Generatie van menselijke regulerende T-celklonen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het klonen en uitbreiden van menselijke regulerende T-cellen voor het genereren van levensvatbare menselijke Treg met ultrazuivere demethylering in het Treg-specifieke gedemethyleerde gebied (TSDR) en Treg-specifieke fenotypische kenmerken.

Samenvatting

Menselijke regulerende T-cellen (Treg) zijn notoir moeilijk te isoleren in hoge zuiverheid gezien de huidige methoden van Treg-verrijking. Deze methoden zijn gebaseerd op de identificatie van Treg door middel van verschillende activeringsafhankelijke cellulaire oppervlaktemarkers met verschillende expressieniveaus in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Populaties geïsoleerd als "Treg" bevatten daarom vaak aanzienlijke aantallen niet-Treg-effectorcellen (d.w.z. Teff) die de precieze fenotypische en functionele karakterisering van deze cellen, hun genomische en proteomische karakterisering, hun betrouwbare telling in verschillende gezondheids- en ziektetoestanden, evenals hun isolatie en expansie voor therapeutische doeleinden, belemmeren. Vooral dit laatste blijft een grote hindernis, aangezien de onbedoelde uitbreiding van effectorcellen die zich in Treg-relevante cellulaire compartimenten bevinden (bijv. CD4⁺CD25⁺ T-cellen) Treg-gebaseerde immunotherapie ineffectief of zelfs schadelijk kan maken. Dit werk presenteert een methode die de problemen omzeilt die gepaard gaan met populatiegebaseerde isolatie en uitbreiding van Treg en laat zien dat het genereren van Treg-kandidaat-klonen met de daaropvolgende selectie, kweek en uitbreiding van alleen zorgvuldig doorgelichte, monoklonale cellen, het mogelijk maakt om een ultrapuur Treg-celproduct te genereren dat vele maanden in cultuur kan worden gehouden, het mogelijk maken van downstream onderzoek van deze cellen, ook voor mogelijke therapeutische toepassingen.

Inleiding

Het doel van dit protocol is om de in vitro vermeerdering van ultrazuivere, klonale menselijke Treg mogelijk te maken. Isolatie van Treg-verrijkte populaties en daaropvolgende klonering maakt het mogelijk om gewenste Treg-fenotypes te selecteren en hun uitbreiding uit te breiden voor verdere studie van de biologie van deze cellen, verkenning van hun potentieel therapeutisch nut en andere experimentele stroomafwaartse toepassingen.

Het klonen van Treg zal een aanzienlijk betere zuiverheid van Treg opleveren dan polyklonale isolatie- en expansiebenaderingen. Dit komt door de betrouwbare, gecontroleerde uitsluiting van T-effectorcellen met vergelijkbare of verschillende fenotypes uit de gezuiverde populatie, waaronder onder andere FOXP3-expressie (FOXP3^intCD45RA^negCD25^int) non-Treg en CD4⁺ CD25⁺ FOXP3-Teff¹. Klonale cellijnen die via deze benadering worden verkregen, hebben niet te maken met het probleem van overgroei met snel uitbreidende niet-Treg-klonen die expansie op zeer lange termijn (d.w.z. enkele maanden) en in-vitrocultuur van de cellen praktisch onmogelijk of op zijn minst extreem uitdagend maken. Klonale Treg maakt ook uitgebreide doorlichting van hun fenotypische kenmerken na expansie mogelijk, onder meer door middel van methoden die worden erkend als standaard voor de beoordeling van epigenetische kenmerken die wijzen op menselijke bonafide natuurlijke Treg 1,2,3,4 (bijv. stabiele demethylering bij de TSDR).

Treg-expansie is voornamelijk uitgevoerd in de vorm van polyklonale celexpansie voor zowel onderzoeks- als therapeutische doeleinden ^5,6,7. De problemen met Teff-besmetting vormen een groot obstakel voor de succesvolle implementatie van Treg-celgebaseerde immunotherapiebenaderingen. Eerdere pogingen om monoklonaal Treg in de literatuur uit te breiden/genereren zijn schaars en hebben geen onderhoud van Treg-kenmerken op de lange termijn aangetoond⁸.

