Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit protocol beschrijft het klonen en uitbreiden van menselijke regulerende T-cellen voor het genereren van levensvatbare menselijke Treg met ultrazuivere demethylering in het Treg-specifieke gedemethyleerde gebied (TSDR) en Treg-specifieke fenotypische kenmerken.
Menselijke regulerende T-cellen (Treg) zijn notoir moeilijk te isoleren in hoge zuiverheid gezien de huidige methoden van Treg-verrijking. Deze methoden zijn gebaseerd op de identificatie van Treg door middel van verschillende activeringsafhankelijke cellulaire oppervlaktemarkers met verschillende expressieniveaus in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Populaties geïsoleerd als "Treg" bevatten daarom vaak aanzienlijke aantallen niet-Treg-effectorcellen (d.w.z. Teff) die de precieze fenotypische en functionele karakterisering van deze cellen, hun genomische en proteomische karakterisering, hun betrouwbare telling in verschillende gezondheids- en ziektetoestanden, evenals hun isolatie en expansie voor therapeutische doeleinden, belemmeren. Vooral dit laatste blijft een grote hindernis, aangezien de onbedoelde uitbreiding van effectorcellen die zich in Treg-relevante cellulaire compartimenten bevinden (bijv. CD4+CD25+ T-cellen) Treg-gebaseerde immunotherapie ineffectief of zelfs schadelijk kan maken. Dit werk presenteert een methode die de problemen omzeilt die gepaard gaan met populatiegebaseerde isolatie en uitbreiding van Treg en laat zien dat het genereren van Treg-kandidaat-klonen met de daaropvolgende selectie, kweek en uitbreiding van alleen zorgvuldig doorgelichte, monoklonale cellen, het mogelijk maakt om een ultrapuur Treg-celproduct te genereren dat vele maanden in cultuur kan worden gehouden, het mogelijk maken van downstream onderzoek van deze cellen, ook voor mogelijke therapeutische toepassingen.
Het doel van dit protocol is om de in vitro vermeerdering van ultrazuivere, klonale menselijke Treg mogelijk te maken. Isolatie van Treg-verrijkte populaties en daaropvolgende klonering maakt het mogelijk om gewenste Treg-fenotypes te selecteren en hun uitbreiding uit te breiden voor verdere studie van de biologie van deze cellen, verkenning van hun potentieel therapeutisch nut en andere experimentele stroomafwaartse toepassingen.
Het klonen van Treg zal een aanzienlijk betere zuiverheid van Treg opleveren dan polyklonale isolatie- en expansiebenaderingen. Dit komt door de betrouwbare, gecontroleerde uitslu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit protocol volgt alle institutionele richtlijnen met betrekking tot de ethische uitvoering van onderzoek waarbij gebruik wordt gemaakt van menselijke monsters. Het werken met menselijke cellen en andere producten van menselijk bloed moet ten minste plaatsvinden in een BSL-2-gecertificeerde omgeving volgens ten minste de BLS-2-veiligheidsrichtlijnen.
1. Voorverrijking van menselijke mononucleaire cellen in perifeer bloed voor CD4+CD127totCD25hi-cellen
LET OP: Gebruik overal een steriele techniek. Gooi scherpe voorwerpen onmiddellijk weg in een gesc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Succesvolle implementatie van dit protocol zal leiden tot het genereren van stabiele menselijke regulerende T-celklonen en -lijnen.
Voorselectie/voorverrijking van CD4+CD127totCD25hi-cellen was een eenvoudige methode om een startpopulatie te verkrijgen die de meeste menselijke Treg bevatte (Figuur 1A-C). Niet alle klonen vertoonden een Treg-fenotype. Prescreening van klonen door me.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit protocol beschrijft de voortplanting van ultrazuivere menselijke regulerende T-cellen door de isolatie, expansie en zorgvuldige doorlichting van cellen die zijn verkregen in een beperkende verdunnings- en feedercelgebaseerde expansiebenadering van Treg-bevattende startpopulaties.
Cruciale stappen in deze aanpak zijn: 1) de keuze van een geschikte startpopulatie. Over het algemeen bevat het CD127loCD25hi-compartiment van CD4+
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dit project werd ondersteund door het National Eye Institute van de National Institutes of Health onder Award Number K08EY025324 (Nowatzky) en door een Colton Scholar Award van het Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm Stericup, 500 mL | Millipore | 5500 | Opslag en voorbereiding van media |
| 100x Nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | Media component |
| 15 mL conical centrifuge tubes (50/zak, pak van 500) | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | Media component |
| 25 ml Single Well Pipet Basin | Fischer Scientific | 13-681-508 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve) | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50x Penicillin Streptomycin Soln | Corning | Corning, 30-001-Cl | Media component |
| CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL | Nalge Nunc | 377267 | |
| DMSO | Corning | 25-950-CQC | |
| EasySep Human CD25 positive selection kit | Stemcell Technologies | 18231 | Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering |
| EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19231 | Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering |
| EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternatief voor item 12) | Stemcell Technologies | 18063 | Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-5442-03 | PBMC zuivering uit perifeer bloed van leukafereseproducten; dichtheidsgradiëntmedium |
| Human AB Serum (PHS-AB) | Valley Biomedical Inc | HP1022 | Media component |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, voor UV-excitatie | Thermo Fischer | L-34962 | Viabiliteitskleuring |
| Phytohemagglutinine-L (PHA-L) | Millipore/Sigma | 11249738001 | T-cel stimulatie |
| Recombinant IL-2 (bijv. PROLEUKINâ) | Prometheus | T-cel stimulatie en onderhoud/ Media component | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Media component |
| Kleurstoffen voor flowcytometrie (Treg fenotypering) | Zie "Opmerkingen" | Zie "Opmerkingen" | Kleurstoffen voor kleuring zijn vermeld in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In geval EasySep Human CD25 positive selection kit wordt gebruikt, kleuren met 2A3 of BC96 anti-CD25 antilichaam, bijv.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629) |
| TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark | Beckman Coulter | PN IM3497 | Controle van expansies op monoklonaliteit |
| Weefselkweekplaat, 96 Well, U-Bodem met Laag Dampingsdeksel | Corning | 353077 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar