Methodenartikel

Beheersing van elektrogesponnen polymeermorfologie voor weefselmanipulatie gedemonstreerd met behulp van hepG2-cellijn

DOI:

10.3791/61043

⸱

25 mei 2020

 ,  , 
1Institute for Bioengineering, School of Engineering, University of Edinburgh, 2Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode biedt de middelen om verschillende morfologieën en topografieën van polycaprolactonvezels te testen met het oog op weefselmanipulatie. Kleine en grote vezels worden vervaardigd met willekeurige oriëntaties, uitgelijnde oriëntaties en ook poreuze cryogeen elektrogesponnen structuren en gebruikt als platforms voor celcultuur.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrospinning biedt onderzoekers de mogelijkheid om reproduceerbare polymeervezels op micro- tot nanoschaal te fabriceren. De 3D vezelachtige architectuur van elektrogesponnen polymeren wordt beschouwd als een structurele imitatie van de extracellulaire matrix (ECM). Daarom zijn elektrogesponnen vezels vervaardigd uit biocompatibele polymeren op grote schaal onderzocht door onderzoekers op het gebied van weefselmanipulatie vanwege hun potentiële rol als kunstmatige ECM voor het begeleiden van weefselgroei, zowel in vitro als in vivo. Alle cellen zijn acuut gevoelig voor hun mechanische omgeving. Dit is aangetoond door de ontdekking van meerdere mechanotransductieroutes die intrinsiek verbonden zijn met de actinefilamenten van het cytoskelet. Het cytoskelet fungeert als een mechanische sensor die de functionaliteit en differentiatie van de gastheercel kan sturen, afhankelijk van de stijfheid en morfologie van het substraat. Elektrogesponnen vezels kunnen zowel qua vezelgrootte als qua morfologie worden afgesteld om de mechanische omgeving in een vezelachtige polymeersteiger gemakkelijk te moduleren. Hier worden methoden beschreven voor het elektrospinnen van polycaprolacton (PCL) voor drie verschillende morfologieën bij twee verschillende vezeldiameters. De morfologische vezelcategorieën bestaan uit willekeurig georiënteerde vezels, uitgelijnde vezels en poreuze cryogeen gesponnen vezels, met diameters van 1 μm en 5 μm. De methoden die in deze studie worden beschreven, worden voorgesteld als een platform voor het onderzoeken van het effect van elektrogesponnen vezelarchitectuur op weefselgeneratie. Door deze effecten te begrijpen, kunnen onderzoekers de mechanische eigenschappen van elektrogesponnen vezels optimaliseren en het potentieel van deze technologie grondiger demonstreren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselmanipulatiemethoden hebben zich de afgelopen decennia ontwikkeld om cellen een biomimetische omgeving te bieden om succesvolle weefselregeneratie aan te moedigen, zowel voor in vitro weefselmodellen als voor in vivo regeneratieve technieken. Deze methoden moedigen cellen doorgaans aan om 3D-aggregaten te vormen, hetzij zelf, hetzij met behulp van een geleidingssteiger1. Steigers kunnen worden vervaardigd als poreuze of vezelachtige polymeer nano-/microstructuren, of als sterk waterabsorberende hydrogels 2,3,4. Polymeerelektrospinnen is een veelgebruikte fabricagetechniek die ongeweven polymeervezelmatrices op nanomicroschaal oplevert die de vezelachtige architectuur van de oorspronkelijke extracellulaire matrix (ECM) kunnen nabootsen5. Meerdere biocompatibele polymeren zijn van toepassing op het elektrospinproces; Daarom zijn elektrosponnen vezels een populair medium om weefselregeneratie te vergemakkelijken 6,7,8. Elektrogesponnen vezels zijn gebruikt in de kweek van een reeks weefsels, wat een veelbelovende weg aantoont voor goedkope en reproduceerbare steigerplatforms 9,10,11,12,13.

Cellen hebben een acute gevoeligheid voor hun mechanische omgeving. Eerder onderzoek heeft deze belangrijke relatie benadrukt, mechanotransductie genaamd, die de celfunctie, morfologie en differentiatie kan beïnvloeden14,15. De basis van het eukaryote cellulaire cytoskelet is opgebouwd uit filamenteuze actine en speelt een belangrijke mechanische rol bij cellulaire deling, adhesie, migratie, contractie en morfologie. Het wordt gemanipuleerd door externe mechanische stimuli via verbinding met extracellulaire oppervlakte-eiwitten 16,17,18. Morfologische invloed op stamceldifferentiatie is in tal van onderzoeken aangetoond door de vorm van een hechtbaar substraat te veranderen, dat vervolgens in staat is om de celvorm te controleren en het differentiatieproces te sturen19,20. Bovendien beïnvloedt de stijfheid van het substraat waarop cellen zich hechten ook het lot en de afstamming van stamcellen21,22. Afgezien van stamcellen, is ook waargenomen dat deze effecten cellen van verschillende afstammingslijnen beïnvloeden23,24. Driedimensionale weefselmanipulatiemethoden hebben resultaten opgeleverd die vergelijkbaar zijn met die in 2D-mechanotransductiestudies met zowel hydrogels als fibrillaire steigers 25,26,27. Verder wordt de substraatmechanica gecommuniceerd via 3D-celaggregaten via cel-celsignalering28. Materiaalmechanica speelt een cruciale rol bij het sturen van cellulaire functionaliteit en zou daarom een belangrijke factor moeten zijn bij het ontwerp van steigers voor gemanipuleerde weefsels.

