Methodenartikel

Een sectie-, coring- en beeldverwerkingshandleiding voor aanschaf en analyse van corticale botmonsters met hoge doorvoer voor Synchrotron Micro-CT

DOI:

10.3791/61081

⸱

12 juni 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten een geologisch (coring) bemonsteringsprotocol om corticale botmonsters van uniforme grootte aan te schaffen voor SRμCT-experimenten vanuit het voorste aspect van menselijke femora. Deze methode is minimaal destructief, efficiënt, resulteert in cilindrische specimens die beeldvormingsartefacten uit onregelmatige monstervormen minimaliseren en microarchitecturale visualisatie en analyse verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bot is een dynamisch en mechanisch actief weefsel dat in structuur verandert gedurende de menselijke levensduur. De producten van het botremodelleringsproces zijn aanzienlijk bestudeerd met behulp van traditionele tweedimensionale technieken. Recente vooruitgang in röntgenbeeldvormingstechnologie via desktop micro-computed tomografie (μCT) en synchrotronstraling micro-computertomografie (SRμCT) hebben de aanschaf mogelijk gemaakt van driedimensionale (3D) scans met hoge resolutie van een groter gezichtsveld (FOV) dan andere 3D-beeldvormingstechnieken (bijv. SEM) die een vollediger beeld geven van microscopische structuren in menselijk corticale bot. Het monster moet echter nauwkeurig worden gecentreerd binnen de FOV om het uiterlijk te beperken van streepartefacten waarvan bekend is dat ze van invloed zijn op gegevensanalyse. Eerdere studies hebben gemeld inkoop van onregelmatig gevormde rechtlijnige botblokken die resulteren in beeldvorming artefacten als gevolg van ongelijke randen of beeldverloop. We hebben een geologisch bemonsteringsprotocol (coring) toegepast om corticale botkernmonsters van consistente grootte aan te schaffen voor SRμCT-experimenten vanuit het voorste aspect van menselijke femora. Deze coring methode is efficiënt en minimaal destructief voor weefsel. Het creëert uniforme cilindrische monsters die beeldvormingsartefacten verminderen door isometrisch te zijn tijdens rotatie en een uniforme padlengte bieden voor röntgenstralen tijdens het scannen. Beeldverwerking van röntgentomografische gegevens van cored en onregelmatig gevormde monsters bevestigt het potentieel van de techniek om visualisatie en analyse van corticale botmicroarchitectuur te verbeteren. Een doel van dit protocol is om een betrouwbare en herhaalbare methode te leveren voor de extractie van corticale botkernen die kan worden aangepast voor verschillende soorten botbeeldvormingsexperimenten met hoge resolutie. Een overkoepelend doel van het werk is om een gestandaardiseerde corticale botaankoop voor SRμCT te creëren die betaalbaar, consistent en eenvoudig is. Deze procedure kan verder worden aangepast door onderzoekers op verwante gebieden die vaak harde composietmaterialen evalueren, zoals in de biologische antropologie, geowetenschappen of materiaalwetenschappen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met recente vooruitgang in beeldvormingstechnologie is het nu haalbaar om röntgenbeeldgegevens met een zeer hoge resolutie te verkrijgen. Desktop micro-CT (μCT) systemen zijn de huidige standaard voor imaging cancellous bot vanwege hun niet-destructieve aard1. Bij het in beeld brengen van microstructurele kenmerken van corticale bot is het gebruik van μCT echter beperkter geweest. Vanwege resolutiebeperkingen kunnen desktopsystemen niet de resolutie bereiken die nodig is om microstructurele functies kleiner te maken dan corticale poriën, zoals osteocytenlacunee. Voor deze toepassing is SRμCT ideaal vanwege de grotere resolutie van deze systemen1. Experimenten bij de Canadian Light Source (CLS) op de BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) beamlines2 hebben bijvoorbeeld beelden opgeleverd met braaksel tot 0,9 μm. Eerdere studies1,3,4,5 hebben deze resolutie gebruikt om projecties en daaropvolgende driedimensionale (3D) renders van corticale botmonsters uit menselijke lange botten te verkrijgen ( figuur1) om de osteocyten lacunairedichtheid 4,6,7, 8,9 en variatie in de lacunaire vorm en grootte3 over de menselijke levensduur en tussen de geslachten te kwantificeren. Verdere studies hebben de aanwezigheid van osteon banding bij mensenaangetoond 10, een fenomeen dat eerder werd erkend als geassocieerd met alleen niet-menselijke zoogdieren in de forensische antropologische literatuur.

Om een uitzonderlijke resolutie te bereiken, moet de röntgenstraal fijn worden scherpgesteld binnen het gezichtsveld (FOV), waardoor de maximale monstergrootte vaak beperkt blijft tot een paar millimeter in diameter. Momenteel zijn er geen uitgebreide, gestandaardiseerde procedures beschreven in de literatuur waarin botmonsteraankopen worden beschreven die aan deze beperkingen voldoen. Het centreren van specimens binnen de FOV is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat 1) het monster gecentreerd blijft terwijl het 180° draait tijdens de beeldvorming, en 2) scanartefacten zijn beperkt omdat er geen beeldverloop is. Met andere woorden, geen delen van het monster buiten de FOV interfereren met de straal die zijn brandpunt in de FOV binnendringt. Als dit gebeurt, wordt het reconstructiealgoritme beroofd van enkele van de dempingsgegevens die nodig zijn voor een volledig correcte reconstructie. Het is verder vermeldenswaardig dat 360° (volledige rotatie) scans de effecten van straalverharding minimaliseren, maar artefacten verhogen die worden veroorzaakt door verkeerde uitlijning en monsterbeweging tijdens beeldvorming. Hoewel een 360°-scan doorgaans schonere gegevens genereert, wordt de beeldtijd verdubbeld en moet dus een compromis tussen experimentele kosten en gegevenskwaliteit worden aangepakt.

Een belangrijk en vaak over het hoofd gezien aspect van botbeeldvormingsexperimenten is de nauwkeurige en reproduceerbare specimenvoorbereidingstechniek die voorafgaand aan het scannen wordt uitgevoerd. Studies die SRμCT-methoden in hun experimenten opnemen, vermelden kort hun bemonsteringsprotocol, maar de auteurs geven weinig tot geen details over de specifieke methodologie die wordt gebruikt om hun specimens te verzamelen. Veel van dergelijke studies vermelden het snijden van rechtlijnige botblokken van willekeurige afmetingen, maar geven over het algemeen geen verdere informatie over de gebruikte gereedschappen of inbeddingsmaterialen3,4,10,11,12,13,14. Sommige onderzoekers gebruiken vaak handheld roterende gereedschappen (bijv. Dremel) om rechtlijnige botblokken uit een interessegebied te verwijderen (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Deze methode resulteert in niet-uniforme monsters die groter kunnen zijn dan de FOV, waardoor de kans op scanartefacten en beeldverloop toeneemt. Dergelijke exemplaren vereisen vaak verdere raffinage met behulp van een precisie diamantwafelzaag (bijv. Buehler Isomet). Het verkrijgen van monsters met consistente afmetingen (tot de twee honderdsten/mm) is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de verworven gegevenssets van de hoogste kwaliteit zijn en de daaropvolgende resultaten reproduceerbaar zijn.

