We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Drosophila-teelballen zijn een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van biologische processen, waaronder stamcelbiologie, nucleaire architectuur, meiose en spermaontwikkeling. Immunolabeling van de hele Drosophila-testis wordt echter vaak geassocieerd met significante niet-uniformiteit van kleuring als gevolg van antilichaampenetratie. Geplette preparaten overwinnen het probleem slechts gedeeltelijk, omdat het de 3D-kwaliteit van de analyses vermindert. Hierin beschrijven we een whole-mount protocol met NP40 en heptaan tijdens fixatie samen met immunolabeling in vloeibare media. Het behoudt het volume dat geschikt is voor confocale microscopie samen met reproduceerbare en betrouwbare etikettering. We laten verschillende voorbeelden zien van 3D reconstitutie van spermatocytkernen uit confocale secties. De reproduceerbaarheid van intra- en intertesten maakt 3D-kwantificering en vergelijking van fluorescentie tussen afzonderlijke cellen van verschillende genotypen mogelijk. We gebruikten verschillende componenten van de intranucleaire MINT-structuur (Mad1-bevattend Intra Nuclear Territory) en twee componenten die verband houden met het nucleaire poriecomplex om dit protocol en de toepassingen ervan op de grootste cellen van de testis, de S4-S5 spermatocyten, te illustreren.
Inleiding
Drosophila-teelballen zijn een waardevol model voor de studie van nucleaire architectuur. In mitotische spermatogoniale cellen wordt het nucleaire volume grotendeels ingenomen door chromatine. Deze cellen ondergaan vier delingsrondes en produceren een cyste van 16 primaire spermatocyten. In de komende dagen passeren de spermatocyten 6 ontwikkelingsstadia (S1-S6), sterk toenemend in volume, ongeveer 20-voudig1,2. Ze veranderen ook hun nucleaire morfologie. De omtrek van de kern, onthuld door de lamin Dm0, wordt onregelmatig en vertoont diepe invaginaties1,3. Dit gaat gepaard met uitgebreide genexpressieveranderingen en wijzigingen in chromatineorganisatie1,4,5,6,7. De interfasechromosomen zijn goed gedefinieerd in stadium S4-S5 en vormen drie verschillende massa's die overeenkomen met de 2 grote bivalente autosomen en het X-Y-paar aangemeerd met de nucleolus.
Mad1 werd oorspronkelijk geïsoleerd als een belangrijk onderdeel van het mitotische controlepunt (beoordeeld in8). In interfase wordt beschreven als voornamelijk gelegen aan de nucleaire envelop, maar ook in het nucleoplasma9,10,11. In Drosophila testis meldden we dat Mad1 prominent aanwezig is in het nucleoplasma, nauw verbonden met de twee belangrijkste autosomale chromatinemassa's en in mindere mate met de XY chromatine. We definieerden deze chromatine-geassocieerde structuur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Vier andere eiwitten werden geassocieerd met MINT's in spermatocyten: de nucleoporine Mtor/Tpr, het SUMO peptidase Ulp1, het mitotische checkpoint-eiwit Mad2 en een subeenheid van een Polycomb-achtig complex Raf212.
Om de beschrijving van DE's te voltooien, moesten we antilichamen gebruiken en werden we geconfronteerd met de technische problemen die over het algemeen worden ondervonden met immunostaining bij testis: een slechte permeabiliteit die resulteert in een significante niet-uniformiteit van kleuring in de diepte van de testis, met name in de grote spermatocyten. Svernietigde preparaten verhoogden de toegang tot antilichamen, maar leidden tot gecomprimeerde beelden, waardoor de 3D-analyses werden beperkt en het meten van kwantitatieve fluorescentie, waaronder colocalisatie, werdvoorkomen. Het probleem van antilichaampenetratie kan ook worden aangepakt door permeabiliserende middelen zoals 0,3% Na-deoxycholaat13, maar deze procedure leverde in onze handen geen reproduceerbare resultaten op. Omdat we veel co-labeling experimenten hebben uitgevoerd, hebben we gekeken naar het verbeteren van het permeabilisatieprotocol. De combinatie van 1% NP40 plus heptaan resulteerde in meer reproduceerbaarheid, met name in het bestuderen van de grote spermatocyten.
Dit protocol voert fixatie en immunostaining van teelballen in suspensie uit, verbetert de monsterkwaliteit en verbetert de reproduceerbaarheid en maakt het geschikt voor confocale microscopie. We gebruikten het protocol om de ruimtelijke relaties van bepaalde nucleaire envelopeiwitten met de nucleoplasmatische structuren van grote spermatocyten beter te definiëren. Deze methode zal een beter onderzoek mogelijk maken naar de veranderingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van spermatocyt, bijvoorbeeld de dynamische structurele veranderingen van de kern, waaronder chromatine, nucleoplasma en de nucleaire poriën.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Drosophila testes collectie
OPMERKING: Jonge mannetjes (0-15 uur post-eclosie) zijn nodig voor het onderzoeken van diploïde kiemcellen (d.w.z. spermatogonia en spermatocyten).
- Selecteer jonge vliegen zoveel mogelijk om interferentie door het ontwikkelen van spermatids te minimaliseren.
- Verdoof vliegen door korte blootstelling aan kooldioxide en breng over op een vliegenkussen14,15.
- Gebruik onder een ontleedmicroscoop (10x vergroting) een tang om het hoofd te verwijderen.
- Breng 5 tot 10 onthoofde vliegen over naar 100 μL ringersbuffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, complete eiwitremmer, pH 6,8) op een glazen glijbaan met siliconencoating op een zwarte achtergrondsteun.
- Gebruik met een ontleedmicroscoop bij een vergroting van 40x één paar nummer 5-tangen om een vlieg tussen de thorax en de buik vast te houden en trek met een andere tang de buik weg van de thorax. Isoleer snel de teelballen en aangrenzende weefsels van het vliegkarkas15 en plaats in een nieuwe druppel Ringer's buffer op dezelfde dia.
- Zodra alle teelballen klaar zijn, reinigt u de teelballen van de resterende weefsels (accessoireklier en uitwendige genitaliën).
- Verwijder overtollige buffer uit de druppel met de ontlede teelballen. Gebruik meestal een p200 pipet met een tip van 10 μL bovenop een tip van 200 μL. Dit maakt het mogelijk om het overtollige vocht door een klein diafragma te verwijderen. Plaats een druppel van 4% paraformaldehyde fixatief bovenop de druppel met de ontlede teelballen en breng de teelballen vervolgens snel over in een buis met verse fixatieve oplossing.
2. Paraformaldehyde fixatie
- Bereid vlak voor gebruik 2 ml fixatieve oplossing: 600 μL 4% paraformaldehyde verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 30 μL NP40 20% plus 1200 μL heptaan in een 2 ml gesiliconiseerde microcentrifugebuis. Gebruik 4% paraformaldehyde in PBS bereid in 600 μL aliquots en bewaard bij -20°C.
Let op: Heptaan en paraformaldehyde zijn giftig en moeten in een zuurkast worden behandeld. Gooi ze weg volgens de voorschriften van het gastinstituut. - Breng de teelballen met behulp van een p200 micropipet met een brede diafragmatip over naar de PFA/NP40/heptaanoplossing. Schud de buis 30 s met de hand op en neer. Blijf de teelballen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op een roterende mixer bevestigen.
- Stop de roterende mixer en plaats de buis in een buizenrek om fasescheiding mogelijk te maken en voor de teelballen om zich op de bodem van de buis te nestelen.
- Verwijder alle heptaan en de fixatieve oplossing en spoel de teelballen drie keer snel af met 1x PBS.
- Breng over op een schone individuele buis van 200 μL. Voer alle incubaties uit in deze kleine buisjes om de hoeveelheden gebruikte antilichamen te minimaliseren.
- Verwijder overtollige buffer met behulp van een 200 μL micropipet met zowel een P200 als een P10 tip bevestigd. Zorg ervoor dat je geen teelballen aspireert.
- Houd teelballen in 1x PBS op ijs totdat alle monsters klaar zijn.
3. Antilichaamkleuring in oplossing
- Gooi de PBS weg en laat de teelballen 30 minuten in 0,3% PBS-T bij kamertemperatuur staan om celmembranen te permeabiliseren.
- Incubeer gedurende 1 uur in dezelfde buffer plus 5% normaal geitenserum (NGS).
- Voeg 200 μL van het primaire antilichaam verdund in 0,3% PBS-T plus 5% NGS (Tabel van materialen) toe.
- Incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij 4 °C (of kamertemperatuur) met zachte agitatie op een rocker.
- Was 3 keer in 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Laat de teelballen zich door de zwaartekracht op de bodem van de buis nestelen.
- Voeg 200 μL secundair antilichaam verdund 1:500 uit de DyLight geconjugeerde serie toe.
- Incubeer het secundaire antilichaam gedurende 4 uur bij kamertemperatuur in een donkere kamer.
- Was 0,3% PBS-T gedurende 15 minuten op een schommel op kamertemperatuur. Herhaal dit vervolgens met 0,2% PBS-T en 0,1% PBS-T, telkens gedurende 30 min op een rocker bij kamertemperatuur. Was het wasmiddel 30 minuten in 1x PBS.
- Voeg 180 μL DAPI-oplossing toe bij 1 μg/ml in 1x PBS gedurende 15 min. De stamoplossing is 10 mg/ml in H2O. Vermijd het maken van voorraadoplossing in PBS, die het DAPI-kleuringssignaal op diffuse chromatine in grotere spermatocyten kan verminderen.
- Was 3x voor elk 5 minuten.
- Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel op een schone dia te tekenen.
- Aspireer teelballen en zet ze op de glijbaan. Het voorspoelen van de brede diafragmatip met 0,1% PBS-T voorkomt dat de teelballen aan de punt blijven plakken. Verwijder overtollige PBS.
- Voeg een druppel (ongeveer 100 μL) Citifluor AF1 toe.
- Plaats voorzichtig een glazen afdeklip over het weefsel en zorg ervoor dat er geen luchtbellen vallen.
- Sluit de afdeklip af op de glijbaan met duidelijke nagellak.
- Observeer dia's op een microscoop.
4. Colocalisatie analyses
- Verkrijg confocale afbeeldingen. We gebruikten een Zeiss LSM 710 confocale microscoop (63x Plan Apochromatische olie) met een z-resolutie van 0,5 of 1 μm.
- Selecteer verschillende cellen uit onafhankelijke teelballen.
- Importeer afbeeldingen in verwerkingssoftware (bijv. Imaris).
- Definieer de kern door handmatige segmentatie om de naburige kernen uit te sluiten. Gebruik de Coloc software; het verzamelt de correlatiecoëfficiënten (PCC's) van Pearson binnen het gehele volume tussen 2 fluoroforen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het belangrijkste obstakel voor het verkrijgen van adequate kleuring van Drosophila-teelballen is de beperkte penetrante doordringbaarheid van antilichamen, die gedeeltelijk is opgelost door het gebruik van geplette preparaten, maar ten koste van het induceren van een beperking van de 3D-analyses (bijvoorbeeld 3D-representatie of meting van colocalisatie). De procedure maakt uniforme etikettering mogelijk en behoudt het volume van alle cellen van de testis. Hier hebben we de illustratie van de methode gericht op de 3D-re...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een methode voor succesvolle immunolabeling van volwassen Drosophila-teelballen. Zoals gemeld in andere procedures moeten jonge mannetjes worden gebruikt (we hebben zelfs de leeftijd verkort tot minder dan 20 uur na eclosie) om de aanwezigheid van zich ontwikkelend sperma te minimaliseren, wat de spermatocyten dreigt te belemmeren. De dissectie moet snel zijn en de antilichaamverdunning moet worden aangepast om de signaal-ruisverhouding21,22
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
Wij danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura voor antilichamen en A. Debec, de Bloomington en Vienna stock centers for flies. Met dank aan C. Jackson voor suggesties en stimulerende discussies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Gift van A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Parijs, Frankrijk) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011 15 mei;124(Pt 10):1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materialen | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Voorraad moet worden bereid in H2O |
| Dumont # 5 Fine Forseps | Fine Science Tools | ||
| MBP Wide Bore Pipette Tips | Fisherbrand | 11917744 | Tip met brede opening |
| Thermo Scientific 0.2 mL Individuele Tube | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml microcentrifugebuisjes | Sigma | T3531-200EA | Gesilicificeerd 2ml buisje |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normaal Geitenserum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyde 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyde (4%) opgelost in PBS 1X ; aliquot per 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, geen calcium, geen magnesium |
| 0.1% (0.2 of 0.3%) PBS-T | PBS 1X met 0.1% (0.2 % of 0.3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, voor moleculaire biologie, | Sigma | T8787 | |
| Antilichamen | |||
| GFP booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Muis anti-Mtor | 1/40 geschenk van J. Johansen, Iowa State University | ||
| Rat anti-Nup62 | 1/200 geschenk van H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Guinea-varken anti-Ulp1 | 1/200 geschenk van C. P. Verrijzer, Erasmus Universiteit, Rotterdam | ||
| Konijn anti-Raf2 | 1/200 geschenk van C. P. Verrijzer, Erasmus Universiteit, Rotterdam | ||
| DyLight geconjugeerde serie | Thermo | 1/500 Ezelsanti-(guinea-varken, muis, konijn of rat) als tweede antilichamen |
Referenties
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
- Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
- Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
- Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
- White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
- Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
- Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
- Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
- Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
- Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
- Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
- Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
- White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
- White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
- Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
- Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
- Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
