Methodenartikel

Model van ischemische hartziekten en video-gebaseerde vergelijking van Cardiomyocyte Contractie met behulp van hiPSC-afgeleide Cardiomyocyten

15.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61104

⸱

5 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een model van ischemische hartziekten met behulp van cardiomyocyten afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, samen met een methode voor kwantitatieve evaluatie van weefselschade veroorzaakt door ischemie. Dit model kan een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.

Samenvatting

Ischemische hartziekte is een belangrijke doodsoorzaak wereldwijd. Het is daarom het onderwerp geweest van een enorme hoeveelheid onderzoek, vaak met kleine diermodellen zoals knaagdieren. Echter, de fysiologie van het menselijk hart verschilt aanzienlijk van die van het knaagdier hart, onderstrepen de noodzaak van klinisch relevante modellen om hart-en vaatziekten te bestuderen. Hier presenteren we een protocol om ischemische hartziekten te modelleren met behulp van cardiomyocyten die zich onderscheiden van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPS-CMs) en om de schade en functionele aantasting van de ischemische cardiomyocyten te kwantificeren. Blootstelling aan 2% zuurstof zonder glucose en serum verhoogt het percentage gewonde cellen, wat wordt aangegeven door kleuring van de kern met propidiumjodide, en vermindert de cellulaire levensvatbaarheid. Deze voorwaarden verminderen ook de contractiliteit van hiPS-CMs zoals bevestigd door verplaatsingsvectorveldanalyse van microscopische videobeelden. Dit protocol kan bovendien een handige methode bieden voor gepersonaliseerde screening van geneesmiddelen door het gebruik van hiPS-cellen van individuele patiënten te vergemakkelijken. Daarom kan dit model van ischemische hartziekten, gebaseerd op iPS-CMs van menselijke oorsprong, een nuttig platform bieden voor screening van geneesmiddelen en verder onderzoek naar ischemische hartziekten.

Inleiding

Ischemische hartziekten (IHD) wordt wereldwijd erkend als de belangrijkste doodsoorzaak, en het werd geschat op verantwoordelijk zijn voor meer dan negen miljoen dodelijke slachtoffers in 20161. De prevalentie van hart-en vaatziekten blijft stijgen, en de globalisering lijkt te hebben bijgedragen aan de prevalentie van hart-en vaatziekten risicofactoren in ontwikkelingslanden. Daarom wordt de studie van IHD steeds urgenter2.

Experimentele modellen van hart-en vaatziekten zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van de mechanismen van de ziekte, de nauwkeurigheid van de diagnose, en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Verschillende experimentele modellen zijn voorgesteld door vele laboratoria. Het is van het grootste belang om een model te kiezen met aanzienlijke voordelen; haalbaarheid, herhaalbaarheid en gelijkenis met menselijke ziekte zijn belangrijke factoren bij de selectie van modellen voor hart- en vaatziekten3. Door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (hiPSC's) met specifieke cardiomyopathie-geassocieerde mutaties zijn een veelbelovend alternatief voor diermodellen4. Hoewel veel strategieën zijn beschreven voor het induceren van cardiomyocyten met behulp van iPSCs5,6,7,8,9, hier bieden we een eenvoudige methode om een IHD-model te produceren met behulp van cardiomyocyten onderscheiden van hiPSC's, waarin moeizame selectie van cardiomyocyte met behulp van markers wordt niet toegepast. In deze methode worden cardiomyocyten functioneel geselecteerd door spontane samentrekking te analyseren.

Inductie van cardiomyocyten met behulp van hiPSC's voorkomt het opofferen van dieren en technisch moeilijke chirurgie. Het opzetten van diermodellen van IHD vereist uitdagende chirurgische technieken10. Het perfect simuleren van de verschillende pathofysiologische aspecten van menselijke hartziekten, zoals hartslag en actiemogelijkheden uit de fysiologie van knaagdieren, is bijna onmogelijk. In combinatie met de moraal en ethiek van het gebruik van diermodellen, is de ontwikkeling van andere experimentele experimentele modellen dan diermodellen noodzakelijk. Cardiomyocyten onderscheiden van menselijke iPS cellen beter na te bootsen de fysiologische toestand van het menselijk hart. In dit protocol stellen we een model van IHD op met behulp van cardiomyocyten afgeleid van hiPS-cellen (hiPS-CMs). In ons model leidt de ontbering van zuurstof en glucose tot een afname van de contractiele kracht en levensvatbaarheid van hiPS-CMs. Onze methode biedt een nieuwe benadering van model IHD en toont een nieuw platform voor de studie van deze ziekte.

