleet medium toe te voegen. Doe kolven in een 37 °C, 5% CO₂ incubator.
4. Propageer BHK-T7-cellen in T75-kolven, afwisselend tussen het gebruik van GMEM en GMEM+G complete medium bij elke passageronde. Om bhk-T7 cellen die hebben bereikt 100% samenvloeiing subcultuur, spoel de cel monolayer 2x met PBS, scheiden met trypsine-EDTA oplossing, en resuspend in 5 mL van medium.
   1. Na het plaatsen van 15 mL GEM of GMEM+G complete medium in een verse T75 kolf, voeg vier druppels geresuspendeerde BHK-T7 cellen. Plaats de kolf in een 37 °C, 5% CO₂ incubator.

2. Plasmidbereiding

1. Verkrijg de volgende plasmiden die rotavirus SA11 (+)RNAs uitdrukken van Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 en pT7/NSP5SA11. Verkrijg de plasmide die het ASFV capping enzym (pCMV/NP868R) uitdrukt van de auteurs²¹.
   OPMERKING: Gewijzigde pT7/NSP3SA11 plasmiden die zijn ontworpen om een FP uit te drukken door de activiteit van een 2A translationeel element (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) kunnen ook worden verkregen bij de auteurs^24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmiden die de volgende FP's uitdrukken zijn beschikbaar: UnaG (groen), mKate (ver-rood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)²⁴.
2. Zet plasmiden om in competente E. coli coli coli DH5α en verspreid bacteriën op Luria bouillon agar platen met de juiste antibioticum. Kweek bacteriële culturen geplukt uit individuele kolonies en bereiden kleinere hoeveelheden plasmite (20 μg) met behulp van een spin miniprep zuiveringskit (Table of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. Bereid grotere hoeveelheden plasmide uit bacteriële culturen met behulp van midi en maxi zuivering kits (Tabel van materialen).
   OPMERKING: Plasmids geschikt voor gebruik in de omgekeerde genetica systeem zijn ook bereid met andere plasmid zuivering kits. Het is niet nodig om plasmiden voor te bereiden met behulp van kits die speciaal zijn ontworpen om endotoxinevrij materiaal te genereren.
3. Pas de concentraties gezuiverde plasmiden aan op 1 mg/mL in nucleasevrij moleculair biologiegraadwater. Controleer de zuiverheid van plasmid door een 260/280-absorptieverhouding van ~ 1,8 te bevestigen met behulp van een spectrofotometer. Gebruik ook elektroforese op 0,8% agarose gels om te controleren of plasmiden voornamelijk supercoiled zijn.
4. Aliquot gezuiverde plasmiden in 0,5 mL steriele microcentrifugebuizen, elk met 10 μL. Bewaar plasmiden bij -80 °C.

3. Generatie recombinantvirus

OPMERKING: Menselijk en dierlijk rotavirusonderzoek, met inbegrip van het genereren en karakteriseren van recombinante rotavirusstammen, moet worden behandeld onder Biosafety Level 2 (BSL-2) voorwaarden en vereist voorafgaande goedkeuring door het Institutioneel Biosafety Committee (IBC). Passende BSL-2 laboratoriumomstandigheden worden beschreven in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) geproduceerd door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC)³⁰.