De beperkte rapportage van de steekproefaankoopmethodologie voegt een extra moeilijkheidslaag toe bij het gebruik en/of valideren van methoden die in een eerdere studie zijn uitgevoerd. Momenteel moeten onderzoekers rechtstreeks contact opnemen met auteurs voor meer informatie over hun bemonsteringsprocedures. Het protocol dat hier wordt beschreven, biedt biomedische onderzoekers een grondig gedocumenteerde, reproduceerbare en kostenefficiënte bemonsteringstechniek. Het primaire doel van dit artikel is om een uitgebreide tutorial te geven over het verkrijgen van consistent formaat corticale botkernmonsters met behulp van een freespers en diamantkorf voor de nauwkeurige visualisatie en extractie van microarchitectuurgegevens. Deze methode wordt gewijzigd van procedures die worden gebruikt om routinematig uniforme cilinders met een kleine diameter (1-5 mm) te verzamelen uit blokken harde materialen in hogedrukgesteentemechanica15,16,17,18,19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle exemplaren zijn afkomstig van gebalsemde kadaverdonoren aan de Universiteit van Toledo, het College of Medicine and Life Sciences en de Northeast Ohio Medical University (NEOMED), met de geïnformeerde toestemming van de donor zelf of de nabestaanden van de donor. De Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) van de Universiteit van Akron achtte deze specimens vrijgesteld van volledige IRB-beoordeling omdat ze niet werden verkregen van levende personen. Demografische informatie, waaronder leeftijd, geslacht en doodsoorzaak, was beschikbaar voor alle donoren. De geselecteerde personen hadden geen botbelichte aandoeningen gedocumenteerd, noch blootstelling aan behandelingsregimes die de botremodellering op het moment van overlijden kunnen hebben beïnvloed. Corticale botmonsters werden verkregen uit femora van kadaver moderne mannen en vrouwen met leeftijden variërend van 19 tot 101 jaar oud (gemiddelde = 73,9 jaar). De femorale middenas is uitgebreid bestudeerd, inclusief onderzoeken naar variatie in corticale porositeit20,21,22,23,24 en materiaaldichtheid van botweefsel25,26,27, en is zo een veelgebruikte site geworden voor microstructurele analyses.

1. Weefselaankopen en maceratie

  1. Gebruik een oscillerende zaag uitgerust met een dompelsnijcarbideblad (voor composietmaterialen) om ~7,5 cm botblokken van de middendiafysen van de linker femora aan te schaffen.
  2. Week femurblokken in een ovenveilige glazen schaal gevuld met een protease-enzym in poedervorm en kraanwateroplossing gedurende 1 uur in een incubator op 45 °C.
  3. Verwijder na incubatie voorzichtig alle resterende zachte weefsels en periosteum met behulp van stompe dissectie of tandheelkundige hulpmiddelen.
    OPMERKING: Vermijd het gebruik van scherp gereedschap (bijv. scalpel) om zachte weefsels te verwijderen. Dergelijke instrumenten kunnen schade aan het bot veroorzaken die detecteerbaar is in μCT-scans, wat van invloed is op het behoud van monsters en de kwaliteit van de scangegevens.
  4. Verwijder vuil of occlusies in de medullaire holte door botblokken gedurende 5-10 minuten in een ultrasone reiniger te plaatsen met 20:1 delen kraanwater tot reinigingsoplossing (zie Tabel met materialen)of met behulp van een handbediende waterflosser (bijv. Waterpik).
  5. Dompel het botblok onder in een monsterbeker en vul met 70% ethanol. Laat het bot minstens 24 uur weken om lipiden te verwijderen.
    OPMERKING: Xyleen kan ook worden gebruikt om lipiden te verwijderen. Langdurig weken in xyleen kan het bot echter broos of krijtachtig maken omdat het een emulgator is.
  6. Verwijder na 24 uur botblokken uit ethanol en laat 24-48 uur aan de lucht drogen bij omgevingstemperatuur.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. Weefseldoorsnede

  1. Plaats een glazen microscoopschuif van 75 x 25 mm op een kookplaat die is ingesteld op 140 °C. Smelt een royale hoeveelheid thermische epoxyhars (zie Materialentabel)in het midden van de dia.
    1. Bij het voorbereiden van extra dunne delen voor microscopie (<50 μm), moet het botblok mogelijk worden ingebed in een tweedelige epoxy om trabeculae te behouden. Verder is bij de implementatie van dit protocol voor kwetsbare specimens (bijv. diagenetisch bot of sterk trabecularized specimens) het insluiten van specimens in een epoxy noodzakelijk.
      OPMERKING: Botmonsters die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgehaald uit gebalsemde kadavermonsters. Als nieuwe monsters worden verzameld bij autopsie of uit een chirurgisch geval om zachte weefselstructuren (bijv. vasculatuur) via SRμCT te onderzoeken, kan impregnatie met epoxy schade aan dergelijke weefsels veroorzaken. In deze gevallen wordt een alternatief lijm- of montagemedium aanbevolen (bijv. dubbelzijdige tape, modelleringsklei).
  2. Druk het inferieure aspect van het botblok in de thermische epoxyhars op de microscoopschuif, met de lengte van het bot loodrecht op de dia. Schuif het monster heen en weer om de onderkant van het bot te bedekken en een veilige hechting aan de glijbaan te garanderen.
  3. Laat het gemonteerde monster ~5 minuten op de kookplaat rusten om de thermische epoxy in poriën en/of scheuren te laten afdekken.
    OPMERKING: De epoxy op de glijbaan moet vrij zijn van bubbels voor de beste hechting. Als u bellen wilt verwijderen, verplaatst u het monster heen en weer op de dia. Bubbels ontstaan vaak doordat water en/of ethanol in het bot ontsnappen en verdampen.
  4. Verwijder de glijbaan met het gemonteerde monster met stompe tang van de kookplaat en laat ~10 minuten afkoelen op kamertemperatuur. Verwijder epoxy van de rand van de glijbaan met behulp van een scheermesje om ervoor te zorgen dat de boorkop de glijbaan voldoende vastgrijpt.
  5. Bevestig de glijbaan met het aangehingen monster aan een glazen schuifkop en monteer de boorkop aan de draaiarm van een doorsnedezaag met lage snelheid (zie Tabel met materialen, figuur 2).
    OPMERKING: Terwijl een Buehler IsoMet-zaag in dit protocol werd gebruikt, zijn er andere precisiesectiezagen beschikbaar die kunnen worden gebruikt in plaats van de IsoMet (bijv. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Stel de draaiarm in met behulp van de positioneringsknop om ervoor te zorgen dat het mes in contact komt en het monster doorsnijdt. Plaats het monster zodanig dat een doorsnede van het bot loodrecht op de lengte wordt gesneden.
  7. Voeg gewichten toe aan de andere kant van de snijarm om het gewicht van de arm tegen te gaan.
    OPMERKING: Als er onvoldoende contragewicht wordt gebruikt, kan het monster op het mes vallen en ervoor zorgen dat het mes breekt.
  8. Voeg snijvloeistof (20:1 delen water aan snijvloeistof) toe aan de vloeistofreservoir van de zaag.
  9. Bevestig het diamantwafelblad stevig en zorg ervoor dat het vloeistofniveau het snijgedeelte van het mes onderdompelt. Stel de snelheid in op 200 RPM en laat het monster langzaam op het zaagblad zakken (afbeelding 3).
  10. Zorg ervoor dat het mes en de klauwplaat niet wiebelen en/of stuiteren. Als er overmatige beweging wordt opgemerkt, stop dan onmiddellijk de zaag en draai het mes en/of de boorarm vast voordat u het zagen hervat. Voeg extra contragewichten toe als de boorkop agressief op en neer beweegt. Overmatige beweging, inclusief zichtbare zijwaartse beweging, kan ervoor zorgen dat het mes breekt.
  11. Het eerste dikke gedeelte is een 'afvalsnede' om een goed gedefinieerd oppervlak te bieden dat evenwijdig is aan elke extra snede. Breng na de eerste afvalsnede de draaiarm omhoog en beweeg de boorkop 5 mm naar het zaagblad met behulp van de positioneringsknop. Verdere dikke secties (~1 mm) voor microscopie kunnen verder met deze methode worden verzameld.
    OPMERKING: Om waardevol weefsel te besparen, kan de afvalsnede worden weggelaten. Bij het doorsnijden van een monster met een ongelijke rand is het echter van cruciaal belang dat de piek van het monster tangentiaal op de rand van de boor wordt opgesteld.
    1. Zorg ervoor dat u rekening houdt met de kerf van het zaagblad tijdens het doorsneden. Om bijvoorbeeld een gedeelte van 5 mm te krijgen van een mes met een kerf van 0,5 mm, beweegt u het monster en boort u 5,5 mm naar het zaagblad.
  12. Nadat het doorsneden is voltooid, plaatst u de glazen schuif met het gemonteerde monster op een kookplaat om de thermische epoxy te smelten. Dit maakt het mogelijk om botblokken snel van de glijbaan te verwijderen.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. Monster coring

  1. Monteer 5 mm botdelen aan de onderkant van een ondiep aluminium blik (~ 8 cm in diameter) met behulp van de thermische epoxybindingstechniek zoals beschreven in stap 2.2-2.4.
  2. Plaats tin op een XY-machinetafel van de freespers (zie Materialentabel)en draai de bevestigingsklemmen met de hand vast (figuur 4).
  3. Plaats de met diamant getipte koringboor van de binnendiameter van 2 mm binnendiameterjuwelen (zie Tabel met materialen)in de boorkop van de frees. Stel de dieptebegrenzer in om te voorkomen dat er door het blik wordt gesnijverd (afbeelding 5).
  4. Lijn het centrale voorste aspect van het botmonster onder de boor uit terwijl u nauw contact met het periosteum, endosteum of sterk getacculariseerde gebieden vermijdt.
    OPMERKING: Geautomatiseerde selectie van mid-anterior femorale cortices is niet haalbaar omdat corticale dikte varieert tussen individuen, vooral met toenemende leeftijd.
  5. Vul het blik met gedestilleerd water om het monster volledig te bedekken. Dit voorkomt warmteophoping, verbranding van het monster en/of beschadiging van de boor tijdens het coring.
    OPMERKING: Om de mogelijkheid van warmteschade veroorzaakt door coring te beoordelen, werd een infraroodthermometer gebruikt om temperatuurmetingen van het gedestilleerde water te bereiken, omdat de koringbit voor het eerst het oppervlak van de botten binnendrong. De temperatuur varieerde met 1 °C, van 22,9 – 23,9 °C van de tien monsters die voor deze test waren gecorreleerd. Daarom stellen wij dat warmte-geïnduceerde schade verwaarloosbaar is.
  6. Oefen in de eerste paar gevallen van contact tussen de kernbit en het bot zachte druk uit om een ring op het superieure oppervlak van het bot te dragen. Dit voorkomt doorbuiging van de boor aan het begin van het coringproces en zorgt voor een juiste plaatsing van de bit.
  7. Til tijdens het korven de boor in en uit het monster terwijl u de punt van de boor onder het wateroppervlak houdt. Ga om de paar seconden door met deze techniek om opgesloten botstof weg te spoelen en ervoor te zorgen dat vuil de boor niet verstopt.
    OPMERKING: Als de kern een conische vorm vormt, is dit waarschijnlijk te wijten aan 1) waardoor er onvoldoende tijd is om botstof uit de koringbit te spoelen, en 2) er te snel coring optreedt. Verhoogde snelheid kan grote stukken van het monster afbreken en het superieure aspect verpulveren.
  8. Nadat de kern is voltooid, kan de resulterende botkern in de holle boor worden geplaatst (figuur 6). Gebruik een fijne tang of een kleine inbussleutel om de kern van de bit los te maken (figuur 2).
  9. Bewaar het kernmonster in een gelabelde microcentrifugebuis op een koele en droge plaats tot de afbeelding.

4. Beeldverwerkingsroutines voor het evalueren van botmicroarchitecturale parameters van corticale botkernen

  1. Reconstructie van μCT-beelden
    1. Download en installeer de nieuwste NRecon-versie op https://www.bruker.com/products/microtomography.html voor reconstructie van de SRμCT-projectiebeelden.
    2. Selecteer de snelkoppeling NRecon op het bureaublad en de bijbehorende GPUReconServer wordt weergegeven.
    3. Open de gewenste gegevensset in het pop-upvenster. Als het venster niet wordt weergegeven, selecteert u het mappictogram in de linkerbovenhoek van het dataviewervenster.
    4. Selecteer de eerste projectie uit de SRμCT-acquisitie. Verwijder onder Uitvoerde selecties voor ROI en schalen gebruiken AAN.
    5. Kies de bestemming van het reconstructiebestand. Selecteer Bladeren en maak een nieuwe map met de naam Recon. De geselecteerde bestandsindeling moet BMP(8) zijn.
    6. Controleer compensatie voor verkeerde uitlijning.
      OPMERKING: Deze schatting is vaak bijna correct. De ruwe 3D-render kan handmatig worden aangepast door de pijlen op en neer te bewegen om de overlappende afbeeldingen te verschuiven, zodat de rechter- en linkerranden zo dicht mogelijk op elkaar worden uitgelijnd.
    7. Kies onder Instellingende gewenste selecties om vloeiendheid, straalverharding, CS-rotatie, object groter dan FOV en ringartefacten-algoritmentoe te passen.
    8. Pas het histogram aan onder Uitvoer door Autote selecteren.
      OPMERKING: Het resulterende beeld kan zwak zijn.
    9. Selecteer Start om te beginnen met het verwerken van de reconstructie.
    10. Gebruik standaardnomenclatuur voor kanaal/osteocyten lacunaire indexcijfers28. Deze kunnen zijn: totaal VOI-weefselvolume (TV), kanaalvolume (Ca.V), totaal aantal kanalen (Ca.N), gemiddelde kanaaldiameter (Ca.Dm), corticale porositeit (Ca.V/TV), gegeven als percentage, totaal aantal lacunes (N.Lc) en gemiddeld lacunair volume (Lc.V), onder andere. Om de lacunaire dichtheid per mm3 (N.Lc/BV) te bepalen, wordt het botvolume (BV) berekend als totaal volume minus kanaalvolume (TV-Ca.V).
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  2. Verzameling van microarchitectuurgegevens uit gereconstrueerde afbeeldingen
    1. Download en installeer de nieuwste versie van CTAnalyser op https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html voor analyse van microarchitecturale parameters.
      OPMERKING: De gratis versie van CTAnalyser is beperkt in functionaliteit. Daarom wordt aanbevolen om een volledige licentie aan te schaffen om meer gedetailleerde analyses uit te voeren.
    2. Onder Afbeelding | Eigenschappen | Pixelgrootte wijzigen,zorg ervoor dat de pixelgrootte overeenkomt met die van het toegepaste μCT-beeldvormingsprotocol.
      OPMERKING: Als u afbeeldingen bewerkt in ImageJ of een vergelijkbaar programma, moet u er rekening mee houden dat bij het opslaan de header die in het TIFF-bestand is ingesloten, wordt gewijzigd en dat de analysesoftware de pixelgrootte wijzigt bij het importeren van de gegevensset.
    3. Selecteer Aangepaste verwerking om een takenlijst te maken (zie Aanvullende materialen) om de botmicroarchitectuur uit de scangegevensset te analyseren. Een algemeen protocol voor osteocyten lacunaire netwerkparameters met behulp van plug-ins die eigendom zijn van CTAnalyser volgt hier:
      OPMERKING: De takenlijst voor plug-ins werkt goed voor gegevenssets waarbij het voorbeeld het enige onderwerp is dat zichtbaar is in de FOV. Als lege ruimte het monster omringt, is de toepassing van een ROI vereist. Anders worden de waarden die zijn verzameld in 3D-analyse en individuele objectanalyse kunstmatig verlaagd.
      1. Laad de afbeeldingen opnieuw om eventuele wijzigingen (bijv. van bewerking in ImageJ of iets dergelijks) opnieuw in te stellen en/of aan te passen voordat u het menu Aangepaste verwerking in de analysesoftware opent.
      2. Om ruis in de beelden te verminderen, past u een Gaussian low-pass filter toe in 3D-ruimte met een ronde kernel en een straal van 2-3.
        OPMERKING: Deze instellingen werden toegepast op datasets van de gerapporteerde SRμCT-experimenten door middel van trial and error testing. Het doel was om reconstructies van de beste kwaliteit voor de gegevens te verkrijgen. Pas de reconstructie-instellingen aan voor elke unieke experimentele opstelling.
      3. Pas een globale grijswaardendrempel toe op de afbeeldingen door lage en hoge waarden te selecteren om vasculaire kanalen te markeren. De gereconstrueerde segmenten in figuren 8B en 8D geven een voorbeelddrempel van 0-155 weer.
        OPMERKING: Net als bij stap 4.2.3.2 zijn de hier toegepaste drempelwaarden gekozen door uitgebreide trial and error. De drempelwaarden moeten worden aangepast voor elk gebruikt experimenteel installatie- en μCT-beeldvormingssysteem.
      4. Despeckle (denoise) om witte spikkels in de 3D-ruimte te verwijderen die zich binnen het volumetrische pixel (voxel) groottebereik van osteocytenlacunee bevinden om alleen kanalen te isoleren.
        OPMERKING: Voor een SRμCT-scan van menselijk corticale bot met een pixelgrootte van 0,9 μm is de ondergrens voor osteocytenlacunes 13 voxels.
      5. Despeckle om zwarte spikkels in de 2D-ruimte te verwijderen om artefacten in de grachten te verwijderen. Deze kunnen vrij groot zijn in 2D, dus verwijder functies die <15.000 pixels zijn.
      6. Verwijd de poriën in de 3D-ruimte met behulp van de morfologische operatiefunctie met een ronde kernel van 2 of 3 radius, afhankelijk van de kwaliteit van de beelden, om alle zachte weefsels die in kanalen zijn opgesloten te isoleren.
      7. Voer een extra Despeckle-functie uit met dezelfde instellingen als stap 4.2.3.5. om geïsoleerde zachte weefsels in kanalen te verwijderen.
      8. Eroderen van de dilatatie van stap 4.2.3.6. met behulp van een morfologische bewerkingsfunctie met behulp van een ronde kernel met een straal van 2 of 3. De straal voor deze stap moet overeenkomen met de straal die wordt gebruikt in procedure 4.2.3.6.
      9. Voer 3D-analyse uit en selecteer welke parameters u wilt berekenen voor het volume van vasculaire kanalen. Over het algemeen zullen de basiswaarden voldoende informatie opleveren.
      10. Sla de verwerkte afbeeldingen op met Bitmaps opslaan in een aangepaste submap in de map.
        OPMERKING: Als u een 3D-reconstructieafbeelding maakt van de verwerkte afbeeldingen met behulp van een programma zoals Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti, enz., wordt het aanbevolen om de afbeeldingen op te slaan als monochroom (1 bit).
      11. Bereken het aantal vasculaire kanalen en beschrijf hun grootte, vorm en oriëntatie met behulp van de functie Individuele objectanalyse.
      12. Herhaal stap 4.2.3.1 – 4.2.3.3. om de afbeelding opnieuw in te stellen voor osteocyten lacunaire analyse.
      13. Verwijder witte spikkels in de 3D-ruimte met behulp van de Despeckle-functie, zodat dergelijke artefacten kleiner zijn dan de ondergrens van lacunaire grootte. Deze stap verwijdert ruis uit de scan die corticale poriën lijken te zijn, met behoud van echte osteocytenlacunes. Voor menselijke SRμCT-scans van 0,9 μm pixelgrootte is deze ondergrens 13 voxels.
      14. Despeckle nogmaals om witte spikkels te verwijderen die groter zijn dan de bovengrens van lacunaire grootte. Voor menselijke SRμCT-datasets met de instellingen in stap 4.2.3.13 is deze limiet 2743 voxels.
      15. Voer 3D-analyse uit om microstructurele informatie met betrekking tot de osteocytenlacunae specifiek te extraheren.
      16. Selecteer Bitmaps opslaan om de verwerkte afbeeldingen op te slaan om de osteocytenlacunee te isoleren.
      17. Voer individuele objectanalyse uit om het aantal osteocyten in 3D te berekenen binnen het geselecteerde Volume of Interest (VOI).
        OPMERKING: Zodra de takenlijst is opgesteld en getest, heeft CTAnalyser een batchmanagerfunctie (BatMan) die kan worden gebruikt om de gegevensextractie te versnellen en een uniforme beeldverwerking te garanderen. Een takenlijst met voorbeeldinstellingen voor procedure 4.2.3. zijn te vinden in de Aanvullende Materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschreven methode van kernbemonstering bleek zeer doeltreffend en efficiënt te zijn. Coring monsters met behulp van dit protocol toegestaan voor de aankoop van >300 consistent formaat monsters voor experimenten op de CLS BMIT-BM beamline2,met een FOV van ~ 2 mm bij 1,49 μm voxel grootte. Om de consistentie van de kerndiameter te valideren, werden drie metingen uitgevoerd over de lengte (boven, midden, onder) van een deelverzameling van menselijke voorste femurkernen (n=69). De gemidde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is geen uitgebreid, gestandaardiseerd protocol voor de aanschaf van uniforme en cilindrische corticale botkernmonsters voor SRμCT-beeldvorming met hoge resolutie met beperkte FOV-opstellingen. Het protocol dat hier wordt beschreven, vult die leegte op door een uitgebreide zelfstudie te geven over het verkrijgen van consistent formaat corticale botkernmonsters voor SRμCT-beeldvorming en de daaropvolgende nauwkeurige visualisatie en extractie van microarchitectuurgegevens. We hebben aangetoond dat ons protocol een meer ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het in dit artikel beschreven onderzoek werd uitgevoerd in de BMIT-faciliteit van de Canadian Light Source, die wordt ondersteund door de Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, de University of Saskatchewan, de regering van Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, de National Research Council Canada en de Canadian Institutes of Health Research. De auteurs willen de beamline-wetenschappers van de Canadese lichtbron, met name Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov en Ning Zu, bedanken voor de hulp bij het opzetten en oplossen van problemen met de SkyScan SRμCT- en witstraalmicroscoopsystemen. We willen ook Beth Dalzell van het University of Toledo College of Medicine and Life Sciences en Dr. Jeffrey Wenstrup van de Northeast Ohio Medical University bedanken voor de toegang tot kadavermonsters voor deze studie. JM Andronowski wordt ondersteund door start-up onderzoeksfondsen van de Universiteit van Akron en een National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes grant (2018-DU-BX-0188). RA Davis wordt ondersteund door een graduate assistantship van de Universiteit van Akron. Apparatuur en benodigdheden die worden gebruikt voor het zagen en zagen werden gekocht door startfondsen van de Universiteit van Akron en NSF-subsidie EAR-1624242 aan CW Holyoke.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-1/8" duiksnijcarbide voor composietmaterialenWarrior6181228.6mm duiksnede
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liter
Blunt-tiptangenFisher Scientific10-300
Centrifuga-buizenThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download en installeer op https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Tandheelkundig gereedschapssetAmazon787269885110
Diamantzaagbladen voor composietmateriaalBuehler#11-4247
BoorpersJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop boorpersen zijn geschikte alternatieven, maar hebben doorgaans geen verplaatsbare machinetafel voor het positioneren van monsters onder de boorstengel
Fijn-tiptangenFisher Scientific22-327379
Bevestigingsklemmen voor XY-machinetafel voor frezen/borenMSC Industrial Supply#04804571
Glazen microscoopglazenTed Pella2600575x50mm glazen, 1mm dik
Glazen schuifklauwkast voor microscopenBuehler#112488Groot genoeg om 75x50mm glazen te houden
Heetplaat die 140 °C kan bereikenThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut vloeistofBuehler111193032Smeermiddel; 30mL
Juweliers diamant boorstangOtto Frei#119.0502mm binnendiameter holle kernboor
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Download en installeer op https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillerende zaagHarbor Freight62866
Ovenbestendige glazen schalenPyrex1117715Glazen voedselopslagcontainer
Precisie langzame zaag (Isomet 1000)Buehler111280160
MesjesAmazon25181
Ondiepe aluminium blikkenAmazonB01MRWLD0R~8cm diameter
MonsterbekersAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme reinigingsmiddelAlconox1304-11.8kg doos
Ultrasoon reinigingsapparaatMTI CorporationKJ201508006

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691(2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420(2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210(1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Winning van corticaal botbotkernbiopsiesectie en boringhigh throughput analysepreparatie van botmonstersreductie van micro CT artefactencilindrische botmonstersanalyse van botmicroarchitectuur

Gerelateerde artikelen