Protocol

1. hiPSC onderhoudscultuur

  1. Coat een zes-goed cultuur plaat met laminine (Tabel van materialen).
    1. Verdun laminine tot 0,5 μg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg verdunde laminine toe aan een zes-put plaat met een volume van 2,0 mL/put.
    3. Incubeer de plaat op 37 °C gedurende 30 minuten.
  2. Verwijder de laminineoplossing uit de putten.
  3. Zaad hiPSC's in 2 mL iPSC-onderhoudsmedium(Tabel van materialen) op de gecoate putten bij een dichtheid van 3 × 104 cellen/goed zonder het oppervlak te drogen.
  4. Subcultuur de hiPSC's.
    1. Bereid 0,5× celdissociatie enzymen(Tabel van materialen)oplossing.
      1. Meng 10 μL ethylenediaminetetraacetic (EDTA) en 10 mL PBS tot 0,5 mM EDTA/PBS.
      2. Verdun 10 mL van 1× celdissociatieenzymen tot 0,5× door toevoeging van 10 mL 0,5 mM EDTA/PBS.
    2. Aspirate het gebruikte medium uit de putten.
    3. Voeg 2 mL/put PBS toe om de cellen te wassen en gooi de PBS weg.
    4. Voeg 800 μL van de 0,5× celdissociatieen toe en broed de cellen gedurende 7 min bij 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
      OPMERKING: 0,05% trypsin-EDTA kan worden gebruikt om cellen te scheiden.
    5. Verwijder voorzichtig de oplossing van 0,5× celdissociatieen.
    6. Was de cellen met 2 mL PBS en gooi de PBS weg.
      LET OP: Wees voorzichtig, omdat de cellen gemakkelijk los te maken na het toevoegen van cel dissociatie enzymen oplossing.
    7. Voeg 1 mL iPS-onderhoudsmedium(Tabel van materialen)toe met 10 μM Y-27632.
      OPMERKING: Het toevoegen van Y-27632 verhoogt de overlevingskans van hiPSC's.
    8. Verjagen cellen met behulp van een cel schraper, en verzamel ze in een 15 mL centrifuge buis.
    9. Tel het aantal cellen. Pas de celdichtheid aan op 1,5 × 104 cellen/mL door iPS-onderhoudsmedium toe te voegen met 10 μM Y-27632.
      OPMERKING: Gebruik geen centrifugatie om celschade te voorkomen.
    10. Zaad 2 mL celmengsel op de met laminine bedekte zesputige plaat (uiteindelijke dichtheid: 3 × 104 cellen/put).
    11. Broed de cellen bij 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
    12. Vervang het kweekmedium door iPS-onderhoudsmedium zonder Y-27632 op dag 1, 4, 5 en 6.
  5. Subcultuur van de cellen op dag 7.
    OPMERKING: Subcultuur de cellen op dag 7 om willekeurige differentiatie van hiPSC's te remmen.

2. Inductie van cardiale differentiatie van hiPSC's

  1. Coat een 96-well cultuurplaat met laminine (Tabel van materialen).
    1. Verdun laminine tot 1,675 μg/mL met PBS.
    2. Voeg de verdunde laminineoplossing toe aan een 96-putplaat met een volume van 0,1 mL/put.
    3. Incubeer de plaat op 37 °C gedurende 30 minuten.
  2. Zaad hiPSC's op een 96-put plaat bij een dichtheid van 3 × 104 cellen / goed.
  3. Prolifereren hiPSC's bij 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
    1. Een dag later, vervang het medium met 200 μL / goed iPS groeimedium (Tabel van materialen).
    2. Verander het medium elke dag voor een extra 2-3 dagen totdat de cellen bereiken 70%-80% samenvloeiing.
  4. Pas differentiatiemedia toe.
    1. Aspirate het gebruikte medium en vervang het langzaam door 200 μL/put van voorverwarmd differentiatiemedium A (Tabel van Materialen).
    2. Plaats de plaat op 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
    3. Na 48 uur, aspirate het medium en langzaam vervangen door 200 μL / put van voorverwarmde differentiatie medium B (Tabel van materialen).
    4. Plaats de plaat op 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
      LET OP: Het is uiterst belangrijk dat de differentiatiemedia vers worden gehouden. Ze zullen geleidelijk verliezen hun differentiatie effect, meestal binnen twee weken. Indien nodig, aliquot vers medium en op te slaan bij −20 °C.
  5. Breng cardiomyocyten onderhoudsmedium aan.
    1. Na 48 uur, aspirate het medium en langzaam vervangen door 200 μL / put van voorverwarmde cardiomyocyten onderhoud medium (Tabel van materialen).
    2. Plaats de plaat op 37 °C in een bevochtigde couveuse met 5% CO2.
    3. Vervang het cardiomyocyte differentiatiemedium om de andere dag tot dag 30.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de duur van de toepassing van differentiatiemedia A en B nauwkeurig is ingesteld op 48 uur om de nauwkeurige expressiesequentie van genen te garanderen die nodig zijn voor differentiatie.

