Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

28K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61054

⸱

22 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

In dit artikel

Samenvatting

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Samenvatting

De ECLIA is een veelzijdige methode die in staat is om endogene en recombinante eiwithoeveelheden in een 96-put formaat te kwantificeren. Om eclia-efficiëntie aan te tonen, werd deze test gebruikt om intrinsieke niveaus van MeCP2 in muishersenweefsel en de opname van TAT-MeCP2 bij menselijke huidfibroblasten te analyseren. De MeCP2-ECLIA produceert zeer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met een lage intra- en inter-assay fout. Samengevat hebben we een kwantitatieve methode ontwikkeld voor de evaluatie van MeCP2-eiwitvarianten die kunnen worden gebruikt in schermen met een hoge doorvoer.

Inleiding

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is gebaseerd op een proces dat gebruik maakt van etiketten die zijn ontworpen om luminescentie uit te stoten wanneer elektrochemisch gestimuleerd. Het is een breed toepasbare techniek voor de kwantitatieve detectie van biologische analyten in de basisindustrie en academisch onderzoek, de voedingsindustrie en in klinische diagnostiek1. Vaak wordt een wegwerp 96-well plaat met koolstofinkt elektroden gebruikt. Deze elektroden fungeren als een vaste fase drager voor de immunoassay. Een secundair antilichaam wordt geconjugeerd tot een elektrochemiluminescent label en wanneer elektriciteit wordt toegepast op het systeem, licht emissie van het chemische label wordt geactiveerd. Een ultralage geluidsbelastinggekoppelde inrichting (CCD) registreert de lichtintensiteit die rechtstreeks evenredig is met het antigeen dat aan het opname-antilichaam is gebonden, wat resulteert in de kwantificering van de beoogde analyt van het monster2. In vergelijking met de enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) wordt ECLIA als voordelig beschouwd omdat het een hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, evenals een betere automatisering en consistentie3.

Hier analyseerden we de methyl-CpG bindende eiwit 2 (MeCP2) niveaus in monsters van menselijke en murine oorsprong evenals verschillende varianten van het recombinant eiwit met behulp van de nieuw ontwikkelde ECLIA systeem. MecP2 is een X-gebonden nucleïnezuurbindende eiwit waarvan bekend is dat het interageren met gemethyleerde DNA-sequenties. Dit eiwit is betrokken bij de regulatie van genexpressie4,5. Verlies-van-functie mutaties in het gen dat dit eiwit codeert zijn de belangrijkste boosdoeners veroorzaakt Rett syndroom (RTT), een ernstige neuroontwikkelingsstoornis6. Een andere MeCP2-gerelateerde aandoening, MECP2 duplicatie syndroom, leidt ook tot neurologische symptomen die kunnen overlappen met die van RTT7. Met name worden vrouwen meestal beïnvloed door RTT, terwijl mannen6meestal worden getroffen door MECP2-duplicatiesyndroom 6,7. MECP2

Deze aandoeningen worden geassocieerd met respectievelijk onvoldoende of overtollige MeCP2-niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS). Daarom zouden behandelingsopties voor RTT die het verhogen van mecp2-niveaus in het CNS inhouden, de schadelijke effecten van een overmaat aan MeCP27moeten vermijden . Vanwege dit feit is een zeer gevoelige en nauwkeurige kwantificering van MeCP2-eiwitniveaus, zoals geboden door het ECLIA-systeem, van cruciaal belang voor de vooruitgang van RTT en mecp2-dubbelsyndroomonderzoek. De precieze metingen van endogene en exogene MeCP2-niveaus uit menselijke cellijnen en muizenweefselmonsters, evenals een recombinanteiwit bestaande uit menselijke MeCP2-isoform B (ook bekend als isoform e1), en een minimaal N-terminal HIV-TAT transductiedomein (TAT-MeCP2) dat het potentieel heeft om de bloed-hersenbarrière8over testeken,9 worden in dit werk gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Goedkeuring voor huidbiopsie inkoop voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen van de Human Research Ethics Committee van het Children's Hospital in Westmead, Australië. Toestemming voor dierproeven werd verkregen van het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Economie, die werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).

