Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61053

⸱

4 mei 2020

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

In dit artikel

Samenvatting

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Samenvatting

Waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) is een krachtige methode voor de biofysische karakterisering van enzym conformationele veranderingen en enzym-substraat interacties. Een van de vele voordelen, HDX-MS verbruikt slechts kleine hoeveelheden materiaal, kan worden uitgevoerd onder bijna inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van enzym / substraat etikettering, en kan ruimtelijk opgeloste informatie over enzym conformationele dynamiek - zelfs voor grote enzymen en multiproteïne complexen. De methode wordt geïnitieerd door de verdunning van het enzym van belang in de in D2O bereide buffer. Dit activeert de uitwisseling van protium in peptide bond amides (N-H) met deuterium (N-D). Op de gewenste uitwisselingstijdpunten worden reactie aliquots gedoofd, wordt het enzym geprotelyseerd tot peptiden, worden de peptiden gescheiden door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) en wordt de verandering in massa van elk peptide (als gevolg van de uitwisseling van waterstof voor deuterium) geregistreerd door MS. De hoeveelheid deuteriumopname door elk peptide is sterk afhankelijk van de lokale waterstofbindingsomgeving van dat peptide. Peptiden aanwezig in zeer dynamische gebieden van het enzym uitwisseling deuterium zeer snel, terwijl peptiden afgeleid van goed geordende regio's ondergaan uitwisseling veel langzamer. Op deze manier rapporteert de HDX-rate over lokale enzymconformatiedynamiek. Verstoringen van de deuteriumopnameniveaus in aanwezigheid van verschillende liganden kunnen vervolgens worden gebruikt om ligandbindende locaties in kaart te brengen, allosterische netwerken te identificeren en de rol van conformationele dynamiek in de enzymfunctie te begrijpen. Hier illustreren we hoe we HDX-MS hebben gebruikt om de biosynthese van een type peptide natuurlijke producten genaamd lanthipeptiden beter te begrijpen. Lanthipeptiden zijn genetisch gecodeerde peptiden die post-translationeel worden gewijzigd door grote, multifunctionele, conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele structurele biologiebenaderingen. HDX-MS biedt een ideaal en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van de mechanistische eigenschappen van dit soort enzymen.

Inleiding

Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden1. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, het afschermen van reactieve tussenproducten van de omgeving, of door het moduleren van de enzymfunctie via allosterische netwerken. Recente studies hebben ook aangetoond dat conformationele dynamica gedurende de gehele evolutie kan worden behouden en dat verstoringen van geconserveerde moleculaire bewegingen kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in substraatspecifiekheid en de opkomst van nieuwe enzymfuncties2,3.

In de afgelopen jaren is waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) snel naar voren gekomen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe eiwitconforme landschappen reageren op verstoringen zoals ligandbinding of mutagenese4,5,6,7. In een typisch HDX-MS-experiment(figuur 1)wordt een interessant eiwit in een buffer geplaatst die is bereid in D2O, waardoor protonen die oplosmiddelen kunnen worden uitgewisseld, worden vervangen door deuteria. De wisselkoers van de amidemoiety van de peptidebindingen hangt sterk af van de pH, de lokale aminozuursequentie en van de lokale structurele omgeving van de amide8. Amiden die zich bezighouden met waterstofbindingsinteracties (zoals die aanwezig zijn in α-helices en β-sheets) wisselen langzamer uit dan amides in ongestructureerde gebieden van het eiwit die worden blootgesteld aan bulkoplosmiddel. De omvang van de deuteriumopname is dus een weerspiegeling van de structuur van het enzym. Enzymen die conformationeel dynamisch zijn, of die structurele overgangen ondergaan bij ligandbinding, zouden naar verwachting een meetbare HDX-respons opleveren.

De mechanistische basis voor de trage wisselkoers van een gestructureerdeamide is weergegeven in figuur 25,8,9. Om HDX te ondergaan, moet het gestructureerde gebied eerst een uitgevouwen conformatie tijdelijk bemonsteren, zodat de oplosmiddelmoleculen die hdx-uitwisseling katalyseren via een specifiek zuur/base chemisch mechanisme, toegang hebben tot het verwisselbareamide. Uiteindelijk bepalen de relatieve omvang van de chemische wisselkoers (kchem) en de vouw - en vouwkoersen (kopen en ksluiten) de HDX-koers gemeten in het experiment5,8. Vanuit dit eenvoudige kinetische model is het duidelijk dat de mate van deuteriumopname de onderliggende conformationele dynamiek weerspiegelt (zoals gedefinieerd door kopen en kclose). De meeste HDX-MS-experimenten worden uitgevoerd in een bottom-up workflow waarbij, na de uitwisselingsreactie, het eiwit van belang wordt verteerd in peptiden en de deuteriumopname door elk peptide wordt gemeten als een toename van massa7. Op deze manier maakt HDX-MS het mogelijk om verstoringen van enzymconformatiedynamiek in kaart te brengen op de lokale ruimtelijke schaal van peptiden, waardoor de onderzoeker kan beoordelen hoe de verstoring de dynamiek in verschillende regio's van het enzym van belang verandert.

De voordelen van de HDX-MS-aanpak voor het ophelderen van de structurele dynamiek van eiwitten zijn talrijk. Ten eerste kan de methode worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden inheems eiwit of op eiwitcomplexen in systemen met quaternaire structuur10. Het is zelfs niet nodig dat het enzympreparaat dat in de test wordt gebruikt, sterk wordt gezuiverd11,12, zolang de bottom-up HDX-MS-workflow een voldoende aantal zelfverzekerd geïdentificeerde peptiden biedt die de eiwitsequentie van belang dekken. Bovendien kan HDX-MS informatie verstrekken over conformatiedynamiek onder bijna inheemse omstandigheden zonder dat locatiespecifieke eiwitetikettering nodig is, zoals zou worden gebruikt in fluorescentiestudies met één molecuul13, en er is geen groottelimiet voor het eiwit - of eiwitcomplex dat kan worden onderzocht (waardoor benaderingen zoals nucleaire magnetische resonantie [NMR] spectroscopie uitdagend zijn)7,14. Ten slotte kunnen tijd-opgeloste HDX-MS-methoden worden gebruikt om intrinsiek verstoorde eiwitten te bestuderen, die moeilijk te bestuderen zijn met röntgenkristallografie15,16,17,18. De belangrijkste beperking van HDX-MS is dat de gegevens een lage structurele resolutie hebben. HDX-MS-gegevens zijn nuttig om aan te geven waar de conformatiedynamiek verandert en om gekoppelde conformationele veranderingen te onthullen, maar ze geven vaak niet veel inzicht in het precieze moleculaire mechanisme dat de waargenomen verandering aanstuurt. Recente vooruitgang in de combinatie van elektronenafvangdissociatiemethoden met eiwit HDX-MS-gegevens heeft veelbelovend aangetoond voor het in kaart brengen van uitwisselingslocaties naar enkelvoudige aminozuurresiduen19, maar follow-up biochemische en structurele studies zijn nog steeds vaak nodig om duidelijkheid te verschaffen aan structurele modellen die worden doorgestuurd door HDX-MS-gegevens.

Hieronder wordt een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van een HDX-MS-test gepresenteerd20. De onderstaande monstervoorbereidingsprotocollen moeten algemeen toepasbaar zijn op elk eiwit dat een goede oplosbaarheid vertoont in waterige buffers. Er zijn meer gespecialiseerde monsterbereidingsmethoden en HDX-MS-workflows beschikbaar voor eiwitten dan in aanwezigheid van detergentia of fosfolipiden21,22,23,24. Instrumentele instellingen voor HDX-MS-gegevensverzameling worden beschreven voor een quadrupole-tijd-of-flight massaspectrometer met hoge resolutie gekoppeld aan een vloeistofchromatografiesysteem. Gegevens over vergelijkbare complexiteit en resolutie kunnen worden verzameld op een van een aantal in de handel verkrijgbare lc-ms-systemen (liquid chromatography-mass spectrometry). Belangrijke aspecten van de gegevensverwerking met behulp van een commercieel beschikbaar softwarepakket worden ook verstrekt. We presenteren ook richtlijnen voor het verzamelen en analyseren van gegevens die in overeenstemming zijn met aanbevelingen van de bredere HDX-MS-gemeenschap12. Het beschreven protocol wordt gebruikt om de dynamische structurele eigenschappen van HalM2 te bestuderen, een lanthipeptide synthetase dat de multistep rijping van een antimicrobieel peptide natuurlijk product katalyseert20. We illustreren hoe HDX-MS kan worden gebruikt om substraatbindingssites en allosterische eigenschappen te onthullen die eerdere karakterisering hebben ontweken. Verschillende andere protocollen inzake eiwit HDX-MS zijn de afgelopen jaren gepubliceerd25,26. Samen met het huidige werk moeten deze eerdere bijdragen de lezer enige flexibiliteit bieden in experimenteel ontwerp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van gedeutereerde reagentia en enzymvoorraadoplossingen

  1. Bereid reagentia die nodig zijn voor de HDX-reacties (inclusief eventuele buffers, zouten, substraten, liganden, enz.) voor als 100−200x geconcentreerde stamoplossingen in D2O (99,9% atoomfractie D). Bereid ten minste 50 ml buffervoorraadoplossing voor.
    OPMERKING: Voor de karakterisering van HalM2 werden de volgende oplossingen voorbereid: 500 mM MgCl2, 100 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-buffer), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 en 500 mM AMPPNP.
  2. Vries en lyofieleer de voorraadoplossingen voor droogheid.
  3. Re-dissolve in D2O, en herhaal lyophilization cyclus ten minste één extra keer om zoveel mogelijk van de verwisselbare protonen te vervangen door deuterons mogelijk.
  4. Pas de pD van de gedeutereerde HEPES-buffervoorraad aan op de gewenste waarde met geconcentreerde NaOD/DCl, rekening houdend met de volgende relatie27:
    figure-protocol-1
    OPMERKING: De amide HDX-snelheid is sterk afhankelijk van de pL van de oplossing (pL = pH of pD)5. Verschillende partijen buffervoorraadoplossingen moeten op dezelfde manier worden bereid, opgeslagen en gebruikt om een lichte pL-drift tussen experimenten te voorkomen.
  5. Bereken de hoeveelheid van elk reagens die nodig is voor een HDX-test van 300 μL en bewaar aliquots voor eenmalig gebruik bij -80 °C.
  6. Bereid een geconcentreerde enzymvoorraadoplossing (~100−200 μM) in geprotieerde enzymopslagbuffer met behulp van een centrifugaalfilter(tabel met materialen)of een gelijkwaardig apparaat.
    OPMERKING: De exacte buffer en centrifugaalfilter moleculaire gewicht cutoff zal afhangen van het eiwit / enzym van belang. HalM2 wordt opgeslagen in 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl en 10% glycerol. 10 kDa-filters werden gebruikt om het geconcentreerde enzym te bereiden.
  7. Aliquot het enzym in porties voor eenmalig gebruik en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Dit kan een stopplaats zijn. Alle in punt 1 beschreven voorraadoplossingen kunnen voorafgaand aan de HDX-reacties worden voorbereid. Bij opslag bij -80 °C zullen de meeste enzymen/gedeutereerde voorraadoplossingen vele maanden stabiel zijn.

2. Kalibratie van het HDX-blusvolume

  1. Bereid een HDX-reactie van 300 μL in D2O met behulp van de in rubriek 1 bereide gedeutereerde reagentia en geconcentreerde enzymvoorraden.
    1. Gebruik een uiteindelijke enzymconcentratie van 1−5 μM.
    2. Gebruik een laatste gedeutereerde HEPES-bufferconcentratie van ten minste 50−100 mM.
    3. Zorg ervoor dat de concentraties van andere componenten voldoende zijn om de gewenste enzymactiviteit/functie te behouden.
  2. Bereid 1 L HDX-blusoplossing (100 mM fosfaat, 0,8 M guanidine-HCl, pH 1,9). Invriezen en bewaren in zowel porties van 50 ml (voor langdurige voorraad) als porties van 1 ml (voor aliquots voor eenmalig gebruik).
    OPMERKING: De exacte samenstelling van de blusbuffer is afhankelijk van het enzym dat wordt gebruikt in de proteolysestap van de bottom-up HDX-MS-workflow (stap 3.3.3). De hier gegeven quench buffer is compatibel met pepsine, het meest gebruikte protease voor HDX-MS. Als een ander protease wordt gebruikt, neem dan contact op met de proteaseleverancier om buffercompatibiliteit te garanderen.
  3. Kalibreer het volume van de blusbuffer die nodig is om de uiteindelijke pL van het gedoofde HDX-reactiemengsel aan te passen aan een pH-meterwaarde van 2,3.
    OPMERKING: De oplosmiddel H/D-wisselkoers van de peptideamide N-H-binding is een pH-afhankelijk proces dat onderhevig is aan zowel zuur- als basekatalyse. De minimale wisselkoers vindt plaats bij een waarde van pH 2,5 (pH-meterwaarde = 2,3 voor een mengsel van 50:50 H2O:D2O). Een uiteindelijke pL-waarde in de buurt van 2,5 minimaliseert dus de uitwisseling van waterstofruggen die optreedt tijdens de bottom-up LC-MS-analyse, waardoor het deuteriumlabel in de peptiden behouden blijft.
    1. Meng 50 μL van het HDX-reactiemengsel uit stap 2.1 met 50 μL blusbuffer en meet de pL van het gedoofde mengsel met een microtipelektrode.
    2. Verhoog het volume van de blusoplossing indien nodig om de uiteindelijke pH-meterwaarde aan te passen tot een waarde van 2,3.
    3. Zodra het juiste blusvolume is bepaald, herhaalt u het blusproces meerdere keren met verse 50 μL aliquots uit de HDX-reactie (stap 2.1) om ervoor te zorgen dat een consistente uiteindelijke pL wordt bereikt na toevoeging van een vaste hoeveelheid blusbuffer.