3. Blootstelling aan ischemie

  1. Ontneem het kweekmedium van voedingsstoffen en zuurstof.
    1. Bereid dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) voor zonder glucose en serum.
    2. Aspirate cultuurmedium uit de putten van de 96-put plaat met hiPS-CMs.
    3. Voeg het puntarme medium toe aan de putten met een volume van 200 μL/well.
  2. Plaats de kweekplaat in een hypoxische couveuse(Tabel van materialen).
  3. Infuus stikstofgas, en handhaven van de interne zuurstofconcentratie op 2% en CO2 concentratie op 5% voor 24 uur.
  4. Ga naar de gewenste analyses: bijvoorbeeld,levensvatbaarheidstest, beoordeling van contractiliteit of beoordeling van cellulaire schade.

4. Beoordeling van de cellulaire levensvatbaarheid met MTT-test

  1. Gebruik de MTT-testkit(Tabel van materialen)om de levensvatbaarheid van cellen kwantitatief te beoordelen.
    OPMERKING: Blootstelling aan 1 mM waterstofperoxide in DMEM voor 1 uur kan worden gebruikt om cellen te beschadigen (positieve controle). Blootstelling aan 0 mM waterstofperoxide in DMEM kan worden gebruikt voor de negatieve controle.
    1. Voeg 10 μL MTT-reagens toe aan de cellen met behulp van een herhalende pipettor.
    2. Meng zachtjes gedurende een minuut op een orbitale shaker.
    3. Incubeer de cellen 3-4 uur bij 37 °C in een 5% CO2 incubator. Na incubatie verschijnt de formazan die in de cellen wordt geproduceerd als donkere kristallen in de bodem van de putten.
    4. Los na het verwijderen van de supernatant de onoplosbare formazankristallen op in 100 μL dimethylsulfoxideoplossing (DMSO). Deze oplossing lost de formazankristallen op en produceert een paarse oplossing.
      LET OP: DMSO kan de ogen, de luchtwegen en de huid irriteren. Draag geschikte handschoenen en oog/gezichtsbescherming.
    5. Meet de absorptie van elk monster met een microplatelezer op een golflengte van 570 nm.