Het doel van deze methode is om de effecten van elektrogesponnen polycaprolacton (PCL) vezelgrootte en morfologie op in vitro celculturen te begrijpen. De methode is een bewerking van eerder onderzoek gericht op nierweefselmanipulatie9. Hier wordt een meer gedetailleerd stapsgewijs protocol aangeboden om de reconstructie van steigers te vergemakkelijken en een gestandaardiseerde methode te ontwikkelen die van toepassing is op alle celtypen. Met deze methode werden zes groepen steigers geconstrueerd: drie zijn grote 5 μm-vezels (LG) en de andere drie kleine 1 μm-vezels (SM), met verschillende PCL-concentraties. Binnen deze LG- en SM-groepen zijn er drie verschillende morfologische constructies: willekeurige vezels (RA), uitgelijnde vezels (AL) en poreuze cryogene vezels (CR). Deze steigergroepen hebben allemaal inherent verschillende structuren en leveren dus unieke lokale mechanische omgevingen waarop cellen zich hechten. Om het morfologische effect hiervan op cellen aan te tonen, werd de hepG2-cellijn als een representatieve studie op elke groep steigers gezaaid. Deze methode wordt aangeboden als een basisanalyse voor het ontwerp van elektrogesponnen steigers voor alle celtypen, van stamcellen tot cellijnen en primaire cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de oplossing

  1. Grote (willekeurige, uitgelijnde en cryogene) vezels
    1. Bereid een verhouding van 5:1 chloroform en methanol voor door 50 ml chloroform en 10 ml methanol te mengen in een glazen fles die bestand is tegen oplosmiddelen met behulp van een serologische pipet op glas.
      LET OP: Chloroform en methanol zijn giftige oplosmiddelen en het mengen moet plaatsvinden in een zuurkast.
    2. Om een 19 w/v% oplossing van PCL in 5:1 chloroform:methanol te maken, weegt u 1,9 g PCL af en voegt u toe aan 10 ml 5:1 chloroform:methanol in een glazen injectieflacon die bestand is tegen oplosmiddelen. Sluit de injectieflacon dubbel af met paraffinefilm en laat de injectieflacon een nacht op een roller staan om de PCL volledig te laten oplossen.
      LET OP: Het mengen moet plaatsvinden in een zuurkast.
  2. Kleine (willekeurige en uitgelijnde) vezels
    1. Om een 7 w/v% oplossing van PCL in hexafluorisopropanol (HFIP) te bereiden, weegt u 0,7 g PCL af en mengt u met 10 ml HFIP in een glazen injectieflacon die bestand is tegen oplosmiddelen. Sluit de injectieflacon dubbel af met paraffinefilm en laat deze een nacht op een roller staan om de PCL volledig op te lossen.
      LET OP: HFIP is zeer giftig en het mengen moet plaatsvinden in een zuurkast.
  3. Kleine cryogene vezels
    LET OP: Het mengen moet plaatsvinden in een zuurkast.
    1. Bereid een verhouding van 3:1 chloroform en methanol voor door 30 ml chloroform en 10 ml methanol te mengen in een glazen fles die bestand is tegen oplosmiddelen met behulp van een serologische pipet op glas.
    2. Om een 14 w/v% oplossing van PCL in 3:1 chloroform:methanol te maken, weegt u 1,4 g PCL af en voegt u toe aan 10 ml 3:1 chloroform:methanol in een glazen injectieflacon die bestand is tegen oplosmiddelen. Sluit de injectieflacon dubbel af met paraffinefilm en laat deze een nacht op een roller staan om de PCL volledig op te lossen.

2. Electrospinning opstelling

OPMERKING: De parameters moeten worden ingesteld voordat met het elektrospinnen wordt begonnen.

  1. Naalddikte en plaatsing
    1. Gebruik voor grote vezels (willekeurig, uitgelijnd en cryogeen) een messing naald met een diameter van 1 mm / 0,8 mm ID en plaats de naald op 230 mm afstand van het oppervlak van de doorn.
    2. Gebruik voor kleine vezels een messing naald met een diameter van 1 mm / 0,4 mm ID en plaats de naald op 15 mm afstand van het oppervlak van de doorn.
  2. Zijwaartse naaldbeweging
    OPMERKING: De steigers in figuur 1 zijn vervaardigd met een naaldtraverse van 100 mm met een snelheid van 50 mm/s, met herhaalde bewegingen naar links en rechts gedurende het hele proces.
    1. Als u de zijwaartse beweging wilt instellen, drukt u op Beweging | TNS 1 en stel Startpositie [mm] in op -50, Afstand [mm] op 100, Snelheid [mm/s] op 50 en Draaivertraging [ms] op 750.
  3. Debiet van de spuitpomp
    1. Voor grote vezels (willekeurig, uitgelijnd en cryogeen) drukt u op het tabblad Materiaal op de gebruikersinterface en stelt u de spuitpomp in op 4 ml/u.
    2. Voor kleine (willekeurige en uitgelijnde) vezels stelt u de spuitpomp in op 0,8 ml/u.
    3. Voor kleine cryogene vezels stelt u de spuitpomp in op 2,5 ml/uur.
  4. Voltage instellingen
    1. Stel voor de grote vezels de naald in voltage op +15 kV en de doorn voltage op -4 kV door op het tabblad Voltage op de gebruikersinterface te drukken en de positieve en negatieve voltage waarden.
    2. Voor de kleine (willekeurig en uitgelijnde) vezels stelt u de naaldspanning in op +17 kV en de doornspanning op -4 kV.
    3. Stel voor de kleine cryogene vezels de naaldspanning in op +18 kV en de doornspanning op -4 kV.
  5. Doornrotatie (grote en kleine vezels)
    1. Voor willekeurige vezels drukt u op Beweging | Richt en stel de rotatiesnelheid van de doorn in op 250 tpm.
    2. Stel voor uitgelijnde vezels de rotatiesnelheid van de doorn in op 1.800 tpm.
    3. Stel voor cryogene vezels de rotatiesnelheid van de doorn in op 180 tpm.

