Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) is een krachtige methode voor de biofysische karakterisering van enzym conformationele veranderingen en enzym-substraat interacties. Een van de vele voordelen, HDX-MS verbruikt slechts kleine hoeveelheden materiaal, kan worden uitgevoerd onder bijna inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van enzym / substraat etikettering, en kan ruimtelijk opgeloste informatie over enzym conformationele dynamiek - zelfs voor grote enzymen en multiproteïne complexen. De methode wordt geïnitieerd door de verdunning van het enzym van belang in de in D2O bereide buffer. Dit activeert de uitwisseling van protium in peptide bond amides (N-H) met deuterium (N-D). Op de gewenste uitwisselingstijdpunten worden reactie aliquots gedoofd, wordt het enzym geprotelyseerd tot peptiden, worden de peptiden gescheiden door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) en wordt de verandering in massa van elk peptide (als gevolg van de uitwisseling van waterstof voor deuterium) geregistreerd door MS. De hoeveelheid deuteriumopname door elk peptide is sterk afhankelijk van de lokale waterstofbindingsomgeving van dat peptide. Peptiden aanwezig in zeer dynamische gebieden van het enzym uitwisseling deuterium zeer snel, terwijl peptiden afgeleid van goed geordende regio's ondergaan uitwisseling veel langzamer. Op deze manier rapporteert de HDX-rate over lokale enzymconformatiedynamiek. Verstoringen van de deuteriumopnameniveaus in aanwezigheid van verschillende liganden kunnen vervolgens worden gebruikt om ligandbindende locaties in kaart te brengen, allosterische netwerken te identificeren en de rol van conformationele dynamiek in de enzymfunctie te begrijpen. Hier illustreren we hoe we HDX-MS hebben gebruikt om de biosynthese van een type peptide natuurlijke producten genaamd lanthipeptiden beter te begrijpen. Lanthipeptiden zijn genetisch gecodeerde peptiden die post-translationeel worden gewijzigd door grote, multifunctionele, conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele structurele biologiebenaderingen. HDX-MS biedt een ideaal en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van de mechanistische eigenschappen van dit soort enzymen.
Inleiding
Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden1. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, he....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van gedeutereerde reagentia en enzymvoorraadoplossingen
- Bereid reagentia die nodig zijn voor de HDX-reacties (inclusief eventuele buffers, zouten, substraten, liganden, enz.) voor als 100−200x geconcentreerde stamoplossingen in D2O (99,9% atoomfractie D). Bereid ten minste 50 ml buffervoorraadoplossing voor.
OPMERKING: Voor de karakterisering van HalM2 werden de volgende oplossingen voorbereid: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-buffer), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 en 500 mM AMPPNP. - Vries en lyofieleer de voorraadoplossingen voor droogheid.
- Re-dissolve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het is noodzakelijk om de kwaliteit van de proteolytische spijsvertering en de reproduceerbaarheid van de workflow voor elke set monsterinjecties te beoordelen. Dus, voorafgaand aan het uitvoeren van HDX-MS-assays, is het essentieel om effectieve voorwaarden vast te stellen voor de proteolyse van het eiwit van belang, voor de scheiding van peptiden met behulp van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en gasfase ionenmobiliteit, en voor de detectie van peptiden met behulp van MS. Hiertoe moeten eerst de referentiemonste.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De IN dit protocol gepresenteerde HDX-MS workflow biedt een opmerkelijk robuust platform voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van structureel dynamische elementen in eiwitten en voor het onderzoeken hoe deze dynamiek verandert als reactie op verstoring (ligandbinding, enzym mutagenese, etc.). HDX-MS heeft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere structurele biologiebenaderingen die vaak worden gebruikt om conformatiedynamiek te onderzoeken. Het meest in het bijzonder zijn slechts klein.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, het Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, de Canadian Foundation for Innovation en mcgill university start-up fondsen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| [glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugale filtratie-inrichting (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| acetonitril | Fisher | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| mierenzuur | Thermo Fisher | 28905 | |
| guanidine-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Magnesiumchloride | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| Kaliumchloride | BioBasic | PB0440 | |
| kaliumfosfaat | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP Hydrochloride | TRC Canada | T012500 | peptide werd op verzoek gesynthetiseerd |
| Naam van materiaal/apparatuur | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | versie 1.08 | |
| DynamX | Waters | versie 3.0 | |
| MassLynx | Waters | versie 4.1 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | versie 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrödinger | versie 2.2.2 | |
| Naam van materiaal/apparatuur | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| Instrument en apparatuur | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 analytische kolom | Waters | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-kolom | Waters | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-Class HDX-systeem | Waters | ||
| HDX Manager | Waters | ||
| microtip pH-elektrode | Thermo Fisher | 13-620-291 | |
| Waters Enzymate BEH-kolom of Pepsin-solumn | Waters | 186007233 | |
| Waters Synapt G2-Si | Waters |
Referenties
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