3. Opstellen van referentievoorbeelden en optimalisatie van de bottom-up LC-MS workflow

  1. Bereid niet-gedeutereerde referentiemonsters voor het eiwit dat van belang is voor drievoud in buizen van 0,5 ml. Zorg ervoor dat de omstandigheden van het uiteindelijke reactiemengsel identiek zijn aan die welke worden gebruikt bij de authentieke HDX-reacties (stap 2.1), behalve dat de reacties in H2O worden bereid met behulp van reagensvoorraadoplossingen die ook in H2O zijn bereid.
  2. Blus de monsters zoals in stap 2.3 door het juiste volume blusbuffer toe te voegen om de uiteindelijke pH aan te passen aan 2,5. Vries de monsters in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C totdat ze klaar zijn voor analyse.
  3. Analyseer de geprotieerde enzymreferentiemonsters met behulp van een bottom-up LC-MS-workflow.
    OPMERKING: Voordat u deze stappen uitvoert, moet het LC-MS-systeem dat moet worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens correct worden gekalibreerd en klaar zijn voor gebruik. De timing en temperatuur van alle stappen in de bottom-up LC-MS-workflow moeten streng worden gecontroleerd om verschillen in ruguitwisseling tussen monsters te minimaliseren. Met de MS-instrumentatie die in dit protocol wordt gebruikt (Tabel met materialen En Ondersteunende informatie), kunnen de meeste stappen worden bediend via de instrumentsoftware. Om ervoor te zorgen dat nauwkeurige replica's worden gemaakt, wordt aanbevolen om zoveel mogelijk stappen in de werkstroom te automatiseren.
    1. Haal een individueel enzymreferentiemonster (bereid als in stap 3.2) uit de vriezer en ontdooi gedurende 1 minuut bij 37 °C in een waterbad.
    2. Injecteer op precies 2 minuten na het verwijderen van het monster uit de vriezer en ontdooien een 40 μL-gedeelte van het gedoofde referentiemonster in een ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) kolom (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) met een stationaire fase gefunctionaliseerd met pepsine (een zuurstabieal protease).
    3. Verteer het monster met een debiet van 100 μL/min gedurende 3 min bij 15 °C met 0,1% mierenzuur in H2O (pH = 2,5) als oplosmiddel.
    4. Verzamel de peptische peptiden terwijl ze uit de pepsinekolom op een C18-valkolom van 0,4 °C komen om de uitwisseling van de rug te minimaliseren.
    5. Geef de ontzoute peptische peptiden van de valkolom door aan een C18-analytische kolom (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) die bij 0,4 °C wordt gehouden en gebruikt voor de scheiding van de peptische peptiden.
      OPMERKING: Stappen 3.3.3−3.3.5 kunnen worden geautomatiseerd door bepaalde LC-MS-systemen die worden gebruikt voor hdx-MS-gegevensverzameling. Als alternatief kunnen deze stappen onafhankelijk worden uitgevoerd, rekening houdend met het feit dat de timing en temperatuur van elke stap zorgvuldig moeten worden gecontroleerd om een consistent lage ruguitwisseling te bereiken.
    6. Elute de C18 kolom met een acetonitril/water/0,1% mierenzuur oplosmiddel systeem. Optimaliseer de LC-gradiënt voor het eiwit van belang om de scheiding van en het behoud van het deuteriumlabel in de peptische peptiden te maximaliseren.
      OPMERKING: Details over verloop elutie vindt u in de ondersteunende informatie.
    7. Onderwerp de peptische digest aan elektrospray ionisatie (ESI) massaspectrometrie.
      OPMERKING: De bronomstandigheden in de ondersteunende informatie zorgen voor voldoende ionisatie voor de meeste peptische peptiden.
      1. Eenmaal geïoniseerd in het MS-instrument, voert u een ionenmobiliteitsscheiding in de gasfase uit met stikstof als buffergas om de piekcapaciteit van de methode te verbeteren.
      2. Na de ionenmobiliteitsscheiding worden de peptische peptideprecursoren onderworpen aan een MSE-workflow met afwisselende cycli van lage botsingsenergie (4 V) en hoge botsingsenergie (21−40 V).
        OPMERKING: De afwisselende lage en hoge botsingsenergieregimes maken het mogelijk om MS-gegevens (lage botsingsenergie) tegelijkertijd met MSMS-gegevens (hoge botsingsenergie) te verzamelen. Dit maakt op zijn beurt de tijdcorrelatie van precursorionen met hun respectieve fragmentionen mogelijk. Deze correlatie is essentieel voor een zekere identificatie van peptiden zoals beschreven in rubriek 4.
      3. Detecteer de peptideprecursor en fragmentionen met behulp van een massaanalysator met een oplossend vermogen van ten minste 20.000.
      4. Gelijktijdig met de gegevensverwerving, verwerven MS-gegevens voor een [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) externe standaard.
        OPMERKING: De MS-werkstroom die in stap 3.3.7 wordt beschreven, wordt een MSE-protocol genoemd. Volledige instrumentele instellingen voor een MSE-protocol dat geschikt is voor bottom-up HDX-MS zijn opgenomen in de ondersteunende informatie.
    8. Beoordeel de kwaliteit van de LC-MS data.
      OPMERKING: Met behulp van het hierboven beschreven protocol en de instrumentele instellingen in de ondersteunende informatiemoeten de referentiemonsters een totaal ionenchromatogram produceren met een maximale signaalintensiteit van ongeveer 1 x 108. Er moeten veel peptische peptiden eluting tussen 3−9 min (Figuur 3A−C).
    9. Injecteer 40 μL blanco monsters (0,1% mierenzuur in water) om de pepsine- en analytische C18-kolommen te reinigen.
      OPMERKING: Over het algemeen moeten 2−3 spaties voldoende zijn.
    10. Herhaal stap 3.3.1−3.3.9 voor elk van de drievoudsmonsters van referentie-eiwit.