OPMERKING: Het beginsel van het ECLIA-systeem is afgebeeld in figuur 1.

1. Selectie van antilichamen

  1. Evalueer de signaal-ruisverhouding voor een reeks verschillende MeCP2-antilichamen en identificeer de beste signaalsterkte en hoogste specificiteit binnen de combinatie van een primaire muismonoklonale MeCP2-antilichaam (kloon Mec-168) en konijnenpolyklonale MeCP2-detectieantilichaam (op maat gemaakt). Gebruik voor het secundaire antilichaam een systeemspecifiek antilichaam (Tabel van materialen),dat ook experimenteel werd geverifieerd.
    OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van alle geverifieerde antilichamen tijdens de mecp2-ECLIA-ontwikkeling en hun geteste verdunningsbereiken.
FunctieNaamKloonVerdunning
PrimaireMuis, anti-MeCP2Mec-1681:500−1:10.000
PrimaireMuis, anti-MeCP24B61:250−1:4.000
PrimaireMuis, anti-MeCP2Mannen-81:500−1:4.000
PrimaireMuis, anti-MeCP21B111:500−1:4.000
PrimaireKonijn, anti-MeCP2D4F31:500−1:4.000
SecundaireKonijn, anti-MeCP2Polyclonal1:2.000−1:20.000
SecundaireKonijn, anti-MeCP2Polyclonal1:2.000−1:20.000
DetectieSULFO-TAG gelabeld anti-konijnPolyclonal1:500−1:1.000

Tabel 1: Lijst van antilichamen en gebruikte werkverdunningen.

  1. U ook elk paar MeCP2-antilichamen gebruiken dat goed werkt met conventionele ELISA.

2. Behandeling van HDF's met TAT-MeCP2-fusie-eiwit

OPMERKING: TAT-MeCP2 werd recombinantly uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van standaard chromatografische technieken zoals eerder beschreven8 en opgeslagen bij -80 °C.

  1. Plaat 1 x 106 menselijke dermale fibroblast (HDF) cellen in 100 mm schotels en groeien de cellen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 totdat ze ongeveer 90% samenvloeiing bereiken.
  2. Neem één flesje TAT-MeCP2-fusieeiwit. Ontdooi op ijs en meng zachtjes.
  3. Verdun TAT-MeCP2 tot een eindconcentratie van 500 nM in 50 mL hdf-cultuurmedia.
  4. Verwijder de media uit 100 mm schotels en incubeer de cellen met 500 nM TAT-MeCP2 bij 37 °C gedurende verschillende incubatieperioden tot 24 uur.
  5. Verwijder de TAT-MeCP2-oplossing uit de cellen. Was de cellen 2x met voorverwarmde Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
  6. Behandel de cellen met 2 mL van 0,05% trypsin-EDTA-oplossing gedurende 5 min bij 37 °C10.
  7. Voeg 6 mL HDF-kweekmedia toe om de trypsine te activeren en de cellen in buizen van 15 mL te verzamelen.
  8. Pellet de cellen door centrifugering op 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
  9. Verwijder de supernatant en was de cellen 2x met ijskoude DPBS. Bewaar de pellet op ijs en ga verder met monstervoorbereiding.