3. Elektrospinnen van willekeurige en uitgelijnde vezels (grote en kleine vezels)

  1. Steek de naald (zie paragraaf 2.1 voor informatie over naaldmaat en plaatsing) in de PTFE-slang met een boring van 1 mm en zet deze vast in de naaldhouder van de elektrospinner.
  2. Breng onder een zuurkast de 10 ml polymeeroplossing over in een spuit van polypropyleen of glas (oplosmiddelbestendig). Zorg ervoor dat u eventuele luchtbellen verwijdert door de spuit te laten staan voordat u hem vult.
  3. Sluit de spuit via de PTFE-slang aan op de naald en zet de spuit vast in de spuitpomp. Eenmaal aangesloten, vult u de PTFE-slang aan door in de zuiger van de spuit te knijpen en de buis te vullen met polymeeroplossing.
  4. Wikkel de doorn in aluminiumfolie en bevestig deze op de doornrotatie-inrichting.
  5. Schakel de rotatie van de doorn in door op Motion | Doel | Draai en de spuitpomp door op Materiaal | Start pomp 1.
  6. Wanneer zich aan het uiteinde van de naald een klein polymeerdruppeltje heeft gevormd, schakelt u de voltage in door op ACTIVATE HIGH VOLTAGE te drukken. Een straal polymeer moet dan worden uitgezonden door een conisch uitsteeksel van polymeeroplossing, de Taylor-kegel genaamd. Controleer de doorn om de vezelafzetting op het oppervlak van de doorn te bevestigen.
  7. Voer het elektrospinnenproces uit totdat de gewenste hoeveelheid PCL-oplossing is geëlektroscentrifugeerd.
    OPMERKING: Voor de scaffolds die in figuur 1 worden weergegeven, werd 4 ml oplossing elektrospunen.
  8. Zodra het elektrospinnen is geëindigd, verwijdert u de aluminiumfolie bedekt met de vezel van de doorn en laat u deze een nacht in een zuurkast staan om overtollige verdamping van het oplosmiddel mogelijk te maken.
  9. Bewaar de vezels na verdamping bij kamertemperatuur (RT).

4. Elektrospinnen van cryogene vezels

  1. Gebruik voor cryogene elektrospinning de cryo-spinning doorn. Herhaal de stappen 3.1-3.3 en ga vervolgens verder met de volgende stappen.
  2. Wikkel de doorn in aluminiumfolie.
  3. Vul de doorn met droogijspellets. Bevestig het deksel van de cryo-draaiende doorn op de doorn om ervoor te zorgen dat droogijs niet uit de doorn kan ontsnappen, maar wel uit druk. IJskristallen zouden zich vrijwel onmiddellijk op het oppervlak van de doorn moeten vormen.
    LET OP: Gebruik beschermende handschoenen bij het hanteren van droogijs om koude brandwonden te voorkomen.
  4. Bevestig de doorn op de doornrotatie-inrichting en schakel de doornrotatie onmiddellijk in door op Motion | Doel | Draai en de spuitpomp door op Materiaal | Start pomp 1.
  5. Zodra zich aan het uiteinde van de naald een polymeerdruppel heeft gevormd, schakelt u de spanning in door op ACTIVATE HIGH VOLTAGE te drukken. Een straal polymeer moet dan worden uitgezonden door een conisch uitsteeksel van polymeeroplossing (d.w.z. de Taylor-kegel). Controleer de doorn om de vezelafzetting op het oppervlak van de doorn te bevestigen.
  6. Pauzeer na 1 uur elektrospinnen het proces door op STOP ALL te drukken en vul de doorn bij met droogijs. Zorg voor voldoende bescherming tegen oplosmiddeldamp tijdens het bijvullen van de doorn. Voer dit in totaal 3x uit gedurende in totaal 4 uur elektrospinning.
    OPMERKING: Het elektrospinnen kan worden hervat door stap 4.4 en 4.5 te herhalen.
  7. Zodra het elektrospinnen is afgelopen, verwijdert u de doorn voorzichtig en plaatst u deze onmiddellijk 24 uur in een vriesdroger om de ijskristallen op het oppervlak van de doorn te sublimeren.
  8. Verwijder na sublimatie de met vezels bedekte folie van de doorn en bewaar deze bij RT, zorg ervoor dat deze niet wordt geplet.

5. Ponsen van steigers

  1. Pons steigers uit het vel vezels met behulp van een biopsiepons van 10-12 mm. Als de vezels aan de aluminiumfolie blijven kleven, plaats de steigers dan in 70% ethanol om het losraken te vergemakkelijken.

6. Sterilisatie en plasmacoating

  1. Plaats de steigers (1 steiger per putje) in een plaat met 24 of 48 putjes en was ze 3x in 70% ethanol. Laat ondergedompeld in de laatste was, plaats in een vriezer van -80 °C en laat invriezen.
  2. Eenmaal ingevroren, plaatst u de plaat in een vriesdroger en vriesdroogt u deze gedurende 24 uur. De gedroogde steigers kunnen nu worden geplasmacoat.
    OPMERKING: Als er geen toegang is tot een plasmacoater, dompel de scaffolds dan onder in 1% antibioticum-antimycoticum (Anti-Anti) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat ze een nacht incuberen bij 37 °C.
  3. Plaats de plaat in de plasmakamer en verwijder het deksel. Laat de plasmacoater 30 s draaien op 500 mTorr en gemiddeld radiofrequentie (RF) vermogen.
  4. Dompel de scaffolds na het plasmacoaten onder in 1 ml PBS en 1% Anti-Anti. De steigers moeten de PBS-oplossing gemakkelijk absorberen.
    OPMERKING: De steigers zijn nu klaar om met cellen te worden bezaaid.