Deze methode is interessant voor iedereen die cellulaire, moleculaire en metabolische eigenschappen van bonafide menselijke Treg bestudeert. Met name het ultrazuivere Treg-product dat door het gebruik van dit protocol wordt gegenereerd, leent zich voor analyses met behulp van genomische benaderingen. Gezien de relatief lage expansiesnelheden die kenmerkend zijn voor menselijke Treg in het algemeen, kan deze methode van beperkt nut zijn voor diegenen die op zoek zijn naar de snelle expansie van enorme aantallen cellen. Gezien de extreem hoge zuiverheid van de Treg die met dit protocol wordt gegenereerd, kunnen kleinere aantallen Treg echter een vergelijkbare of zelfs betere werkzaamheid hebben dan grotere expansies van polyklonale cellijnen die effectorcellen bevatten die het algehele onderdrukkende potentieel van het gegenereerde product beperken.

Protocol

Dit protocol volgt alle institutionele richtlijnen met betrekking tot de ethische uitvoering van onderzoek waarbij gebruik wordt gemaakt van menselijke monsters. Het werken met menselijke cellen en andere producten van menselijk bloed moet ten minste plaatsvinden in een BSL-2-gecertificeerde omgeving volgens ten minste de BLS-2-veiligheidsrichtlijnen.

1. Voorverrijking van menselijke mononucleaire cellen in perifeer bloed voor CD4⁺CD127^totCD25^hi-cellen

LET OP: Gebruik overal een steriele techniek. Gooi scherpe voorwerpen onmiddellijk weg in een geschikte naaldencontainer. Bleekmiddel alles wat in contact is gekomen met bloed en/of bloedproducten voordat u het weggooit. Werk in een bioveiligheidskast.

1. Verkrijg humaan perifeer bloed of bloedproducten die voorverrijkt zijn voor menselijke leukocyten (d.w.z. "leukopak") uit perifere bloedafnames of leukaferese. Verwerk cellen onmiddellijk.
   OPMERKING: Als opslag 's nachts niet kan worden vermeden, bewaar en transporteer de cellen dan bij kamertemperatuur (RT). Vermijd blootstelling aan kou.
2. Isoleer perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) door gradiëntcentrifugatie over dichtheidsgradiëntmedium zoals eerder beschreven⁹.
3. Tel PBMC's zorgvuldig met behulp van een hemocytometer of celteller. Gebruik indien mogelijk ten minste 300 x 10⁶ PBMC om door te gaan met Treg-isolatie.
4. Resuspendeer PBMC's in isolatiebuffer (2% gepoold humaan AB-serum [PHS-AB] met 1,5 mM EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]) in een concentratie van 50 x 10⁶ cellen/ml en ga verder met magnetische sortering volgens de instructies van de fabrikant van de gebruikte sorteerkit. Gebruik bijvoorbeeld magnetische celsortering (Materiaaltabel) voor negatieve isolatie van een CD4⁺CD127^lo T-celpopulatie, gevolgd door positieve selectiesortering voor CD25⁺ -cellen.
   OPMERKING: Een verscheidenheid aan producten kan worden gebruikt voor de magnetische zuivering van Treg, waaronder kolomgebaseerde en kolomvrije benaderingen. Als alternatief kan fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) met gating op CD127^totCD25^hoge CD4⁺ T-cellen worden uitgevoerd. Volledige steriliteit is echter niet mogelijk met standaard FACS-apparatuur, wat een aanzienlijk risico op besmetting met zich meebrengt. Bovendien kunnen cellulaire stress en schade veroorzaakt door het fluïdische systeem niet worden uitgesloten en kunnen de instrumentlasers de resultaten beïnvloeden.
5. Controleer de resulterende Treg-verrijkte populatie op zuiverheid door middel van kleuring op CD4, CD3, CD127 en CD25 (Figuur 1). Kies een anti-humaan CD25-antilichaam dat een ander CD25-bindingsdomein herkent dan het domein dat in de sorteerkit wordt gebruikt, zoals het domein dat is gespecificeerd in de materiaaltabel, om een nauwkeurig resultaat te verkrijgen. Kleuring en fixeer cellen met behulp van een standaard protocol voor oppervlaktekleuring zoals beschreven in Nowatzky et ^al.10.

2. Klonen van Treg van een CD127^totCD25^hi voorverrijkte menselijke CD4⁺ T-celsuspensie

1. Resuspendeer de Treg-verrijkte (CD4⁺CD127^loCD25^hi) cellen verkregen in stap 1.4 in T-celmedia ([TCM]; RPMI 1640, 5% PHS-AB, 1% streptomycine/penicilline, 1% HEPES, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% glutamine) met 300 IE/ml humaan recombinant interleukine-2 (IL-2) (Materiaaltabel) gericht op een concentratie van ~1-3 x 10⁶ cellen/ml en aantal. Verkrijg ten minste drie afzonderlijke celtellingen en bereken het gemiddelde aantal cellen voordat u verder gaat, want nauwkeurige tellingen zijn absoluut cruciaal.
2. Bereid een eencellige suspensie van cellen in twee concentraties: (1) 3 cellen/ml en (2) 6 cellen/ml. Laad vijf platen met ronde bodem van 96 putjes met 100 μl/putje suspensie 1 en vijf platen met suspensie 2. Zorg ervoor dat de cellen in suspensie blijven bij het laden van de platen om een verdeling van respectievelijk 0,3 en 0,6 cellen/put te garanderen.
   OPMERKING: Verhoog de celconcentratie niet tot 1 cel/put, omdat dit het risico op het verkrijgen van oligoklonale cellijnen en niet-echte klonen verhoogt.
3. Bereid feedercellen voor van vers geïsoleerde humane allogene PBMC's die zijn verkregen door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie zoals in stap 1.2.
4. Bereid ten minste 10 x 10⁶ voedingscellen per kloonplaat voor op bestraling door humane allogene PBMC's opnieuw te suspenderen in TCM zonder IL-2 in een polypropyleen buis van 50 ml in een concentratie van ~10 x 10⁶ PBMC/ml. Sluit de buis goed af en bestraal met 35 Gy in een gammastraler of een op röntgenstraling gebaseerd bestralingsapparaat.
   OPMERKING: Bestraling veroorzaakt de afscheiding van grote hoeveelheden cytokinen uit de feeders die de proliferatie van Teff vergemakkelijken, maar de expansie van Treg nadelig kunnen beïnvloeden. Deze worden vervolgens verwijderd door te wassen.
5. Centrifugeer de cellen bij 450 x g en RT gedurende 5 minuten na bestraling en aspireer de supernatant op. Was cellen door ze opnieuw te suspenderen in TCM zonder IL-2 met ten minste 10x het gepelleteerde toevoercelvolume van media/PBS.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een expressieprofiel van humaan leukocytenantigeen (HLA) van de te klonen donorcellen te bepalen. Dit kan worden gedaan door eenvoudige kleuring voor een of meer HLA-typen die veel voorkomen in de populatie waarvan een respectieve donor is afgeleid (d.w.z. HLA-A2 of HLA-A24). PBMC die als feedercellen worden gebruikt, mogen deze HLA niet tot expressie brengen om heridentificatie/isolatie van doelcellen uit expansieculturen mogelijk te maken voorafgaand aan door doorstraling geïnduceerde apoptose van de feeders.
6. Resuspendeer de doorstraalde en gewassen voedingscellen in TCM met 300 IE/ml IL-2 in een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml.
7. Voeg fytohemagglutinine-L (PHA-L) (materiaaltabel) toe in een concentratie van 4 μg/ml (2x de vereiste concentratie in cultuur) en ga snel verder met stap 2.8.
8. Voeg 100.000 bestraalde feedercellen in 100 μL TCM met 4 μg/ml PHA-L en 300 IE/ml IL-2 toe aan de geplateerde Treg-verrijkte cellen, wat resulteert in een totaal volume van 200 μL en een PHA-L-concentratie van 2 μg/ml in elk putje. Meng goed door 5x op en neer te pipetteren. Beperk de blootstellingstijd van de toevoercellen tot PHA-L voordat ze aan de Treg worden toegevoegd tot het absoluut noodzakelijke minimum, en houd ze in suspensie totdat ze verguld zijn.
   OPMERKING: Zorg voor een PHA-L-concentratie van 2 μg/ml in de cultuur bij de eerste zaaistap, maar gebruik een lagere concentratie van 1 μg/ml bij de daaropvolgende expansie van Treg-klonen. Gebruik overal 300 IE/ml IL-2.
9. Incubeer bij 37 °C. Vervang 50% van de media met TCM met 300 IE/ml IL-2 maar zonder PHA-L op dag 5-7.

3. Uitbreiding van Treg en onderhoud van klonen in cultuur

1. Controleer vanaf dag 12 de culturen op de aanwezigheid van pellets van prolifererende cellen.
   OPMERKING: Er zullen pellets worden gevormd door feedercellen, maar bij microscopisch onderzoek zullen die verschijnen als kleine, ronde, stervende of dode cellen, terwijl prolifererende T-cellen groter van formaat zijn, met een helder contrast en een gezond uiterlijk, vaak clusters van aangrenzende cellen vormen die bruin lijken bij macroscopisch onderzoek.
2. Ga door met het onderzoeken van culturen om de 1-2 dagen. Isoleer prolifererende voorlopige klonen door ze over te brengen naar enkele putten. Plaats elke voorlopige kloon op een enkele plaat met 96 putjes om kruisbesmetting van een bepaalde voorlopige of gevestigde kloon te voorkomen door onbedoelde celoverdracht uit andere putten.
3. Onderhoud cellen door middel van 50% mediawisselingen om de 2-3 dagen en splits indien nodig. Houd cellen nauwlettend in de gaten.
   OPMERKING: Het uitstellen van mediawisselingen en splitsing kan cellen schaden en "oversplitsing" kan hun proliferatie stoppen en resulteren in celdood.
4. Restimuleer cellen met bestraalde allogene feeders zoals beschreven in stap 2.3-2.9, maar gebruik lagere PHA-L-concentraties (d.w.z. 1 μg/ml in TCM met 300 IE/ml IL-2). Restimuleer wanneer de celgrootte afneemt en de cellen rond worden, in tegenstelling tot langwerpig ovaal, wat meestal na 2-3 weken is.
   OPMERKING: Behoud de oorspronkelijke klooncultuur gedurende ten minste 6-8 weken. Veel van de 'vroege' klonen die zichtbaar worden op of kort na 2 weken zijn meestal geen echte Treg, maar snel prolifererende niet-Treg/Teff-cellen en hebben meer kans om niet te worden doorgelicht dan 'late' cellen, waarvan sommige meer dan 1 maand nodig hebben om zichtbaar in de kweek te verschijnen.

4. Doorlichting van voorlopige Treg-klonen

1. Begin met het doorlichten van voorlopige klonen zodra ze zijn vermenigvuldigd tot ~1 x 10⁶ cellen voor monoklonaliteit en TSDR-methyleringsstatus.
2. Optioneel kunt u celexpansies vooraf screenen door te kleuren op CD3, CD4, CD127 en CD25 om de interessante te identificeren (d.w.z. CD3⁺CD4⁺CD127^totCD25^hi) voor verdere beoordeling (Figuur 2).
3. Vestig monoklonaliteit door identificatie van de aanwezigheid van een enkele Vβ-keten in het cellulaire product door middel van Vβ-kleuring met behulp van sets in de handel verkrijgbare kleuringsantilichamen (Tabel met materialen; Figuur 3) volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat u ten minste 1 x 10⁶ gebeurtenissen verkrijgt wanneer u monsters op een flowcytometer uitvoert voor een betrouwbare analyse, zodat kleine besmettende populaties kunnen worden gedetecteerd. Gebruik een kleurstof voor levensvatbaarheid.
4. Laat de TSDR-methyleringsstatus op de FOXP3-locus beoordelen door commerciële aanbieders of intern^11,12. Verkrijg ten minste 1 x 10⁵ cellen voor voldoende resultaten.
5. Zodra de identiteit en klonaliteit van Treg zijn bevestigd in stap 4.3 en 4.4, cryopreserveert u de cellen of gebruikt u ze voor downstreamtoepassingen.
   OPMERKING: Alternatieve, maar veel minder betrouwbare doorlichtingsbenaderingen zijn het bepalen van het Treg-fenotype door FACS-kleuringen ^1,10 en in vitro of in vivo onderdrukkingstesten^13,14. Vermijd overmatig vertrouwen op Treg-onderdrukkingstesten¹³. De testen zijn typisch, maar niet uitsluitend, gebaseerd op de cocultuur van Treg in gegradeerde aantallen met responder-T-cellen (d.w.z. PBMC of gezuiverde T-cellen, soms Treg-verarmd) in aanwezigheid van antigeenpresenterende cellen van derden of CD3/CD28 met kleurstofverdunning die proliferatie vertegenwoordigt als uitlezing. Veel van deze testen hebben ernstige beperkingen en kunnen de werkelijke mate van onderdrukking die door Treg wordt gemedieerd, over- of onderschatten. De TSDR-methylatiestatus blijft de meest definitieve/betrouwbare maatstaf voor het Treg-fenotype of "identiteit"^3,15,16. Merk op dat FOXP3 zich op het X-chromosoom bevindt en dat bij vrouwen één X-chromosoom wordt geïnactiveerd door DNA-methylering, wat de resultaten van TSDR-methylatieanalyse beïnvloedt.

5. Cryopreservatie van Treg

OPMERKING: Treg kan langdurig worden bewaard na succesvolle cryopreservatie met DMSO en PHS-AB.