5. Beoordeling van de contractiliteit van iPS-CMs

  1. Als deze niet is geïnstalleerd, u Deeltjesbeeld Velocimetry ImageJ-plug-in11 op https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv verkrijgen en installeren.
  2. Met behulp van een fase contrast microscoop, neem de videobeelden van hiPS-CMs met behulp van de 4× objectieve lens op ~ 20 frames per seconde voor ~ 10 s, en op te slaan als "analyze.avi". Voor een vergelijking van de contractiliteit tussen voor en na ischemie, bevestigen dat de locatie van belang is geregistreerd.
    OPMERKING: Een microscoop met een geautomatiseerde fase is handig om de locatie van belang te targeten. Het filmbestand moet in de indeling .avi staan voor latere analyse. Zo niet, converteer dan de film naar .avi.
  3. Mapstructuur maken zoals aangegeven in figuur 1. Een voorbeeld van "joblist.txt" wordt aangegeven in het aanvullende bestand.
  4. Analyseer afzonderlijke tweedimensionale vectorvelden van cellulaire verplaatsing.
    1. Start Fiji (ImageJ) software12, ga naar Plugins > Macro's > Bewerken en open "vector_analysis.ijm" (Aanvullend coderingsbestand).
    2. Klik op Uitvoeren. De analyse wordt automatisch uitgevoerd.
      OPMERKING: Verplaatsingsvectoren D(x,y) worden berekend voor elke 16 × 16 pixels tussen het referentieframe (het eerste frame) en alle volgende frames (frames 1 vs. 2, 1 vs. 3, 1 vs. 4, enz.). Het resultaat wordt berekend voor elk frame en opgeslagen als "vec_x.txt"(x is een framenummer). Voor elk (x, y) paar wordt voor elk (x, y) paar als volgt een vector van maximale verplaatsing gedefinieerd:
      figure-protocol-1
      wanneer k het framenummer vertegenwoordigt waartegen | Dk (x,y)| = max [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] en n geeft het laatste frame aan. Het resultaat wordt opgeslagen als "Max_vector.txt". | M(x, y)| vertegenwoordigt de maximale verplaatsing veroorzaakt door cardiomyocyte contractie op het analysepunt (x, y). Contractiliteitswaarde C in willekeurige eenheden wordt als volgt berekend:
      figure-protocol-2
      Deze waarde wordt opgeslagen in kolom 7, rij 1 in de 'Max_vector.txt'. C vertegenwoordigt de som van de verplaatsing voor iedereen (x, y). Hoe groter het gedeelte waar de verplaatsing als gevolg van myocardcontractie groot is, hoe groter de waarde van C. Het vectorveld met maximale verplaatsing, M(x, y), is bedekt met fasecontrastbeeld van het eerste frame ("Phase_contrast.png") en opgeslagen als "Overlaid.png". Aangezien de omvang van de verplaatsingsvector wordt berekend op basis van het eerste frame van de video, is het beter dat de hiPS-CMs in rustdiastolische periode zijn voor het eerste frame.

6. Beoordeling van cellulaire schade met behulp van stroomcytometrie

  1. Verdun een 1 mg/mL-oplossing van propidiumjodide tot 1:1.000 in PBS.
  2. Bevlek de losstaande cellen met propidium jodide.
    1. Aspirate het medium en plaats het in een passende grootte centrifuge buis.
    2. Centrifugeren de buis op 1.000 × g gedurende 5 minuten, en verwijder voorzichtig de supernatant om niet te verliezen sedimenteerde cellen.
    3. Incubeer de cellen met de verdunde propidium jodideoplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker.
    4. Centrifugeren de buis op 1.000 × g gedurende 5 minuten, en verwijder voorzichtig de supernatant om niet te verliezen sedimenteerde cellen.
    5. Reconstrueer de cellen in ~1 mL PBS.
      OPMERKING: Het is belangrijk om losstaande zwevende cellen van het medium te verzamelen om cellulaire schade nauwkeurig te kwantificeren.
  3. Vlek bevestigde cellen met propidium jodide.
    1. Was de cellen twee keer met PBS voorzichtig en gooi PBS vervolgens weg.
    2. Incubeer de cellen met de verdunde propidium jodideoplossing gedurende 15 minuten in het donker.
    3. Aspirate de propidium jodide oplossing.
    4. Maak de cellen los met 0,25% trypsine. Verplaats de celoplossing in een centrifugebuis.
    5. Centrifugeren de buis op 1.000 × g gedurende 5 minuten, en verwijder voorzichtig de supernatant om niet te verliezen sedimenteerde cellen.
    6. Reconstrueer de cellen in ~1 mL PBS.
  4. Meng de zwevende en in bijlage cellen voor fluorescentie geactiveerde celsorde (FACS) analyse.
  5. Geef de celoplossing door een filter van 30 μm.
    OPMERKING: Het doorgeven van de cellen aan een filter is erg belangrijk voor een nauwkeurige FACS-meting.
  6. Analyseer de monsters met behulp van een FACS-systeem.

7.

  1. Repareer het celmonster.
    1. Het cultuurmedium aanzuigen.
    2. Voeg 4% paraformaldehyde toe in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de cellen drie keer met PBS.
      LET OP: Verse paraformaldehyde oplossing wordt aanbevolen voor een optimale fixatie.
  2. Permeabiliseren van de cellen met 0,2% Triton X-100 voor 15 minuten, dan gooi het reagens.
  3. Voeg 3% runderserum albumine toe om de cellen 30 minuten te blokkeren.
  4. Breng primaire antilichaam.
    1. Gooi de albuminoplossing van het runderserum van de kweekplaat weg.
    2. Incubeer de cellen met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C.
    3. Verwijder de antilichaamoplossing.
    4. Was de cellen drie keer met PBS.
  5. Breng secundair antilichaam aan.
    1. Gooi PBS-oplossing van de kweekplaat.
    2. Incubeer de cellen met secundaire antilichamen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
      OPMERKING: Primaire anti-cardiale troponine T (TNNT2) muis monoklonale antilichaam wordt gebruikt bij een verdunning van 1:750 in 3% BSA. Het Alexa Fluor 488-geconjugeerde secundaire geit anti-muis antilichaam wordt verdund tot 1:1.000 in 3% BSA.
  6. Extra kleuring van kern en actin vezels.
    1. Verwijder de antilichaamoplossing.
    2. Incubeer de cellen in nucleus kleuring reagens(Tabel van materialen) en actin kleuring reagens (Tabel van materialen) in PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
      OPMERKING: 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) of Hoechst 33342 kan worden gebruikt voor nucleaire vlekken.
    3. Was de cellen drie keer met PBS.
  7. Leg fluorescentiebeelden vast met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

Met succes gedifferentieerde cellen vertonen spontane samentrekking onder de microscoop (Video 1). Doorgaans vertoont 50% van de putten spontane krimp in <20 dagen(aanvullend figuur 1). Cardiale marker eiwit (bijvoorbeeld, cTnT) kan worden gebruikt om succesvolle differentiatie te bevestigen (Figuur 2).

Doorgaans vertonen cellen uit de ischemische groep een lagere levensvatbaarheid in MTT-tests(figuur 3A) en contractiliteit (figuur 3E,F, aanvullende figuur 2) dan die van de normoxische controlegroep. Ook is de verhouding van propidium jodide-positieve cellen hoger in de ischemische groep dan in de controlegroep(figuur 3B-D), wat duidt op hogere cellulaire schade.

figure-results-1
Figuur 1: Mapstructuur voor verplaatsingsvectoranalyse met imageJ.
"joblist.txt" beschrijft het pad naar filmbestanden elke regel. Als er drie bestanden te analyseren zijn, zijn er drie mappen (movie1, movie2 en movie3), waarin "analyze.avi" (de film van belang) moet worden geplaatst. Nadat de analyse is uitgevoerd met "vector_analysis.ijm"-code, worden bestanden gegenereerd (aangegeven in blauw) in elke filmmap. Informatie die in elk bestand wordt opgeslagen, wordt in detail uitgelegd in de hoofdtekst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatief beeld van cardiale markeringskenning.
Expressie van de cardiale marker eiwit cardiale troponine T (cTnT). Blauw: 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), rood: actin, groen: cTnT. Inzet: gestreepte expressie van cTnT, die overeenkomt met de sarcomerestructuur. Schaalbalk, 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Wei et al.13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve beelden van cellulaire levensvatbaarheidstest, beoordeling van cellulaire schade en contractiliteit.
(A) Vergelijking van de cellulaire levensvatbaarheid (MTT-test). Hogere absorptie duidt op een hogere levensvatbaarheid. n = 5 voor elke voorwaarde. (B, C en D) Flow cytometrie analyse van propidium jodide (PI)-gekleurde cellen. Ischemische cellen vertonen een verminderde voorwaartse spreidingsintensiteit en verhoogde PI-fluorescentie, vergeleken met de controle. (D) Percentage pi-gekleurde cellen in de analyse van de stroomcytometrie. n = 3 voor elke voorwaarde. (E) Analyse van iPS-CMs contractility met behulp van ImageJ software. De rode en blauwe vectoren geven respectievelijk de grootste en kleinste weeën aan. Schaalbalk, 100 μm. (F) Kwantitatieve analyse van de contractiliteit van iPS-CM met code. n = 3 voor controle en n = 8 voor ischemische toestand. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout van het gemiddelde. Voor de statistische analyse werd de t-test van de onbetaalde tweestaartstudent uitgevoerd. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0,0001. Dit cijfer wordt aangehaald uit Wei et al.13Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Video 1: Gedifferentieerde cellen vertonen spontane samentrekking onder de microscoop. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend figuur 1: Kaplan-Meier-analyse van percentage monsters zonder spontane samentrekking. 50% van de iPS-CM monsters vertoonden krimp op dag 20. Op dag 30 vertoonde 64,4% van de monsters krimp. n = 83. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 2: Beoordeling van hartcontractiliteit. Geschaalde contractiliteit verkregen door contractiliteit C te delen door het aantal analysepunten (x, y) werd uitgezet voor controle en ischemische groepen voor en na de blootstelling aan 24 uur hypoxie. n = 3 voor controle en n = 8 voor ischemische toestand. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 3: Beoordeling van de inhoud van cardiomyocyten. Immunostaining van cardiale marker eiwit op een 96 put plaat. Groen: cTnT, Blauw: DAPI. Het percentage van de gedifferentieerde cellen werd berekend op 20,7 ± 9,6% door het gebied met cTnT-gekleurde regio te delen door dat van het met DAPI bevlekte gebied. Schaalbalk = 1 mm. n = 4 voor controleconditie. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend coderingsdossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Onderzoekers gebruiken vaak laboratoriummodellen voor kleine dieren om IHD-experimenten uit te voeren. Hier ontwikkelden we een celcultuurmodel van menselijke IHD om dergelijke experimenten uit te voeren.