7. Voorbereiding en zaaien van cellen

OPMERKING: De onderstaande basiscelkweektechniek is voor de hepg2-cellen die worden gebruikt voor demonstratiedoeleinden in de representatieve resultaten. Deze principes kunnen worden toegepast op elk aanhangend celtype; Verschillende cellen kunnen echter verschillende materialen en verschillende processen vereisen. De behandeling van de cellen moet plaatsvinden in een biologische veiligheidskast, volgens een aseptische techniek.

  1. Neem 1 x 106 gecryopreserveerde hepg2-cellen en zaad in een T75-celkweekkolf met 12 ml complete media bestaande uit Eagle's minimum essential media (EMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 E/ml penicilline-streptomycine, 5 mM L-glutamine en 1% niet-essentiële aminozuren.
  2. Zodra de cellen voor 80% samenvloeien, maakt u de cellen los van de kweekkolf door 3x te wassen in PBS en gedurende 4 minuten 2 ml trypsine bij 37 °C te incuberen. Nadat op de kolf is getikt, moeten de cellen loskomen.
  3. Deactiveer de trypsine door 8 ml volledige media toe te voegen. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en draai de cellen in een centrifuge bij 120 x g gedurende 5 minuten naar beneden.
  4. Verwijder het bovenstaande boven de celpellet met een aanzuigpipet en vervang het door 5 ml volledige media. Resuspendeer de cellen door op en neer te pipetteren met een serologische pipet van 5 ml.
  5. Tel de resulterende celsuspensie via de trypan blue-uitsluitingsmethode. Neem 100 μL celsuspensie en voeg toe aan 100 μL trypan blauw in een injectieflacon van 1,5 ml. Breng het mengsel onder een glazen dekglaasje op een hemocytometer en tel de cellen onder een microscoop.
  6. Pas de celconcentratie aan op 2,6 x 106 cellen/ml door volledige media toe te voegen of te verwijderen. Om media te verwijderen, centrifugeert u de cellen gedurende 5 minuten op 220 x g , verwijdert u de benodigde media en brengt u de cellen opnieuw in suspensie.
  7. Zuig de 1% Anti-Anti in PBS op van de putplaat en zaai 50 μL 2,6 x 106 cellen/ml celsuspensie op het oppervlak van de steiger met behulp van een pipet van 200 μL.
  8. Laat de cellen tijdens incubatie bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1-3 uur hechten en zorg ervoor dat ze niet uitdrogen. Eenmaal bevestigd, voeg 300 μl (voor een plaat met 48 putjes) of 500 μl (voor een plaat met 24 putjes) kweekmedia toe en incubeer bij 37 °C en 5 % CO2.
    OPMERKING: Standaard celkweektechnieken kunnen vanaf hier worden gebruikt tot verdere functionele analyse.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van zowel kleine (~1 μm) als grote vezels (~5 μm) vervaardigd uit PCL-oplossingen. De vezels werden gedurende 30 s met een sputtercoating bedekt met goud-palladium (60:40) met behulp van een sputter coater voorafgaand aan SEM-beeldvorming. Grote vezels werden geproduceerd met behulp van een hoge PCL-concentratie van 19 w/v% in een 5:1-oplossing van chloroform en methanol om een PCL-oplossing met hoge viscositeit te creëren. Deze oplossing met hoge viscositeit werd vervolgens met een hoog debiet elektrosponnen om een grote draad polymeeroplossing in het elektrische veld uit te zenden. Daarom was een grote afstand van 230 mm tussen de naald en de doorn nodig om een effectieve verdamping van het oplosmiddel te garanderen voordat het op de doorn werd afgezet. Omgekeerd werden kleinere vezels geproduceerd met een lage PCL-concentratie van 7 w/v% in HFIP om een PCL-oplossing met een lage viscositeit te creëren. Het elektrospinnen van de PCL-oplossing met lage viscositeit bij een laag debiet zorgde ervoor dat een dunnere draad PCL-oplossing werd uitgestoten door de naald in het elektrische veld. De dunnere draad zorgde voor een snellere verdamping van het oplosmiddel en de naald moest met 70 mm dichter bij de doorn zitten om een stabiele afzetting van vezels te garanderen. Voor het elektrospinnen van kleine cryogene vezels was het aanpassen van de PCL-oplossing nodig om een betrouwbaar protocol te bereiken. PCL in HFIP-elektrogesponnen op de cryogene doorn resulteerde herhaaldelijk in een gedesintegreerde vezelstructuur. Het elektrospinnen van een PCL-concentratie van 14 w/v% in 3:1 chloroform-methanol loste dit probleem op; Dit zorgde echter voor een grotere variatie in vezelgrootte door de hele steiger. De mate van vezeluitlijning (vezelstraal en -oriëntatie) voor elke steiger werd geanalyseerd via de ImageJ DiameterJ-plug-in29 en weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3.

figure-results-1
Figuur 1: SEM-beelden die de morfologische kwaliteiten van elke steigergroep tonen. De bovenste rij toont de kleine vezels en de onderste rij de grote vezels. Morfologische groepen worden van links naar rechts weergegeven als respectievelijk willekeurige vezels, uitgelijnde vezels en cryogene vezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Gegevens over de vezelstraal (links) en de vezeloriëntatie (rechts) van de DiameterJ-plug-in voor de kleine set vezels. Morfologie vermeld van boven naar beneden als respectievelijk willekeurige vezels, uitgelijnde vezels en cryogene vezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Gegevens over de vezelstraal (links) en de vezeloriëntatie (rechts) van de DiameterJ-plug-in voor de grote set vezels. Morfologie vermeld van boven naar beneden als respectievelijk willekeurige vezels, uitgelijnde vezels en cryogene vezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze methode bood ons een set steigers met zes duidelijk verschillende trekeigenschappen, zoals bepaald met behulp van een trekbank volgens de eerder beschreven methode9. Zoals te zien is in tabel 1 , variëren de Moduli van Youngs op macroschaal van 46,94 ± 3,48 MPa in de grote uitgelijnde vezels tot 0,20 ± 0,01 MPa in de grote cryogene vezels. Fysiologische weefselstijfheidswaarden variëren van 100 Pa (neuraal weefsel) tot 2-4 GPa (botweefsel)30; Alle hier gerapporteerde stijfheidswaarden van de steiger lagen binnen dit bereik.