1. Dag 1: zaaien van BHK-T7 cellen in 12-put platen
   1. Spoel een vers confluent monolayer van BHK-T7 cellen in een T75 kolf 2x met PBS. Verstoor de celmonolayer met trypsin-EDTA-oplossing en stouw de cellen opnieuw in 5 mL van GMEM complete medium.
   2. Gebruik een geautomatiseerde celteller en trypan-blauwe oplossing om de concentratie van levensvatbare BHK-T7 cellen in het medium te bepalen. Zaadcellen in 12-well celkweekplaten, waarbij elk put 2 x 10⁵ cellen bevat in een totaal volume van 1 mL GMEM (G418-vrij) compleet medium. Incubeer in een 37 °C, 5% CO₂ incubator. De cellen moeten 80−90% samenvloeiing bereiken op dag 2.
2. Dag 2: transfection van BHK-T7 cellen met plasmidemengsels
   1. Voor de bereiding van het plasmidemengsel, combineer het volgende in een microcentrifugebuis van 0,5 mL met plasmidevoorraden aangepast aan 1 mg/mL: 0,8 μL elk van SA11 pT7 plasmiden VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 en NSP4, 2,4 μL elk van SA11 pT7 plasmiden NSP2 en NSP5 en 0,8 μL pCMV/NP868R. Meng de plasmiden voorzichtig door op de buis te tikken en de inhoud te verzamelen door pulscentrifugatie. Om recombinante virussen voor te bereiden die FP's uitdrukken, vervangt u pT7/NSP3SA11 door de juiste pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmi.
      LET OP: Plasmidmengsels moeten op ijs worden opgeslagen totdat ze worden gebruikt. Voor elke transfection moet een aparte buis worden bereid.
   2. Voor de bereiding van het plasmiat/gereduceerd serummedium/transfection reagensmengsel: Voeg 110 μL voorverwarmde (37 °C) gereduceerd serummedium (Materiaaltafel)toe aan elk plasmitiemengsel en meng door zachtjes op en neer te paien. Voeg daarna 32 μL transfection reagens(Table of Materials)toe aan elk plasmiing/gereduceerd serummediummengsel; dit levert een concentratie op van 2,5 μL transfection reagens per μg plasmide in mengsels. Vortex mengsels zachtjes en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
   3. Spoel tijdens de incubatietijd van 20 minuten BHK-T7 cellen in 12-well platen (bereid op dag 1) eenmaal met 2 mL GMEM onvolledige media. Voeg daarna 1 mL MKB onvolledig medium toe aan elke put en breng platen terug naar de incubator.
   4. Voeg na de incubatietijd van 20 min het plasmite/verminderde serummiddel/transfetiemengsel druppel voor druppel toe aan elke put van de 12-well platen met behulp van een 200 μL pipettor. Voorzichtig schommelplaten en terug naar een 37 °C, 5% CO₂ incubator.
3. Dag 4: overzien de getransfde BHK-T7 cellen met MA104 cellen
   1. Spoel een vers confluent monolayer van MA104 cellen in een T75 kolf 2x met PBS. Verstoor de monolayer met trypsin-EDTA-oplossing en stouw cellen opnieuw op in 5 mL dmem-volledig medium.
   2. Met behulp van een geautomatiseerde celteller en trypan-blauwe oplossing, bepaal de concentratie van levensvatbare MA104-cellen in het medium. Pas de concentratie aan op 8 x 10⁵ MA104 cellen/mL in DMEM onvolledig medium en voeg 0,25 mL van zwevende cellen (2 x 10⁵ cellen) dropwise toe aan de putten met getransfecteerde BHK-T7 cellen.
   3. Pas de concentratie trypsine (varkens alvleeskliertype IX) in het medium aan tot ~0,5 μg/mL door 0,8 μL van 1 mg/mL trypsinevoorraad aan elke put toe te voegen.
      OPMERKING: Trypsinevoorraden moeten worden bereid in PBS, aliquoted, en opgeslagen bij -20 °C.
   4. Gebruik de resterende MA104-cellen om 6-well platen voor te bereiden die nodig zijn op dag 7 om recombinante virussen te versterken. Voor zaad 6-well platen, verdun geresuspended MA104 cellen tot een concentratie van 1,5 x 10⁵ cellen/mL in DMEM compleet medium en plaats 2 mL in elke put. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO₂ incubator.
4. Dag 7: herstel en versterking van recombinantvirus uit getransfecteerde cellen
   1. Onderwerp BHK-T7/MA104 cellen in 12-well platen tot drie cycli van vries-dooi onder steriele omstandigheden, bewegende platen tussen -20 °C vriezer en een kamertemperatuur oppervlak. Na het overbrengen van lysaten naar buizen van 1,5 mL, centrifugeren buizen gedurende 10 min bij 500 x g (4 °C) naar pellet grote cellulaire puin. Verzamel supernatant en bewaar bij 4 °C (korte termijn) of -20 °C (lange termijn).
   2. Was MA104 monolagen in 6-well platen (bereid op dag 4) 2x met PBS. Plaats 2 mL DMEM onvolledig medium voor elke put die 0,5 μg/mL trypsine bevat. Voeg 300 μL supernatant teruggewonnen uit BHK-T7/MA104 cellysaten toe aan putten en plaats platen in een 37 °C, 5% CO₂ incubator.
   3. Incubeerplaten gedurende 7 dagen of totdat volledige cytopathische effecten (CPE) worden waargenomen. Lyse MA104 cellen in 6-well platen door drie cycli van vries-dooi, dan overdracht lysats tot 1,5 mL microcentrifuge buizen. Pellet groot cellulair puin door centrifugering gedurende 10 min bij 500 x g (4 °C). Breng de geklaarde cellysataten over in 1,5 mL microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 °C.

4. Plaqueisolatie van recombinante virussen

1. Activeer virussen in 100 μL van geklaarde cellysataaten door trypsine toe te voegen aan een eindconcentratie van 10 μg/mL en uit te broeden bij 37 °C gedurende 1 uur. Bereid een 10-voudige serie met seriële verdunning voor, variërend van 10^-1 tot 10^-7 (1 mL per stuk) in DMEM onvolledig medium.
2. Spoel MA104 monolagen in 6-well platen 2x met 2 mL PBS en eenmaal met DMEM onvolledig medium. Voeg 400 mL lysaatverdunningsverdunningen in tweevoud toe aan de platen. Incubeer de platen voor 1 uur in een 37 °C, 5% CO₂ incubator, schommelen elke 10−15 min om verdunningen over de monolayer te herverdelen.
3. Bereid een agarose-MEM overlay oplossing door het combineren van gelijke volumes van 2x Eagle's minimale essentiële medium (EMEM; voorverwarmd tot 37 °C) met 1,5% agarose die is gesmolten in water met behulp van een magnetron en voorgekoeld tot 45 °C. Bewaar de overlayoplossing bij 42 °C met een waterbad en pas zich aan een eindconcentratie van 0,5 μg/mL trypsine aan vlak voordat u cellen plaatst.
4. Trek lysate verdunningen van 6-well platen af en spoel vervolgens eenmaal cellen af met 2 mL onvolledige DMEM. Voorzichtig overlay 3 mL van de agarose-MEM overlay oplossing op de cel monolayer in elke put. Laat de agarose overlay uitharden bij kamertemperatuur en breng de platen terug naar de couveuse.
5. Drie dagen later, bereiden een agarose-MEM overlay oplossing als in stap 4.3 en breng tot 42 °C. Pas vlak voor gebruik de overlayoplossing aan op een eindconcentratie van 50 μg/mL neutraal rood (Materiaaltafel).
6. Voeg 2 mL van de overlay-oplossing toe bovenop de bestaande agaroselaag in de 6-well platen. Nadat de nieuwe agaroselaag is verhard, worden de platen terugnaar de couveuse gebracht. Bescherm oplossingen en platen die neutraal rood bevatten tegen blootstelling aan licht.
7. In de komende 6 uur, identificeren rotavirus plaques in de 6-well platen met behulp van een lichtbak. Kies duidelijk gedefinieerde plaques met behulp van wegwerp overdracht pipten, herstellende agarose pluggen die zich volledig uitstrekken tot de cellaag.
8. Verdwijn de stekker in een buis van 1,5 mL met 0,5 mL DMEM onvolledig medium en vortex het monster voor 30 s. Versterk het plaque-geïsoleerde virus dat in het medium wordt geëlueerd door vermeerdering op MA104 monolagen in 6-well platen of T25-kolven met DMEM onvolledig medium en 0,5 μg/mL trypsin.
   OPMERKING: Aanvullende informatie over isolatie en titering van rotavirus door plaquetest is beschikbaar in Arnold et al.³¹.

5. Gel elektroforese van virale dsRNA

1. Plaats 600 μL van geklaarde geïnfecteerde cellysaten en 400 μL guanidiniumthiocyanaat in 1,5 mL microcentrifugebuizen, vortex voor 30 s, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 200 μL chloroform, vortex voor 30 s toe en incubeer gedurende 3 min. Na 5 min centrifuging bij 13.000 x g (4 °C), breng ~550 μL van de bovenste waterige fase over in verse buizen.
2. Herstel viraal dsRNA uit de waterige fase door 2 volumes (~900 μL) koude isopropylalcohol toe te voegen en buizen 4−6x om te keren. Na 10 min op kamertemperatuur te hebben gebroed, centrifugeren de centrifugebuizen gedurende 10 min bij 13.000 x g (4 °C). Gooi supernatants weg en bewaar de RNA-pellets.
3. Was de pellets door 1 mL ethanol aan de buis toe te voegen, één keer om te keren en 5 min te centrifugeren bij 7.500 x g (4 °C). Na het zorgvuldig verwijderen van de ethanolwassering met een pipettor, laat RNA-pellets gedurende 5−10 min luchtdrogen op de labbank. Los RNA-pellets op in 15 μL nuclease-vrij moleculair biologisch graadwater en bewaar op -20 °C.
4. Combineer 10 μL opgeloste RNA-monsters met 2 μL van 6x DNA-laadbuffer, laad op 10% polyacrylamide minigels (of handgegoten equivalenten) en los RNA's op door elektroforese in Tris-glycine running buffer gedurende 2 uur onder een constante stroom (16 mA). Week gels voor 5−10 min in water dat ~1 μg/mL ethidium bromide bevat en detecteer rotavirusgenoomsegmenten met een UV-transilluminator.

6. Herstel en sequencing van virale dsRNA

1. Zoek virale dsRNA-banden op polyacrylamidegels bij voorkeur met behulp van uv-licht met een lage intensiteit met een lange golflengte, om te voorkomen dat het genereren van nucleïnezuurcrosslinks. Met behulp van een vers scheermesje, knip gel fragmenten met dsRNA banden en overdracht in 1,5 mL microcentrifuge buizen.
2. Na toevoeging van 10−20 μL RNase-vrij water, verpletter tover elk fragment met een RNase-vrije wegwerppelletstamper die is ontworpen om een microcentrifugebuis van 1,5 mL te passen of door een naald van 18 G op en neer te zetten. Incubeer verpletterde fragmenten 's nachts bij 4 °C.
3. Herstel 3 μL vloeistof uit buizen die gemalen gelfragmenten bevatten. Genereren van cDNO's van de virale dsRNAs met behulp van een one-step reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) kit (Tabel van materialen) en de juiste oligonucleotide primers.
   OPMERKING: PCR-producten worden gelgezuiverd met een PCR clean-up kit (Table of Materials) en verzonden voor 's nachts sequencing, samen met primers, door commerciële DNA-sequentie diensten.

7. Immunoblot-analyse van virale eiwitten

1. Zaad 6-well platen met 3 x 10⁵ MA104 cellen per put in een totaal volume van 2 mL DMEM compleet medium. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO₂ incubator en laat tot de cellen samenvloeiing bereiken (3−5 dagen).
   OPMERKING: Putten met confluente monolagen bevatten ~ 1,2 x 10⁶ cellen.
2. Behandel verduidelijkte supernatants door met 10 μg/mL trypsine bij 37 °C gedurende 1 uur te broeden om recombinante rotavirusdeeltjes te activeren die erin zitten.
3. Spoel MA104 monolagen in 6-well platen 2x met 2 mL PBS. Infecteer cellen door aan elke put 200 μL entmateriaal toe te voegen dat 3−5 plaquevormende eenheden (PFU) per cel van trypsin-geactiveerd rotavirus in DMEM onvolledig medium bevat. Breng de borden terug naar de couveuse.
4. Elke 10 min, verwijder platen en zachtjes rock te herverdelen inoculum over de cel monolayer. Na 1 uur, vervang inoculum met 2 mL dmem onvolledig medium.
5. Bij 8 uur na infectie, spoel cellen in 6-well platen 2x met PBS. Schraap cellen in 750 μL PBS en breng het volume over op een 1,5 mL microcentrifugebuis. Spoel de plaat af met nog eens 750 μL PBS en combineer met het vorige verzamelde monster van 750 μL.
6. Pelletcellen in monster door centrifugeren op 5.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Na het weggooien van supernatant, bewaar celpellets bij -80 °C tot verder verwerkt.
7. Bereid een cellysebuffer voor met 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 en 1x EDTA-vrije complete proteaseremmer. Na toevoeging van 300 μL lysisbuffer aan bevroren celpellets, kort vortexmonsters en 10 min in te broeden op ijs.
8. Herhaal het proces van vortexen en het uitbroeden van monsters op ijs 3x. Centrifugeer daarna monsters op 15.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C, verzamel vervolgens supernatants en bewaar op -80 °C.
9. Beslecht eiwitten in 20 μL-volumes van supernatant monsters door elektroforese op prefab lineaire 8−16% polyacrylamide minigels en overbrengen naar nitrocellulosemembranen. Blokmembranen door uit te broeden met PBS-Tween 20 (0,02%) oplossing met 5% vetvrije droge melk.
10. Sondemembranen door incubatie met een of meer primaire antilichamen (bijvoorbeeld cavia anti-NSP3 of anti-VP6 antisera, muis monoklonale anti-Flag M2 antilichaam, of konijn monoklona anti-PCNA antilichaam). Detecteer primaire antilichamen door het uitbroeden van membranen met paardenanti-muisIgG, anti-cavia IgG of geitenanti-konijn IgG mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, gevolgd door het verbeterde chemiluminescentie (ECL) mierikswortel chemiluminescentiesubstraat. Visualiseer luminescentiesignalen met behulp van een gelimaging systeem(Table of Materials)of Röntgenfilm.

8. Live-cell imaging van cellen die besmet zijn met FP-uitdrukkende virussen

1. Zaad 6-well platen met 3 x 10⁵ MA104 cellen per put in een totaal van 2 mL dmem compleet medium. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO₂ incubator en laat tot de cellen samenvloeiing bereiken (3−5 dagen).
   OPMERKING: Putten met confluente monolagen bevatten ~ 1,2 x 10⁶ cellen.
2. Activeer rotavirusmonsters, van bekende titer, door incubatie met 10 μg/mL trypsine bij 37 °C gedurende 1 uur.
3. Spoel 6-well platen met MA104 monolayers 2x met 2 mL PBS. Infecteer cellen door aan elk goed 200 μL entmateriaal toe te voegen dat 3−5 PFU per cel van trypsin-geactiveerd rotavirus in onvolledig medium DMEM bevat. Breng platen terug naar de couveuse en voorzichtig rockplaten om de enoculum om de 10 min over de celmonolayer te verdelen.
   OPMERKING: Putten die nep besmet zijn met virusvrije DMEM-inoculum moeten worden opgenomen als besturingselementen.
4. Na 1 uur virusadsorptie, spoel monolayer 2x met PBS en vervang medium met 0,5 mL per put van DMEM onvolledig medium. Vervang om 7,5 uur na de infectie het kweekmedium door DMEM door een lage achtergrondfluorescentie(Tabel van materialen). Bij 8 uur na infectie, gebruik maken van een live cel imager om cellen te onderzoeken op 20x vergroting voor groen, rood of blauw fluorescentie signaal.

Resultaten

Het omgekeerde genetica protocol beschreven in dit artikel verloopt door middel van meerdere verschillende stappen: (1) co-transfection van BHK-T7 cellen met rotavirus pT7 transcriptie vectoren en een pCMV/NP868R expressie plasmide, (2) het toezicht op getransfecteerde BHK-T7-cellen met MA104-cellen, (3) versterking van recombinante virussen die aanwezig zijn in BHK-T7/MA104-cellen lysates met MA104-cellen en (4) plaqueisolatie van recombinantvirus met MA104-cellen (Figuur 2). In onze handen...

Discussie

In ons laboratorium vertrouwen we routinematig op het omgekeerde geneticaprotocol dat hierin wordt beschreven om recombinante SA11-rotavirussen te produceren. Met deze aanpak, individuen met weinig ervaring in moleculaire biologie technieken of het werken met rotavirussen herstellen recombinant virussen, zelfs op hun eerste poging. We hebben bijna 100 recombinante virussen gegenereerd volgens dit protocol, inclusief die met genomen die zijn opnieuw ontworpen om vreemde eiwitten (bijvoorbeeld FP's) uit te drukken en die s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells			Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel	Bio-Rad	45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter	Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System	Bio-Rad
Chloroform	MP	194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate	Bio-Rad	170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria	Lucigen	60602-2
Complete Protease Inhibitor	Pierce	A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips	MTC Bio	P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)	Quality Biological	115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Corning	35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal	Sigma-Aldrich	F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit	Sigma	NA0200-1KT
Geneticin (G-418)	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM met lage achtergrondfluorescentie
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated	Cell-Signaling Technology	7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum	Patton lab	lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum	Patton lab	lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated	KPL	5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated	Cell-Signaling Technology	7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit	JH Science	25235
Isopropyl alcohol	Macron	3032-02
L-glutamine Solution (100x)	Gibco	25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)	RPI research products	L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium	Hyclone	Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)	Lonza	04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer	ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%)	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x)	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel	Invitrogen	XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water	Invitrogen	10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit	Takara	740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable)	Fisher	12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep)	Corning	30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x	Fisher Bioreagents	BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Qiagen Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
SA11 pT7 Transcription Vectors	Addgene	89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins			Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose	Lonza	50000	Voor gelelektroforese
SeaPlaque agarose	Lonza	50100	Voor plaque-assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit	Invitrogen	12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit	Bio-Rad	170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System	Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent	Mirus	MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)	Bio-Rad	161-0772
Triton X 100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent	Ambion	15596026
Trypan blue	Corning	25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution	Quality Biological	118-087-721
Tryptose Phosphate Broth	Gibco	18050-039
Tween-20	VWR	0777-1L
Vertrel VF solvent	Zoro	G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager	Bio-Rad