4. Verwerking van de referentiegegevens en het definiëren van een peptidelijst

  1. Analyseer de ruwe MSE-gegevens (stap 3.3.7) met behulp van proteomics-software (Table of Materials). Navigeer met behulp van de proteomics-software naar Bibliotheken | Protein Sequence Databanks om de eiwitdatabase te definiëren door de aminozuursequentie van het eiwit van belang te importeren.
    OPMERKING: Het doel van deze stap is om de referentie-MS-gegevens te doorzoeken op peptische peptiden afgeleid van het eiwit van belang, en om de MSMS-gegevens (gelijktijdig verkregen met de MS-gegevens) te gebruiken om eventuele putatieve peptide-identificaties te valideren.
  2. Geef een naam aan de eiwitsequentie van belang. Importeer de eiwitsequentie (in FASTA-formaat). De software zal een in silico vertering van het database-eiwit uitvoeren om een lijst met peptiden te genereren die zullen worden gebruikt om de LC-MS-gegevens te doorzoeken.
  3. Definieer de verwerkingsparameters (onder het menu Bibliotheek). Selecteer Electrospray MSE als het type gegevensverwerving. Voer in het veld Lock Mass for Charge 2 785.8426 in voor de m/z voor het 2+ ion van [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) en klik op voltooien.
  4. Definieer de werkstroomparameters (onder het menu Bibliotheek).
    1. Selecteer Electrospray MSE voor het zoektype. Onder de workflow | Kop databasezoekquery selecteert u het database-eiwit dat is gemaakt in stap 4.2 in het veld Database.
    2. Wijzig Primair digestreagens in aspecifieke en wis het veld Vaste modificator-reagens door de Ctrl-knop ingedrukt te houden terwijl u op Carbamidomethyl Cklikt.
  5. Geef de uitvoermap op door naar opties | automatiseringsopstelling | Identiteit E. Vink de vakjes aan voor Apex 3D en Peptide 3D Output en Ion Accounting Output en geef de gewenste directory op.
  6. De referentievoorbeeldgegevens verwerken.
    1. Maak op de linker gereedschapsbalk van de proteomics platformwerkruimte een nieuwe plaat door met de rechtermuisknop op Microtiter Platete klikken. Markeer drie putten in de microtiterplaat (één voor elk referentiemonster dat in punt 3 wordt verzameld). Klik met de linkermuisknop in één put, houd ingedrukt en sleep naar drie putten.
    2. Klik met de rechtermuisknop en selecteer onbewerkte gegevens toevoegen. Navigeer in het venster dat wordt weergegeven naar de map met de drie referentiebestanden uit sectie 3 en selecteer ze tegelijkertijd.
    3. Klik op volgende en kies de verwerkingsparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.3. Klik op volgende en selecteer de workflowparameters die zijn gedefinieerd in stap 4.4. Klik vervolgens op voltooien.
  7. Zodra de onbewerkte gegevens, verwerkingsparameters en workflowparameters aan elke put op het bord zijn toegewezen, verschijnen de putten blauw. Selecteer de putten, klik met de rechtermuisknop en selecteer de nieuwste onbewerkte gegevens verwerken. Klik op de rechterbenedenhoek van het venster om de verwerking van de gegevens bij te houden. Zodra het bericht Geen taak meer hoeft uit te voeren, is de verwerking volledig voltooid.
  8. Nadat de gegevensverwerking is voltooid, worden de putten in de plaat groen. Klik met de rechtermuisknop op de putten en selecteer werkstroomresultaten weergeven. Voor elk referentiegegevensbestand wordt een afzonderlijk venster geopend.
  9. Inspecteer de gegevens om er zeker van te zijn dat de meeste MS-signalen in de referentiemonstergegevens met succes zijn toegewezen aan peptiden die zijn voorspeld door de in-silico-vergisting van het eiwit van belang. Overeenkomende peptiden worden blauw gekleurd in het uitgangsspectrum (figuur 4). Dubbelklik op het OK-filter en controleer of de procentuele dekking groter is dan 99%.
    OPMERKING: Bij de verwerking wordt de gegevensuitvoer automatisch opgeslagen met de bestandsextensie(raw_data_file_name_IA_final_peptide) in de map die is opgegeven in stap 4.5.
  10. Importeer de proteomics software output in de HDX-processing software (Table of Materials) voor extra drempels.
    1. Klik op Gegevens in de linkerhoek van het HDX-verwerkingssoftwarevenster. Klik op plgs-resultaten importeren en klik op het pictogram toevoegen. Kies de verwerkte gegevensbestanden uit stap 4.9 door naar de juiste map te navigeren.
    2. Klik op Volgende en geef de volgende parameters op: minimale opeenvolgende ionen ≥ 2, massafout = 5 ppm en bestandsdrempel = 3. Klik op voltooien.
  11. Zodra u tevreden bent met de drempelparameters, slaat u het HDX-project op. Alle HDX-gegevens worden in dit project geïmporteerd voor analyse en weergave.
    OPMERKING: De in de volgende sectie beschreven deuterium uitgewisselde monsters moeten worden verwerkt met een identieke LC-MS-workflow. Voordat u doorgaat met HDX-test (rubriek 5), moet u er daarom voor zorgen dat het monstervoorbereiding (punt 2), de bottom-up LC-MS-workflow (sectie 3) en de gegevensverwerkingsworkflows (sectie 4) de gewenste reproduceerbaarheid en sequentiedekking van het doeleiwit bieden. Als een van deze processen moet worden gewijzigd om de dekking te verbeteren, wordt geadviseerd om terug te keren naar stap 2.1, nieuwe referentiemonsters in drievoud te bereiden en sectie 2−4 te herhalen (terwijl de nodige aanpassingen aan het protocol worden aangebracht) om ervoor te zorgen dat elk peptide reproduceerbaar kan worden gegenereerd en gedetecteerd.

5. HDX-reacties uitvoeren

  1. Bereid de werkruimte voor op HDX-reacties.
    1. Pre-aliquot blusbuffer in goed gelabelde buizen van 0,5 ml. Bereid een andere buis voor op elk tijdspunt, elke replica en elke biochemische toestand die moet worden geanalyseerd. Gebruik het juiste volume blusbuffer vanaf stap 2.2 dat nodig is om de uiteindelijke pH-meterwaarde van een 50 μL-gedeelte van de HDX-reactie aan te passen op een waarde van 2,3.
    2. Centrifugeer kort de 0,5 ml kuipen om alle blusbuffer naar de bodem van de buis over te brengen. Leg de buizen op ijs.
    3. Vul een kleine Dewar met vloeibare stikstof en blijf naast de werkruimte.
  2. Bereid de HDX-reacties voor. Zorg ervoor dat er voldoende reactievolume is om het gewenste aantal wisseltijdpunten te verzamelen (één 50 μL aliquot voor elk gewenst tijdspunt). Verzamel ten minste 4−5 tijdpunten over 3−4 ordes van grootte in tijdschaal (bijv. blustijden van 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1.800 s [30 min], en 14.400 s [4 h] bieden voldoende dekking van de uitwisselingsdynamiek voor de meeste enzymen).
    1. Meng alle gedeutereerde componenten (minus enzym) voor uit stap 1.1 in D2O.
    2. Bereid voor elke te onderzoeken biochemische toestand (vrij enzym, enzym + ligand, enzym + remmer, enz.) HDX-reacties in ten minste drievoud voor.
    3. Incubeer de reactiemengsels in een temperatuurgeregeld waterbad bij 25 °C gedurende 10 minuten voordat het enzym wordt toevoeging.
      OPMERKING: Het enzym moet worden bereid als een geconcentreerde stamoplossing (~100−200 μM, stap 1.6) om de toevoeging van protium aan de HDX-test te minimaliseren.
    4. Wanneer u het enzym toevoegt aan een eindconcentratie van 1−5 μM, start u de timer. Meng de oplossing voorzichtig en snel met behulp van een pipet van 200 μL om ervoor te zorgen dat het enzym gelijkmatig in het monster wordt verdeeld.
    5. Verwijder op de gewenste wisseltijdpunten 50 μL aliquots uit de HDX-reactie en meng snel en gelijkmatig met de vooraf geciteerde, ijskoude blusbuffer in een buis van 0,5 ml.
      OPMERKING: De mengvolumes en de mengprocedure moeten zo nauwkeurig en reproduceerbaar mogelijk zijn om ervoor te zorgen dat de gewenste einddamp van 2,3 snel in alle monsters wordt bereikt. Het koud houden van de blusbuffer zal helpen om de teruguitwisseling bij denaturatie van het enzym te minimaliseren.
    6. Onmiddellijk na het doven van het HDX-monster, dop de buis en flits bevries in vloeibare stikstof.
    7. Ga door met het verzamelen van tijdspunten totdat alle tests zijn voltooid en breng vervolgens monsters over naar de vriezer van -80 °C voor opslag.
      OPMERKING: Dit kan een stopplaats zijn. Na het verzamelen van alle HDX-tijdpunten kunnen de monsters bij -80 °C worden bewaard totdat ze klaar zijn voor LC-MS-analyse. Idealiter moeten drievoud HDX-reacties worden uitgevoerd voor alle biochemische toestanden van belang op dezelfde dag. Ten minste moeten alle gerepliceerde HDX-reacties voor een bepaalde biochemische toestand op dezelfde dag parallel worden uitgevoerd.
  3. Na het verzamelen van alle gedoofde HDX-tijdpunten, onderwerpt u de monsters aan de geoptimaliseerde bottom-up LC-MS-workflow die is ontwikkeld zoals beschreven in stap 3.3. Injecteer HDX-monsters in een gerandomiseerde volgorde met een passend aantal spaties tussen de monsters om ervoor te zorgen dat elke overdracht van peptiden minimaal is.
    OPMERKING: HDX-gegevens hoeven niet te worden verzameld in de MS E-modus. Daarom moet het energiesegment met hoge botsingen (stap 3.3.7.2) uit de ms-bedrijfscyclus worden verwijderd. Dit moet de enige wijziging zijn die is aangebracht in de werkstroom die in stap 3.3 wordt beschreven.
  4. Beoordeel de kwaliteit van de HDX-gegevens terwijl deze worden verzameld.
    1. Zorg ervoor dat de chromatografische pieken in het totale ionenchromatogram van de niet-gedeutereerde referentiemonsters op hetzelfde retentietijdje in de gedeutereerde monsters voorkomen (zoals in figuur 3D−F).
    2. Zorg ervoor dat massaspectra, opgeteld over specifieke tijdsintervallen van referentie- en gedeutereerde monsters, bewijs tonen voor deuteratie (d.w.z. een verschuiving in de isotopenomhulsel van individuele peptiden naar hogere m/z-waarden in de gedeutereerde monsters [figuur 6]).

6. Verwerking van HDX-gegevens

  1. Importeer de HDX-gegevens in het HDX-project dat in stap 4.11 is gemaakt door te klikken op Gegevens | MS-bestanden in de bovenste gereedschapsbalk.
    1. Klik op Nieuwe toestand en Nieuwe blootstelling indien nodig om de biochemische toestanden (bijv. vrij enzym, enzym + ligand, enz.) en deuteriumblootstellingstijden te definiëren, die relevant zijn voor de analyse.
    2. Klik op New Raw om de te analyseren HDX-gegevensbestanden te selecteren. Wijs de juiste uitwisselingstijden en biochemische status toe aan elk onbewerkt gegevensbestand dat wordt geïmporteerd.
      OPMERKING: De gegevens kunnen in batches of allemaal tegelijk worden geïmporteerd en verwerkt. Als u gegevens aan het project toevoegt, wordt geen analyse ongedaan gemaakt die eerder binnen dat project is uitgevoerd.
  2. Zodra de gegevensbestanden zijn toegevoegd, klikt u op voltooien om de gegevensverwerking te starten. Na een korte vertraging zal de software vragen of de gebruiker de gegevens wil opslaan voordat hij doorgaat. Klik op ja.
    OPMERKING: De eerste verwerking kan enkele uren duren, afhankelijk van het aantal monsters dat wordt geanalyseerd, hoeveel peptiden zich in de uiteindelijke peptidelijst bevinden (stap 4.10), de grootte van het chromatografische venster en de frequentie van spectrale acquisitie.
  3. Wijzig desgewenst de verwerkingsparameters in het menu Configuratie om de ionenzoekparameters te wijzigen. Zorg ervoor dat u dezelfde ionenzoekparameters gebruikt voor alle gegevens in een bepaald project.

7. Analyse en visualisatie van de HDX-gegevens

OPMERKING: Zodra de eerste verwerking van de onbewerkte gegevens is voltooid (stap 6.2), zal de HDX-verwerkingssoftware peptiden uit de peptidelijst (gegenereerd in stap 4.10) hebben gevonden in elk van de onbewerkte gegevensbestanden die zijn geanalyseerd. Zodra de isotoopverdeling voor een peptide in de lijst zich in een onbewerkt gegevensbestand bevindt, vertegenwoordigt de HDX-verwerkingssoftware elke isotoop met een "stick" (zoals in figuur 6C−E). De relatieve intensiteiten van de sticks voor een bepaald peptide worden vervolgens gebruikt om de deuteriumopname ten opzichte van de referentiespectra te berekenen. Hoewel de HDX-verwerkingssoftware bewonderenswaardig werk levert door "sticks" correct toe te wijzen aan de meeste peptiden, zal er nog steeds een aanzienlijke handmatige curatie van de deuteriumopnamewaarden nodig zijn.

  1. Analyse van de opnamewaarden van peptidedeuterium
    1. Selecteer het eerste peptide in de peptidelijst en open het gestapelde spectrale plot in het menu Weergaven. Scroll op en neer in het gestapelde spectra plotvenster om de massaspectra voor het geselecteerde peptide te zien als functie van deuteriumuitwisselingstijd(figuur 7D,E).
    2. Wijs stokken toe en wijs deze indien nodig toe met behulp van muisklikken om ervoor te zorgen dat de juiste isotoopverdeling zich in de gegevens bevindt en dat elke isotooppieken zijn toegewezen (toegewezen sticks zien er blauw uit). Door op een van de spectra in de gestapelde spectrale plot (figuur 7D,E) te klikken, kan de gebruiker stokken toewijzen/denassigneren in het actieve gegevensviewervenster (figuur 7C).
    3. Controleer de sticktoewijzingen voor elke laadstatus door de laadstatus boven aan het gestapelde spectrale plotvenster te plaatsen.
    4. Herhaal stap 7.1.1−7.1.3 voor elke biochemische toestand van belang. De biochemische toestand kan ook worden geschakeld aan de bovenkant van het gestapelde spectrale plotvenster. Voor de meest nauwkeurige deuteriumopnameverschilmetingen moet u ervoor zorgen dat sticks worden toegewezen voor dezelfde set ladingstoestanden voor elke biochemische toestand.
    5. Herhaal stap 7.1.1−7.1.4 voor elk peptide in de peptidelijst.
    6. Controleer de standaardafwijking van de opnamewaarden van peptidedeuterium met behulp van de dekkingskaart.
      1. Open de dekkingskaart in het menu Weergaven, waarin elk peptide in de peptidelijst wordt weergegeven die is toegewezen langs de aminozuursequentie van het eiwit van belang (Figuur 8C). Kleur de peptiden volgens relatieve standaarddeviatie (eenheden van Da).
      2. Zoek visueel op de kaart naar uitschieterpeptiden met een hoge relatieve standaardafwijking. Klik op de uitschieterpeptiden in de dekkingskaart om de gestapelde spectrale plots (figuur 8B) en het venster van de gegevensviewer (figuur 8A) te vullen met het doelpeptide.
      3. Met behulp van de gestapelde spectrale plot, zorgvuldig controleren of alle ladingstoestanden en alle tijd punten van de uitschieter peptide hebben op de juiste manier toegewezen stokken.
        OPMERKING: Meestal hebben peptiden met grote standaardafwijkingen (>0,3 Da) isotopenpieken die niet op de juiste manier door de software zijn toegewezen (zoals aangegeven in figuur 8B). Door ontbrekende sticks toe te wijzen, kan de relatieve standaardafwijking van een peptide over het algemeen worden teruggebracht tot <0,3 Da.
      4. Verberg het peptide uit de lijst als de relatieve standaardafwijking niet kan worden teruggebracht tot minder dan 0,3 Da.
  2. Exporteer HDX-verschilgegevens tussen twee biochemische toestanden voor het in kaart brengen op een structureel model van het eiwit van belang.
    1. Het verschil in interesse in de dekkingskaart weergeven. Klik met de rechtermuisknop op de dekkingskaart om de verschilgegevens naar een .csv-bestand te exporteren. Exporteer de statusgegevens (in .csv-indeling) door naar Gegevens | Statusgegevens exporteren in de hoofdgereedschapsbalk.
      OPMERKING: De juiste opmaak van de gegevens van het verschil en de statusgegevensbestanden vindt u in de ondersteunende informatie.
    2. Importeer de verschilgegevens, de staatsgegevens en het pdb-bestand van het eiwit van belang in Deuteros28. Kies het betrouwbaarheidsinterval van 99%, selecteer som inschakelenen verwerk de gegevens.
      OPMERKING: MATLAB moet op de pc worden geïnstalleerd om Deuteros uit te voeren. Deuteros zal de repliceermetingen in de dataset gebruiken om de standaarddeviatie van de opnamegegevens voor elk peptide te berekenen. Deze standaardafwijking wordt gebruikt om het betrouwbaarheidsinterval voor significante uitwisseling te definiëren, dat op de percelen wordt weergegeven.
    3. Selecteer onder PyMOL-opties | voor exportopname exporteren om een Pymol-script te genereren om regio's met een significant uitwisselingsverschil in kaart te brengen op de pdb-structuur van het eiwit van belang met behulp van PyMOL-software.
      OPMERKING: Met behulp van de workflow die in dit protocol wordt beschreven, is het betrouwbaarheidsinterval van 99% voor een significant deuteriumopnameverschil voor een bepaald peptide op één tijdstip meestal 0,3−0,5 Da. Het betrouwbaarheidsinterval van 99% voor het verschil dat wordt opgeteld over alle wisseltijdpunten is meestal 0,7−1,0 Da.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is noodzakelijk om de kwaliteit van de proteolytische spijsvertering en de reproduceerbaarheid van de workflow voor elke set monsterinjecties te beoordelen. Dus, voorafgaand aan het uitvoeren van HDX-MS-assays, is het essentieel om effectieve voorwaarden vast te stellen voor de proteolyse van het eiwit van belang, voor de scheiding van peptiden met behulp van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en gasfase ionenmobiliteit, en voor de detectie van peptiden met behulp van MS. Hiertoe moeten eerst de referentiemonste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De IN dit protocol gepresenteerde HDX-MS workflow biedt een opmerkelijk robuust platform voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van structureel dynamische elementen in eiwitten en voor het onderzoeken hoe deze dynamiek verandert als reactie op verstoring (ligandbinding, enzym mutagenese, etc.). HDX-MS heeft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere structurele biologiebenaderingen die vaak worden gebruikt om conformatiedynamiek te onderzoeken. Het meest in het bijzonder zijn slechts klein...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

We hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, het Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, de Canadian Foundation for Innovation en mcgill university start-up fondsen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)BioBasicNA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugale filtratie-inrichting (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
acetonitrilFisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
mierenzuurThermo Fisher28905
guanidine-HClVWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
MagnesiumchlorideSiGMA-Aldrich63068-250G
KaliumchlorideBioBasicPB0440
kaliumfosfaatBioBasicPB0445
TCEP HydrochlorideTRC CanadaT012500peptide werd op verzoek gesynthetiseerd
Naam van materiaal/apparatuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen/Beschrijving
software
DeuterosAndy M C Lau, et alversie 1.08
DynamXWatersversie 3.0
MassLynxWatersversie 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersversie 3.0.3
PyMOLSchrödingerversie 2.2.2
Naam van materiaal/apparatuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen/Beschrijving
Instrument en apparatuur
ACQUITY UPLC BEH C18 analytische kolomWaters186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-kolomWaters186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX-systeemWaters
HDX ManagerWaters
microtip pH-elektrodeThermo Fisher13-620-291
Waters Enzymate BEH-kolom of Pepsin-solumnWaters186007233
Waters Synapt G2-SiWaters

Referenties

  1. Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
  2. Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).
  3. Tokuriki, N., Tawfik, D. S. Protein dynamism and evolvability. Science. 324 (5924), 203-207 (2009).
  4. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).
  5. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).
  6. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).
  7. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Science. 2 (4), 522(1993).
  8. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  9. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).
  10. Xiao, K., et al. Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping. Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).
  11. Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).
  12. Masson, G. R., et al. Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments. Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).
  13. Liu, J., et al. An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore. Scientific Reports. 5, 16883(2015).
  14. Marion, D., et al. Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta. Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).
  15. Balasubramaniam, D., Komives, E. A. Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).
  16. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  17. Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry. Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).
  18. Mitchell, J. L., et al. Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein. Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).
  19. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  20. Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).
  21. Hebling, C. M., et al. Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).
  22. Duc, N. M., et al. Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).
  23. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  24. Reading, E., et al. Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions. Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).
  25. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).
  26. Lento, C., et al. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  27. Schowen, K. B., Schowen, R. L. Solvent isotope effects on enzyme systems. Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).
  28. Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry. Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).
  29. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).
  30. Burkitt, W., O'Connor, G. Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).
  31. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Proteïneconformationele dynamiekenzym-substraatinteractiesultra-performance vloeistofchromatografiemassaspectrometrie-analysedeuteriumopnamemetinglanthipeptide-biosynthesestructurele proteïnekarakterisering
Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.