SchavotYoungs' modulus (MPa) voor rek%
0–2%2–4%4–6%6–8%8–10%
SM. RA11.14 ± 2.139,31 ± 0,436,75 ± 0,644,75 ± 0,593,32 ± 0,40
SM. AL27,94 ± 8,6328.27 ± 7.36 uur16.34 ± 4.879.10 ± 3.755,85 ± 3,11
SM. CR0,27 ± 0,110,31 ± 0,440,31 ± 0,650,29 ± 0,590,26 ± 0,40
LG. RA9,23 ± 0,788,22 ± 0,875,96 ± 0,683,96 ± 0,592,63 ± 0,45
LG. AL46,94 ± 3,4838.03 ± 2.4627.69 ± 1.2216.10 ± 1.617,87 ± 1,32
LG. CR0,20 ± 0,010,16 ± 0,010,12 ± 0,010,10 ± 0,010,09 ± 0,01

Tabel 1: Gegevens van trekproeven voor elke steigergroep met intervallen van 2% rek. SM. RK = Klein willekeurig, SM. AL = Klein uitgelijnd, SM. CR = Klein cryogeen, LG. RA = Groot willekeurig, LG. AL = Groot uitgelijnd en LG. CR = Groot cryogeen. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 5.

Figuur 4 toont de DAPI- en falloïdinekleuring die wordt gebruikt om de cellulaire morfologie te visualiseren. De gebruikte kleuringsmethode is vastgesteld in de literatuur11,12. Beelden werden verkregen met behulp van een microscoop (Table of Materials) met een object met een vergroting van 40x. De afbeeldingen laten zien dat de uitgelijnde vezels die met deze methode werden geproduceerd, de morfologie van de hepG2-cel verlengden en prolifererende cellen over de lengte van de vezels leidden, waardoor directionaliteit binnen de celcultuur ontstond. Daarentegen vertoonden de hepG2-cellen op willekeurige vezels niet de directionele proliferatie en rek die werd waargenomen in de uitgelijnde structuren. Op de willekeurige structuren vertoonden de hepG2-cellen een meer regelmatige morfologie met uitgebreide uitsteeksels die zich hechtten aan de omringende PCL-vezels.

figure-results-4
Figuur 4: DAPI (blauw) en phalloidine (groen) gekleurde hepG2-cellen op de verschillende scaffold-morfologieën: willekeurig (links), uitgelijnd (midden) en cryogeen (rechts). De bovenste rij toont kleine vezels en de onderste rij toont grote vezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het creëren van verschillende vezelgroottes werd bereikt met behulp van een combinatie van verschillende oplosmiddelen, PCL-concentraties en elektrospinparameters. Het type polymeer, het molecuulgewicht en het oplosmiddel hebben een sterke invloed op de viscositeit en ladingseigenschappen van de resulterende oplossing en hebben daarom een sterke invloed op de elektrospineigenschappen31. De voltages die bij deze methode worden weergegeven, kunnen veranderen op basis van de omstandigheden waarin het elektrospinnen wordt uitgevoerd. Temperatuur en vochtigheid beïnvloeden het gedrag van het elektrospinproces32. Daarom wordt de lezer geadviseerd bereid te zijn om de spanning te veranderen om eventuele hindernissen tegen te gaan en een stabiele Taylor-conus te bereiken. Het wordt aanbevolen om de elektrospinner in een behuizing voor omgevingscontrole te plaatsen om de variabiliteit van batch tot batch in het elektrospinproces te verminderen.

Het bereiken van de verschillende morfologieën die in deze methode worden gepresenteerd, is mogelijk dankzij de mogelijkheden van het IME-elektrospinningapparaat. Een doorn met variabele snelheid is essentieel voor het regelen van de uitlijning van de vezel. Rotatie van de doorn bij een laag toerental (<250 tpm) levert willekeurig georiënteerde vezels op vanwege het gedrag van de polymeerstraal. Wanneer de geladen polymeeroplossing door de naald wordt uitgestoten, veroorzaken de interne ladingen en aerodynamische krachten een chaotisch zweepeffect dat wordt gebruikt om een chaotische rangschikking van vezels op de doorn33,34 neer te leggen. Dit zweepeffect kan worden overwonnen door de rotatiesnelheid van de doorn te verhogen tot boven 1.800 tpm. Vezels die op zo'n doorn met een hoog toerental zijn afgezet, vertonen een uitgelijnde structuur omdat de oppervlaktesnelheid voldoende is om elke dwarsbeweging van de opkloppende vezel effectief tegen te gaan. Het is belangrijk op te merken dat wanneer hoge doornsnelheden worden gebruikt, dit waarschijnlijk de omringende lucht verstoort, wat een nadelig effect kan hebben op de productie van een stabiele Taylor-kegel.

Zeer poreuze cryogene steigers worden geproduceerd door de doorn te vullen met droogijs bij -78,5 °C. Dit verlaagt de temperatuur van de doorn en bevordert condensatie en bevriezing van waterdruppels op het oppervlak. De gevormde kristallen vertonen pieken die uit het oppervlak van de doorn komen en de vezels worden door de pieken afgezet. Zodra de ijskristallen zijn gesublimeerd, blijft er een poreuze structuur van vezels achter op de doorn35,36. Het gewicht en de kwetsbaarheid van de kristallen beperken het vermogen om poreuze uitgelijnde vezels te creëren, aangezien te hoge doornsnelheden (>250 tpm) ertoe leiden dat de kristallen en vezels loskomen van de doorn als gevolg van overmatige middelpuntzoekende en aerodynamische krachten. Het is mogelijk om met deze methode problemen te ondervinden vanwege de kwetsbaarheid van de gevormde structuren. Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de doorn en ook bij het hanteren van de steigers daarna, omdat de structuren de neiging hebben om plat te worden wanneer ze worden ingedrukt en gevouwen bij het verwijderen van vloeistoffen. Er is ook de mogelijkheid dat oplossingen die succesvol elektrospinnen zonder de cryogene doorn dodelijk kunnen worden verstoord door de temperatuurverandering en de kristalstructuren. Bij cryo-spinning is de hoeveelheid ijs die op het oppervlak van de doorn wordt gevormd sterk afhankelijk van de vochtigheid, waardoor het eindresultaat varieert. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om het elektrospinproces in een milieucontrolebehuizing te houden.

Om de cellulaire prestaties op deze steigers te beoordelen, is het noodzakelijk om het materiaal vooraf te steriliseren. Er zijn veel opties beschikbaar voor het steriliseren van polymeren, waaronder chemische methoden, bestralingsmethoden en op warmte gebaseerde methoden37,38. Het is belangrijk om de effectiviteit van elke methode en de geschiktheid voor zowel het gebruik van het materiaal als voor het materiaal zelf te beoordelen. Dit protocol maakt gebruik van sterilisatie in 70% ethanol vóór lyofilisatie, plasmabehandeling en onderdompeling in 1% anti-anti-oplossing. Door het gebruik van ethanol kunnen eiwitten en micro-organismen worden gedenatureerd en gedehydrateerd, zonder het PCL-materiaal te verstoren37. Het gebruik van sterkere oplosmiddelen kan leiden tot het oplossen van de PCL. Plasmacoating werd in deze methode voornamelijk gebruikt om de hydrofiliciteit van PCL, die notoir hydrofoob is, te verhogen en de celhechting te verbeteren39,40. Handig is dat dit ook werkt als een secundaire sterilisatiestap, maar er moet voor worden gezorgd dat de steigers voor en na de plasmabehandeling in een steriele omgeving worden bewaard. Deze methode is geschikt gebleken voor in vitro studies met met antibiotica behandelde media. Voor in vivo toepassingen moeten echter robuustere opties zoals ethyleenoxide (EtO) en gammablootstelling worden overwogen. Nadat de sterilisatie is uitgevoerd, kunnen cellen op de steiger worden gezaaid en kunnen standaard celkweektechnieken worden toegepast om 3D-celculturen in vitro te vormen.

Het is belangrijk op te merken dat de stijfheidswaarden moeten worden toegeschreven aan de verschillende microstructuren die in de steigers worden gevormd. Het bulkmateriaal (PCL) blijft constant tussen de steigers. Daarom verandert de stijfheid van het bulkmateriaal niet tussen de groepen. De cryogene steigers vertonen een veel lagere stijfheid dan de andere groepen vanwege de verminderde connectiviteit binnen de vezelmatrix, zoals te zien is in Tabel 1. Aangenomen wordt dat de verminderde connectiviteit een meer buig-dominante vervorming induceert in tegenstelling tot rek-dominante vervorming binnen de fibreuze structuur41. Interessant is dat de stijfheid van de steiger niet sterk afhankelijk is van de vezelgrootte in de willekeurige en cryogene groepen. De longitudinale stijfheid van de uitgelijnde vezels vertoont echter een significant grotere afhankelijkheid van de vezelgrootte, waarbij de Youngs' Modulus bij 0-2% rek 27,94 ± 8,63 MPa is voor kleine vezels en 46,94 ± 3,48 MPa voor grote vezels. Vanwege het rekkarakter van de trektest impliceert dit een hogere bulk-PCL-dichtheid binnen de langsdoorsnede. Het is noodzakelijk om te herhalen dat de mechanische gegevens die hier worden gepresenteerd een mechanische momentopname op macroschaal zijn van de vezelachtige architecturen. Verdere micromechanische karakterisering zou nuttig zijn om de mechanische invloeden op de celschaal volledig te begrijpen.

Zowel willekeurige als uitgelijnde architecturen werden in deze methode opgenomen om een vergelijking te maken tussen isotrope en anisotrope morfologieën. De mate van vezeluitlijning kan worden waargenomen in de SEM-beelden in Figuur 2 en de vezelanalyses in Figuur 2 en Figuur 3. Anisotrope eigenschappen worden waargenomen in veel van de weefsels in het lichaam. Dit wordt met name vaak waargenomen in uitgelijnde cellulaire structuren zoals die in spier- en zenuwweefsels. Uitgelijnde polymere vezelstructuren bieden de mogelijkheid om deze uitgelijnde structuren in vitro te recapituleren42,43. Zoals eerder beschreven, is de celfunctie gevoelig voor morfologische en mechanische veranderingen, dus verdere functionele analyse moet worden uitgevoerd op steigergebonden cellen om de biologische invloed van elk type steiger te bepalen.

In vergelijking met andere bestaande technieken voor het vervaardigen van steigers, biedt deze methode een eenvoudige manier om steigerstructuren op microschaal te produceren met een relatief hoge controle over de mechanische eigenschappen en morfologie. Alternatieve fabricage van PCL-steigers, zoals fasescheiding, zoutuitloging en gasschuim, zorgen voor morfologische controle in termen van lege ruimte en poriegrootte. De porie- en structurele geometrie blijft echter grotendeels hetzelfde 44,45,46,47. Daarom kunnen eigenschappen zoals het niveau van isotropie niet zo gemakkelijk worden gewijzigd in vergelijking met elektrospinning. Hydrogelmaterialen, populair voor de productie van steigers, bieden de middelen om de stijfheid van het polymeersubstraat te veranderen door wijziging van het niveau van verknoopte polymeerketens48. Het is ook mogelijk om via verschillende methoden 3D-printen te maken, waardoor een uitstekende controle over de morfologie wordt geboden49. Het bereiken van elektrospinnende schaalresolutie in biocompatibele hydrogelmaterialen blijft echter een uitdaging die praktisch moet worden geïmplementeerd50,51. Elektrogesponnen steigers zijn de afgelopen tien jaar vaak gebruikt in onderzoek naar weefselmanipulatie en de introductie van nieuwe materialen en toepassingen met verschillende celtypen wordt altijd onderzocht. Hoewel er voortdurend nieuwe materialen in ontwikkeling zijn voor het elektrospinnen van steigers, blijven er mogelijkheden voor verdere biologische karakterisering van bestaande elektrospinmaterialen en -methoden. De beschreven methode wordt voorgesteld als een methode voor het vergemakkelijken van in vitro biologisch onderzoek, aangezien deze direct toepasbaar is op basistechnieken voor celcultuur.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Engineering and Physical Sciences Research Council Grant Ref: EP/N509644/1, de UKRMPII Grant Ref: MR/L022974/1 en de MRC CCBN Grant Ref: MR/L012766/1. De auteurs willen graag Dr. Alison McDonald en Dr. David Kelly (COIL) bedanken voor het assisteren bij en faciliteren van de microscopische beeldvorming en Prof. Alistair Elfick voor de toegang tot de laboratoriumfaciliteiten (Institute for Bioengineering).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mm biopsy punchAcudermP1025
15 mL Falcon tubeThermo-scientific339650
20 mL glass vialFisherbrand11513542
48 well cell culture plateGreiner Bio-one677180
Anti-Anti 100XGibco15240062
ChloroformAcros Organics13029236
DAPISigma-aldrichD9542
Eagles Minimum Essential MediaGibco11090081
ElectrospinnerIME TechnologiesEC-DIG
Fetal Bovine SerumGE HealthcareSH30071.03
Gold-Palladium Sputter coaterEmscopeSC500A
HepG2 cell lineSigma-aldrich85011430
Hexafluoroisopropanol (HFIP)Manchester OrganicsG26383
L-Glutamine 200 mMGibco25030081
MEM Non-essential Amino AcidsGibco11140050
MethanolAcros Organics11984591
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mLGibco15140122
PhalloidinAbcamab176754
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-aldrichP4417-100TAB
Plasma coaterHarrick PlasmaPDC-002
Polycaprolactone (Avg. MW 80,000)Sigma-aldrich440744
PTFE SyringeFisherbrand12941031
Scanning Electron MicroscopeHitachiS4700
T75 Culture FlaskCorningCLS430641
Trypan blue (0.4%)Gibco15250061