1. Bepaal het aantal cryovials dat nodig is om de cellen in te cryopreserveren. Dit is gelijk aan het totale uiteindelijke volume van de te cryoprezen celsuspensie (in ml), omdat er per injectieflacon 1 ml wordt ingevroren. Voeg een veiligheidsmarge van 10% toe aan dit volume om rekening te houden met verliezen als gevolg van pipetteren/oppervlaktespanning.
   OPMERKING: Cellen kunnen worden gecryopreserveerd in een breed scala aan concentraties, meestal tussen 0,1-100 x 10⁶ cellen/ml.
2. Label de cryovials.
3. Genereer oplossing A (SA): meng 50% RPMI en 50% PHS-AB of humaan plasma. Als plasma wordt gebruikt, centrifugeer dan gedurende 20 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C.
   OPMERKING: Het volume SA moet 75% zijn van het totale uiteindelijke volume van de te cryoperen celsuspensie zoals bepaald in stap 5.1.
4. Genereer oplossing B (SB): meng 60% (v/v) PBS of RPMI en 40% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO).
   OPMERKING: Het volume SB moet 25% zijn van het totale uiteindelijke volume van de te cryopreserveren celsuspensie zoals bepaald in stap 5.1.
5. Koel beide oplossingen af tot 4 °C.
6. Bereid het vriesmedium voor door al het SB te mengen met gelijke delen SA en bewaar op ijs.
7. Draai Treg vanaf stap 4.5 bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig media op en gooi ze weg, en suspendeer cellen in de resterende ijskoude SA en bewaar ze op ijs.
8. Voeg langzaam het gekoelde vriesmedium 1:1 toe aan de cellen die in SA in een grote buis op ijs zijn geresuspendeerd terwijl u de buis schudt.
9. Snel aliquot in cryovials van 1 ml/flesje. Plaats de cryovials onmiddellijk in een kastdoos bij RT en breng ze onmiddellijk over naar een vriezer van -80 °C. Breng na 24 uur over naar vloeistof N₂ .

Resultaten

Succesvolle implementatie van dit protocol zal leiden tot het genereren van stabiele menselijke regulerende T-celklonen en -lijnen.

Voorselectie/voorverrijking van CD4⁺CD127^totCD25^hi-cellen was een eenvoudige methode om een startpopulatie te verkrijgen die de meeste menselijke Treg bevatte (Figuur 1A-C). Niet alle klonen vertoonden een Treg-fenotype. Prescreening van klonen door me...

Discussie

Dit protocol beschrijft de voortplanting van ultrazuivere menselijke regulerende T-cellen door de isolatie, expansie en zorgvuldige doorlichting van cellen die zijn verkregen in een beperkende verdunnings- en feedercelgebaseerde expansiebenadering van Treg-bevattende startpopulaties.

Cruciale stappen in deze aanpak zijn: 1) de keuze van een geschikte startpopulatie. Over het algemeen bevat het CD127^loCD25^{hi-compartiment} van CD4⁺

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Opslag en voorbereiding van media
100x Nonessential amino acids	Gibco	11140-050	Media component
15 mL conical centrifuge tubes (50/zak, pak van 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Media component
25 ml Single Well Pipet Basin	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Conical Centrifuge Tube (25/sleeve)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning	Corning, 30-001-Cl	Media component
CryoTube Vial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 positive selection kit	Stemcell Technologies	18231	Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering
EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (alternatief voor item 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternatieven zijn FACS of MACS column-gebaseerde sortering
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC zuivering uit perifeer bloed van leukafereseproducten; dichtheidsgradiëntmedium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Media component
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, voor UV-excitatie	Thermo Fischer	L-34962	Viabiliteitskleuring
Phytohemagglutinine-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T-cel stimulatie
Recombinant IL-2 (bijv. PROLEUKINâ)	Prometheus		T-cel stimulatie en onderhoud/ Media component
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Media component
Kleurstoffen voor flowcytometrie (Treg fenotypering)	Zie "Opmerkingen"	Zie "Opmerkingen"	Kleurstoffen voor kleuring zijn vermeld in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. In geval EasySep Human CD25 positive selection kit wordt gebruikt, kleuren met 2A3 of BC96 anti-CD25 antilichaam, bijv.: Brilliant Violet 421 anti-human CD25 Antibody (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Controle van expansies op monoklonaliteit
Weefselkweekplaat, 96 Well, U-Bodem met Laag Dampingsdeksel	Corning	353077