3. Bereiding van de monsters

  1. HDF lysates
    1. Bepaal de hoogste eiwitniveaus van MeCP2 met behulp van de REAP-methode voor subcellulaire fractionering in de cytoplasmaen en nucleaire subcellulaire compartimenten volgens Suzuki et al.11. Beperk fractionatie tot niet meer dan zes monsters per experiment.
  2. Muis hersenen lysert
    1. Bereid 100 mL van elke hypotonische lyse reagens en extractiebuffer.
      1. Meng voor de hypotonische lysereagens goed 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride en 10 mM kaliumchloride.
      2. Meng voor de extractiebuffer goed 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride, 0,42 M natriumchloride, 0,2 mM EDTA en 25% (v/v) glycerol.
      3. Stel de pH van beide buffers aan op 7,9.
      4. Voeg 1 mM dithiothreitol (DTT) en 1x proteaseremmercocktail vers toe aan beide buffers. Chill op ijs voor gebruik.
    2. Schort 100 mg totale muishersenen op (stam: C57BL/6J, wildtype man en vrouw en B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous mannetje en heterozygoot vrouwtje; leeftijd: 4−8 weken oud) in 1 mL van ijskoud hypotonisch lysisreagens.
    3. Homogeniseer de hersenen met een voorgekoelde Dounce all-glas weefsel homogenisator door 15 slagen van homogenisator A (los, voor grote klaring) en B (strak, voor kleine klaring), respectievelijk.
    4. Breng de gehomogeniseerde cellen over in een schone buis en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg (of bewaar het als cytoplasmatische fractie voor verder gebruik).
    5. De pellet opnieuw opschorten in 140 μL extractiebuffer per 100 mg uitgangsmateriaal. Plaats de buis in een voorgekoeld thermoblok en meng zachtjes gedurende 30 min bij 4 °C.
    6. Centrifugeer de buis op 16.000 g gedurende 10 min bij 4 °C. Breng de supernatant (d.w.z. de kernfractie) over op een nieuwe voorgekoelde buis en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: De eiwitconcentratie van lysaten afkomstig van muishersenen en HDF's kan worden beoordeeld door de BCA-eiwittest.

4. MeCP2-ECLIA-protocol

  1. Bereiding van wasoplossing, blokkerende buffer en testverdunningsoplossing (dag 1)
    1. Voeg 500 μL Tween 20 tot 1 L PBS toe om een 0,05% Tween 20 in PBS-oplossing te bereiden, meng krachtig en label als "wasoplossing".
      LET OP: Zorg ervoor dat alleen vers bereide wasbuffer wordt gebruikt.
    2. Bereid een blokkeraat van 3% A (Tabel van materialen) voor in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meng door zacht roeren, filter steriliseren en bewaar ze in de koelkast tot gebruik voor een maximum van twee weken.
    3. Voeg 5 mL blokkeringsoplossing toe aan 10 mL PBS om testverdunningsoplossing (1% blokker A in PBS) voor te bereiden.
  2. Coating van hoge bindplaten
    1. Neem een 96-well multi-array single spot high bind plate.
      LET OP: Hoge bindplaten hebben een grotere bindingscapaciteit en dus een groter dynamisch bereik dan standaardplaten met hydrofobe oppervlakken.
    2. Ontdooi het monoklonale muisanti-MeCP2-antilichaam op ijs en meng 0,67 μL van het antilichaam met 4 mL PBS (1:6.000 antilichaamverdunning in PBS). Draai de antilichaamoplossing om goed te mengen en de buis te labelen als "coatingoplossing".
    3. Bedesudeer voorzichtig 25 μL coatingoplossing in de onderste hoek van elke put met behulp van een meerkanaals pipetor; dit wordt de oplossingscoatingmethode genoemd. Tik voorzichtig op de 96-putplaat aan elke kant om ervoor te zorgen dat de coatingoplossing de bodem van elke put bedekt.
    4. Sluit de plaat af met een kleeffolie en broed de plaat 's nachts op 4 °C (12-16 uur) in de koelkast.
  3. Blokkeren (dag 2)
    1. Haal het bord uit de koelkast en verwijder de folie.
    2. Verwijder de antilichaam coating oplossing door flicking het in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle coating oplossing te verwijderen uit de putten.
    3. Voeg 125 μL blokkeringsoplossing per put toe. Sluit de plaat opnieuw af en plaats deze op een orbitale microplate shaker.
    4. Incubeer de plaat voor 90 min bij kamertemperatuur met constante schudden bij 800 rpm.
  4. Bereidingen van normen en monsters
    1. Bereid tijdens de incubatietijd de MeCP2- en/of TAT-MeCP2-eiwitnormen en diverse monsters voor.
      OPMERKING: De Lysisbuffer die wordt gebruikt voor standaardverdunning moet dezelfde zijn als die welke in de geanalyseerde monsters wordt gebruikt.
    2. Neem één flacon MePC2 en/of TAT-MeCP2 eiwitvoorraadoplossing (250 μg/mL), muishersenlysaten en HDF-lysaten van -80 °C. Ontdooi ze op ijs.
    3. Verdun de standaard voorraadoplossing (MeCP2 en/of TAT-MeCP2) in schone buizen volgens tabel 2.
    4. Verdun de monsters in lysisbuffer als volgt: 1−20 μg muishersenlysaat per 25 μL lysisbuffer en 0,25−1 μg HDF lysaat per 25 μL lysisbuffer. Bereid voldoende volume van elk monster voor om een analyse in drievoud uit te voeren.
StandaardConcentratieVerdunning
Standaard 11.800 ng/mL1,08 μL Standaard voorraadoplossing + 148,92 μL Lysis buffer
Standaard 2600 ng/mL50 μL Standaard 1 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 3200 ng/mL50 μL Standaard 2 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 466,67 ng/mL50 μL Standaard 3 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 522.22 ng/mL50 μL Standaard 4 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 67.41 ng/mL50 μL Standaard 5 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 72,47 ng/mL50 μL Standaard 6 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 80,82 ng/mL50 μL Standaard 7 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 90,27 ng/mL50 μL Standaard 8 + 100 μL Lysis buffer
Standaard 100 ng/mL150 μL Lysis buffer

Tabel 2: Standaardreeks van 0 tot 1800 ng/mL.

  1. Het toevoegen van de monsters en standaardoplossingen
    1. Verwijder de blokkeringsoplossing door deze in de prullenbak te vegen en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle blokkeringsoplossing uit de putten te verwijderen.
    2. Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
    3. Voeg 25 ul van normen en monsters aan de onderste hoek van de put met behulp van een enkele kanaal pipet.
    4. Sluit de plaat af en broed de plaat 4 uur lang in bij kamertemperatuur met constant schudden bij 800 tpm.
  2. Antilichaam zonder label
    1. Ontdooi het polyklonale konijn anti-MeCP2 antilichaam op ijs. Verdun het antilichaam 1:6.000 in testverdunningsoplossing.
    2. Verwijder de normen en monsters door het flicking in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek.
    3. Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
    4. Voeg 25 μL ongelabelde detectieantilichaam toe aan elk goed met de meerkanaals pipettor. Sluit de plaat af en incubeer deze gedurende 1 uur met constant schudden bij 800 rpm bij kamertemperatuur.
  3. Specifiek geconjugeerd antilichaam
    1. Haal het specifieke secundaire antilichaam (Table of Materials) uit de koelkast en plaats het op ijs. Verdun het antilichaam 1:666.67 in testverdunningsoplossing en meng voorzichtig.
    2. Verwijder het gratis secundaire antilichaam zonder label door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.
    3. Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
    4. Voeg 25 μL van specifieke geconjugeerde antilichaam (Tabel van materialen) aan elk goed met de multichannel pipettor. Sluit de plaat af en incubeer 1 uur met constant schudden bij 800 tpm bij kamertemperatuur.
  4. Het lezen van de plaat
    1. Verwijder het gratis geconjugeerde antilichaam (Table of Materials) door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.
    2. Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing.
    3. Voeg 150 μL van 1x Tris-gebaseerde Gold read buffer (Table of Materials) met oppervlakteactieve stof met tripropylamine als een co-reactant voor lichtopwekking aan de plaat. Vermijd luchtbellen door gebruik te maken van omgekeerde pipettertechnieken.
    4. Plaats de plaat op het microplaatdetectieplatform (Materiaaltafel)en start de meting onmiddellijk. Gebruik de instellingen voor 96-well plaat acquisitie.
    5. Leg de elektrochemiluminescentiesignalen vast door een ingebouwde CCD-camera in een elektrochemiluminescentiedetectiesysteem (Tabel van materialen)en leg de signaaltellingen vast, die overeenkomen met relatieve lichteenheden (RLU) en direct evenredig zijn met de intensiteit van het licht.
      OPMERKING: Bij elektrochemische stimulatie zendt het rutheniumlabel dat gebonden is aan de koolstofelektrode luminescentielicht uit op 620 nm. Gegevens analyseren met de instrumentgestuurde software (Tabel van materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het beginsel van het ECLIA-systeem is beschreven in figuur 1. Standaardcurven voor twee MeCP2-varianten worden weergegeven in figuur 2. Nauwkeurige kwantificering was mogelijk over een breed scala van concentraties (1−1.800 ng/mL). In figuur 3werden MeCP2-niveaus van lysaten afgeleid van muishersenen en HDF's geanalyseerd. MeCP2-expressie in kernlysatataatstoffen in de hersenen van heterozygoot, wildtype en knock-outmuizen werden ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om endogene MeCP2-, recombinant MeCP2- en TAT-MeCP2-niveaus te meten, werd een 96-well plaat ECLIA ontwikkeld. Het is aangetoond dat verlies van MeCP2 eiwitfunctie leidt tot RTT-syndroom6, waarvoor de behandeling momenteel beperkt is tot symptoombestrijding en fysiotherapie. Een veelbelovende behandelingsweg is de zogenaamde eiwitvervangende therapie, waarbij MeCP2-niveaus kunnen worden getitreerd tot hun benodigde concentratie12,13,<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn Dr. Brigitte Sturm zeer dankbaar voor haar steun aan het ECLIA-instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad Laboratories Inc.500-0006Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbitMeso Scale DiagnosticsR32AB-1Antibody
Discovery workbench 4.0Meso Scale DiscoverySoftware
DMEM (1X)gibco by Life Technologies41966-029Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile)Sigma-AldrichD8537-500MLSample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTASigma-AldrichEDSExtraction Buffer
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF9665Sample preperation
GlycerolSigma-AldrichG2025Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactantMeso Scale DiagnosticsR92TGMeCP2 ECLIA protocol
HEPESSigma-AldrichH3375Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD8938Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)GFL3014MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)Sigma-AldrichM2670Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)Abnova CorporationH00004204-P01Cell treatment
Microseal B sealBio-Rad Laboratories Inc.MSB1001for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulinSigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075Antibody, Coating solution
MSD Blocker AMeso Scale DiagnosticsR93BA-4Blocker
MSD SECTOR Imager 2400Meso Scale DiagnosticsI30AA-0MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well PlateMeso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycingibco by Life Technologies15140122Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbitEurogentec S.A.custom-designedAntibody
Potassium chloride (KCl)Merck KGaA1049361000Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)Cell Signaling Technology3456S; RRID:AB_2143849Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X)Sigma-Aldrich8340Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Eurogentec S.A.customAntibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2Merck07-013Antibody
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS3014Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)Meso Scale DiagnosticsW0015528SAntibody
TAT-MeCP2 fusion proteinin-house productionCell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X)gibco by Life Technologies25200-056Cell treatment
Tween 20Sigma-AldrichP9416Washing solution

Referenties

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Electrochemiluminescentie assayMeCP2 eiwitkwantificering96 wells formaatvergelijking met Western blotvergelijking met ELISATween 20 wasoplossingBlocker A blokkeeroplossingmonoklonaal anti MeCP2 antilichaamorbitale microplaatshakerTris Base Gold leesbuffer
Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.