Het belangrijkste probleem waarmee een gebruiker van dit protocol kan worden geconfronteerd is een laag percentage gedifferentieerde cardiomyocyten. Verschillende stappen moeten met grote zorg worden genomen om de snelheid van succesvolle differentiatie te verbeteren: a) zacht zijn bij het pipetten omdat de cellen gemakkelijk kunnen loskomen na toevoeging van het reagens van enzymen van de celdissociatie, b) het toevoegen van Y-27632 verhoogt de overlevingskans van iPS-cellen bij het losmaken, en (c) de timing van middelgrote veranderingen aan het begin van differentiatie moet precies 48 uur uit elkaar liggen om een gecontroleerde expressie van genen die betrokken zijn bij differentiatie te waarborgen.

Met betrekking tot de extracellulaire matrixeiwitten die worden gebruikt voor het coaten van het oppervlak van de kweekplaat, kunnen andere materialen dan laminine die we in dit protocol gebruiken, worden gebruikt. Zo worden Matrigel14,15en gelatine16,17 gebruikt voor de feedervrije onderhoudscultuur van hiPSC's. Volgens Haraguchi et al., hiPSC's gezaaid op Matrigel werden met succes gedifferentieerd in cardiale cel blad18.

Er zijn een aantal voorgaande studies met betrekking tot cultuurmodellen voor ziektemodellering met behulp van cardiomyocyten afgeleid van hiPSC's. Met betrekking tot het modelleren van ischemie-reperfusieletsel, zijn manipulaties van de cellulaire omgeving, zoals hyperkalemia, acidose en lactaataccumulatie, geïntroduceerd19. Andere methoden zijn celpellets om zuurstofverspreiding20 en metabole remming met cyanide21te belemmeren. In het huidige protocol werd celletsel bereikt met een relatief eenvoudige methode, namelijk 24 uur ontbering van zuurstof en voedingsstoffen. Er moet echter voor worden gezorgd dat nauwkeurige pathofysiologische processen van de ischemische hartziekte worden overwogen, omdat er inderdaad verschillen zijn tussen de ziekte in vivo en het ziektemodel van het huidige protocol, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van driedimensionale cellulaire omgeving en bloed.

Met betrekking tot het technologische aspect van de evaluatie van de cardiomyocyte functie, Toepfer et al. rapporteerde een MatLab-gebaseerd algoritme om sarcomere contractie en ontspanning in hiPS-CMs22te bepalen . Smith et al. rapporteerden een geavanceerde methode van elektrofysiologische analyse met hoge doorvoer van prikkelbare cellen afkomstig van hiPS-CMs, met behulp van geavanceerde nanotopografisch patroon multi-elektrodrode arrays23,24. Het voordeel van ons protocol is dat het alleen conventionele software en verbruiksartikelen vereist, zoals imageJ-software en 96-well platen.

Met betrekking tot het zuurstofgehalte in het hart, wordt de zuurstofdruk in aderen die het hart bereiken beschouwd als 40 mmHg25. Volgens McDougal et al., de extracellulaire zuurstofdruk onder hypoxie wordt geschat op <12,8 mmHg26. Door de methode van Rondes et al.27toe te passen, wordt de zuurstofdruk in het kweekmedium (zoutgehalte: 35‰) onder de hypoxische toestand (2% zuurstof) bij 37 °C die met het huidige protocol wordt behandeld berekend berekend op 14,9 mmHg, wat hoger is dan de hierboven genoemde schatting. Interessant is dat Al-Ani et al. gemeld dat er een gradiënt van zuurstofdruk in de cultuur medium, en de zuurstofdruk wordt beïnvloed door celtype, zaaien dichtheid, en medium volume28. Typisch, de zuurstofconcentratie aan de onderkant van de kweekplaat waar cellen wonen is de laagste. Daarom zou het effect van diepte in het kweekmedium de effectieve zuurstofdruk in de buurt van hiPS-CMs verder verminderen. Om met hypoxische toestand voldoende schade aan hiPS-CMs te veroorzaken, moet zorgvuldig worden aandacht besteed aan de diepte van het medium en de dichtheid van cellen.

Ons hiPS-CM model, dat zeer dicht bij de fysiologische omstandigheden van menselijke cardiale myocyten ligt, bootst op voordelige wijze menselijke IHD na. Op diermodellen gebaseerde benaderingen omvatten ethische, technische en academische kwesties. In het bijzonder, in vivo modellen vereisen een geavanceerde techniek van microchirurgie om reproduceerbare gegevens te bereiken: bijvoorbeeld, occlusie van de voorste aflopende tak van de linker kransslagader bij knaagdieren3. Het hiPS-CM-model dat hierin wordt beschreven, overwint deze kritieke barrières en biedt een nuttig, relevant en herhaalbaar platform voor hart- en vaatziekten.

Er moeten echter enkele beperkingen worden opgemerkt. Een duidelijk verschil tussen iPS-geïnduceerde cardiomyocyten en normale cardiomyocyten is de afwezigheid van T-tubuli29, en we hebben geen humorale factoren opgenomen, zoals weefselschade veroorzaakt door leukocyten en activering van een complementsysteem in onze studie. Bovendien moet het percentage gedifferentieerde cardiomyocyten in dit model (20,7 ± 9,6%, aanvullend figuur 3)worden verbeterd. De recente publicatie van Halloin et al. beschrijft een schaalbare, chemisch gedefinieerde methode om hiPS-CM zuiverheid van >95% door chemische WNT-routemodulatoren te induceren zonder enige selectie door markers30. Niettemin is ons model van menselijke IHD relatief eenvoudig en klinisch toepasbaar (bijvoorbeeld medicijnscreening met behulp van door patiënten afgeleide iPS-cellen). Ons model is ook een uniek platform om mechanismen die ten grondslag liggen aan IHD's verder op te helderen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168. De auteurs dankbaar erkennen Central Research Laboratory, Okayama University Medical School voor de hulp van FACS.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Actinekleuringsreagens (ActinRed 555 ReadyProbes Reagens)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSR37112
Anti-cardiale troponine T-antilichaamThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSMA5-12960
Cardiomyocyt onderhoudsmedium (PSC Cardiomyocyte Differentiatie Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA2921201
Celdissociatie-enzymen (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS12563011
Differentiatiemedium A (PSC Cardiomyocyte Differentiatie Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA2921201
Differentiatiemedium B (PSC Cardiomyocyte Differentiatie Kit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA2921201
FACS Aria III systeemBD Biosciences, San Jose, CA, VS
Fluorescerende microscoopKEYENCE, Osaka, JapanBZ-X710
Geit anti-muis Alexa Fluor 488 secundair antilichaamThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA28175
Menselijke iPS-cellenRIKEN, Tsukuba, Japan201B7
Hypoxische incubatorSANYO, Osaka, JapanMCO-175M
iPSC groeimedium (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSA1517001
iPSC onderhoudsmedium (StemFit AK02N)Ajinomoto, Tokyo, JapanRCAK02N
Laminine (iMatrix-511)Nippi, Tokyo, JapaniMatrix-511
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, VS10009365
Kernkleuringsreagens (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagens)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VSR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kyoto, Japan35501-02

Referenties

  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94(2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590(2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666(2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269(2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

hiPSC cardiomyocytenhumane ge nduceerde pluripotente stamcellencardiomyocyten differentiatiehypoxische kamerdrug screeningpropidiumjodide kleuringparticle image velocimetriecardiale marker eiwit

Gerelateerde artikelen