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akter, F. Principles of Tissue Engineering. Tissue Engineering Made Easy. Akter, F. , Academic Press. London, UK. 3-16 (2016).
  2. Van Vlierberghe, S., Dubruel, P., Schacht, E. Biopolymer-Based Hydrogels as Scaffolds for Tissue Engineering Applications: A Review. Biomacromolecules. 12 (5), 1387-1408 (2011).
  3. Murugan, R., Ramakrishna, S. Nano-featured scaffolds for tissue engineering: A review of spinning methodologies. Tissue Engineering. 12 (3), 435-447 (2006).
  4. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
  5. Jun, I., Han, H. S., Edwards, J. R., Jeon, H. Electrospun fibrous scaffolds for tissue engineering: Viewpoints on architecture and fabrication. International Journal of Molecular Sciences. 19 (3), E745(2018).
  6. Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  7. Grant, R., Hay, D. C., Callanan, A. A Drug-Induced Hybrid Electrospun Poly-Capro-Lactone: Cell-Derived Extracellular Matrix Scaffold for Liver Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 650-662 (2017).
  8. Munir, N., McDonald, A., Callanan, A. A combinatorial approach: Cryo-printing and electrospinning hybrid scaffolds for cartilage tissue engineering. Bioprinting. 16, e00056(2019).
  9. Burton, T. P., Corcoran, A., Callanan, A. The effect of electrospun polycaprolactone scaffold morphology on human kidney epithelial cells. Biomedical Materials. 13 (1), 015006(2018).
  10. Reid, J. A., Callanan, A. Influence of aorta extracellular matrix in electrospun polycaprolactone scaffolds. Journal of Applied Polymer Science. 136 (44), 48181(2019).
  11. Grant, R., Hallett, J., Forbes, S., Hay, D., Callanan, A. Blended electrospinning with human liver extracellular matrix for engineering new hepatic microenvironments. Scientific Reports. 9 (1), 6293(2019).
  12. Grant, R., Hay, D., Callanan, A. From scaffold to structure: The synthetic production of cell derived extracellular matrix for liver tissue engineering. Biomedical Physics and Engineering Express. 4 (6), 065015(2018).
  13. Reid, J. A., Callanan, A. Hybrid cardiovascular sourced extracellular matrix scaffolds as possible platforms for vascular tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 1-15 (2019).
  14. Chen, C. S. Mechanotransduction - A field pulling together? Journal of Cell Science. 121 (20), 3285-3292 (2008).
  15. Wang, N. Review of cellular mechanotransduction. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (23), 233002(2017).
  16. Fan, Y. L., Zhao, H. C., Li, B., Zhao, Z. L., Feng, X. Q. Mechanical Roles of F-Actin in the Differentiation of Stem Cells: A Review. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (8), 3788-3801 (2019).
  17. Davidson, A. J., Wood, W. Unravelling the Actin Cytoskeleton: A New Competitive Edge. Trends in Cell Biology. 26 (8), 569-576 (2016).
  18. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  19. Guvendiren, M., Burdick, J. A. The control of stem cell morphology and differentiation by hydrogel surface wrinkles. Biomaterials. 31 (25), 6511-6518 (2010).
  20. Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346(2010).
  21. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  22. Evans, N., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. European Cells and Materials. 18, 1-14 (2009).
  23. Stukel, J. M., Willits, R. K. Mechanotransduction of Neural Cells Through Cell-Substrate Interactions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), 173-182 (2016).
  24. Charbonier, F. W., Zamani, M., Huang, N. F. Endothelial Cell Mechanotransduction in the Dynamic Vascular Environment. Advanced Biosystems. 3 (2), 1800252(2019).
  25. Nyitray, C. E., Chavez, M. G., Desai, T. A. Compliant 3D Microenvironment Improves β-Cell Cluster Insulin Expression Through Mechanosensing and β-Catenin Signaling. Tissue Engineering Part A. 20 (13-14), 1888-1895 (2014).
  26. Baker, B. M., et al. Cell-mediated fiber recruitment drives extracellular matrix mechanosensing in engineered fibrillar microenvironments. Nature Materials. 14 (12), 1262-1268 (2015).
  27. Evans, N. D., Gentleman, E. The role of material structure and mechanical properties in cell-matrix interactions. Journal of Materials Chemistry B. 2 (17), 2345(2014).
  28. Tusan, C. G., et al. Collective Cell Behavior in Mechanosensing of Substrate Thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  29. Hotaling, N. A., Bharti, K., Kriel, H., Simon, C. G. DiameterJ: A validated open source nanofiber diameter measurement tool. Biomaterials. 61, 327-338 (2015).
  30. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. DMM Disease Models and Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  31. Haider, A., Haider, S., Kang, I. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arabian Journal of Chemistry. 11 (8), 1165-1188 (2018).
  32. De Vrieze, S., et al. The effect of temperature and humidity on electrospinning. Journal of Materials Science. 44 (5), 1357-1362 (2009).
  33. Hohman, M. M., Shin, M., Rutledge, G., Brenner, M. P. Electrospinning and electrically forced jets I. Stability theory. Physics of Fluids. 13 (8), 2201-2220 (2001).
  34. Yarin, A. L., Koombhongse, S., Reneker, D. H. Bending instability in electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Physics. 89 (5), 3018-3026 (2001).
  35. Feltz, K. P., Kalaf, E. A. G., Chen, C., Martin, R. S., Sell, S. A. A review of electrospinning manipulation techniques to direct fiber deposition and maximize pore size. Electrospinning. 1, 46-61 (2017).
  36. Simonet, M., Schneider, O. D., Neuenschwander, P., Stark, W. J. Ultraporous 3D polymer meshes by low-temperature electrospinning: Use of ice crystals as a removable void template. Polymer Engineering & Science. 47 (12), 2020-2026 (2007).
  37. Dai, Z., Ronholm, J., Tian, Y., Sethi, B., Cao, X. Sterilization techniques for biodegradable scaffolds in tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering. 7, 204173141664881(2016).
  38. Rogers, W. J. Sterilisation techniques for polymers. Sterilisation of Biomaterials and Medical Devices. Lerouge, S., Simmons, A. , Elsevier Science. Amsterdam, Netherlands. 151-211 (2012).
  39. Jokinen, V., Suvanto, P., Franssila, S. Oxygen and nitrogen plasma hydrophilization and hydrophobic recovery of polymers. Biomicrofluidics. 6 (1), 16501(2012).
  40. Recek, N., et al. Cell Adhesion on Polycaprolactone Modified by Plasma Treatment. International Journal of Polymer Science. 2016, 1-9 (2016).
  41. Fleck, N. A., Deshpande, V. S., Ashby, M. F. Micro-architectured materials: Past, present and future. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 466 (2121), 2495-2516 (2010).
  42. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85 (1), 149-156 (2011).
  43. Patel, K. H., et al. Aligned nanofibers of decellularized muscle ECM support myogenic activity in primary satellite cells in vitro. Biomedical Materials. 14 (3), 035010(2019).
  44. Wang, L., et al. Fabrication of open-porous PCL/PLA tissue engineering scaffolds and the relationship of foaming process, morphology, and mechanical behavior. Polymers for Advanced Technologies. 30 (10), 2539-2548 (2019).
  45. Sartore, L., Inverardi, N., Pandini, S., Bignotti, F., Chiellini, F. PLA/PCL-based foams as scaffolds for tissue engineering applications. Materials Today: Proceedings. 7, 410-417 (2019).
  46. Munir, N., Callanan, A. Novel phase separated polycaprolactone/collagen scaffolds for cartilage tissue engineering. Biomedical Materials (Bristol). 13 (5), 051001(2018).
  47. Wang, W., et al. Fabrication of heterogeneous porous bilayered nanofibrous vascular grafts by two-step phase separation technique. Acta Biomaterialia. 79, 168-181 (2018).
  48. Kim, C., et al. Stem Cell Mechanosensation on Gelatin Methacryloyl (GelMA) Stiffness Gradient Hydrogels. Annals of Biomedical Engineering. 48 (2), 893-902 (2019).
  49. Chen, Z., et al. 3D Printing of Multifunctional Hydrogels. Advanced Functional Materials. 29 (20), 1900971(2019).
  50. Lee, J. M., Ng, W. L., Yeong, W. Y. Resolution and shape in bioprinting: Strategizing towards complex tissue and organ printing. Applied Physics Reviews. 6, 011307(2019).
  51. Zimmermann, R., et al. High resolution bioprinting of multi-component hydrogels. Biofabrication. 11 (4), 045008(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Electrospun Polymer MorphologyTissue Engineering ScaffoldElectrospinning TechniqueFiber Diameter ControlPolymer Fiber AlignmentPorous Cryogenic SpinningHepG2 Cell LineMechanical Environment ModulationExtracellular Matrix MimicryScaffold Mechanical Properties
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen