Live-Cell Beeldvorming van de levenscyclus van bacteriële Predator Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van Time-Lapse Fluorescentie Microscopie

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol dat het toezicht op de volledige levenscyclus van roofzuchtige bacterie Bdellovibrio bacteriovorus met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie in combinatie met een agarose pad en cell-imaging gerechten beschrijft.

Samenvatting

Bdellovibrio bacteriovorus is een kleine gram-negatieve, obligate roofzuchtige bacterie die andere gram-negatieve bacteriën doodt, waaronder schadelijke ziekteverwekkers. Daarom wordt het beschouwd als een levend antibioticum. Om B. bacteriovorus toe te passen als een levend antibioticum, is het eerst noodzakelijk om de belangrijkste stadia van zijn complexe levenscyclus te begrijpen, met name de proliferatie in prooi. Tot nu toe is het een uitdaging geweest om opeenvolgende stadia van de roofzuchtige levenscyclus in real-time te volgen. Hier gepresenteerd is een uitgebreid protocol voor real-time beeldvorming van de volledige levenscyclus van B. bacteriovorus, vooral tijdens de groei in de gastheer. Hiervoor wordt een systeem gebruikt dat bestaat uit een agarosepad in combinatie met celbeeldvormingsschotels, waarin de roofzuchtige cellen zich vrij onder het agarosepad kunnen bewegen terwijl geïmmobiliseerde prooicellen bdelloplasten kunnen vormen. De toepassing van een stam die een fluorescerend gelabelde β-subunit van DNA polymerase III produceert, maakt het verder mogelijk om chromosoomreplicatie te monitoren tijdens de reproductiefase van de B. bacteriovorus levenscyclus.

Inleiding

Bdellovibrio bacteriovorus is een kleine (0,3–0,5 μm bij 0,5–1,4 μm) gram-negatieve bacterie die aast op andere gram-negatieve bacteriën, waaronder schadelijke ziekteverwekkers zoals Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, en Shigella flexneri^1,2,3. Aangezien B. bacteriovorus ziekteverwekkers doodt, wordt het beschouwd als een potentieel levend antibioticum dat kan worden toegepast om bacteriële infecties te bestrijden, met name die veroorzaakt door multiresistente stammen.

B. bacteriovorus vertoont een eigenaardige levenscyclus bestaande uit twee fasen: een vrijlevende niet-replicanatieve aanvalsfase en een intracellulaire voortplantingsfase (figuur 1). In de vrijlevende fase zoekt deze zeer motile bacterie, die zich beweegt bij snelheden tot 160 μm/s, naar zijn prooi. Na het hechten aan het buitenste membraan van de prooi, komt het in het periplasma^4,5. Tijdens de interperiplasmische voortplantingsfase gebruikt B. bacteriovorus een overvloed aan hydrolytische enzymen om de macromoleculen van de gastheer te degraderen en te hergebruiken voor zijn eigen groei. Kort na het binnenvallen van het periplasma sterft de gastheercel en opgeblazen in een bolvormige structuur genaamd een bdelloplast, waarin de roofzuchtige cel de chromosomen elongates en repliceert. Het replicatieproces begint bij de replicatieoorsprong(oriC)⁶ en gaat door totdat meerdere kopieën van het chromosoom volledig zijn gesynthetiseerd⁷. Interessant is dat replicatie van elk chromosoom niet wordt gevolgd door celdeling. In plaats daarvan, het roofdier elongates om een lange, multinucleoïde en filamenteuze cel te vormen. Bij uitputting van voedingsstoffen ondergaat de gloeidraad synchrone septatie en worden nakomelingen vrijgegeven uit de bdelloplast^8.

Voordat B. bacteriovorus kan worden gebruikt als een levend antibioticum tegen bacteriële infecties, is het van cruciaal belang om de belangrijkste stadia van zijn levenscyclus te begrijpen, met name die in verband met de proliferatie ervan in de prooi. Live-cel beeldvorming van B. bacteriovorus is uitdagend geweest, vanwege de verschillende morfologische vormen van het roofdier en zijn prooi tijdens de complexe levenscyclus. Tot nu toe zijn de interacties tussen B. bacteriovorus en zijn gastheercel voornamelijk bestudeerd door elektronenmicroscopie en snap-shot analyse^2,9,10, die beide beperkingen hebben, vooral wanneer ze worden gebruikt om opeenvolgende stadia van de roofzuchtige levenscyclus te controleren. Deze methoden bieden beelden met hoge resolutie van B. bacteriovoruscellen en maken observatie van een klein roofdier tijdens de aanval of groeifase mogelijk. Ze staan echter geen tracking toe van enkele B. bacteriovoruscellen gedurende beide levenscyclusfasen.

Hier gepresenteerd is een uitgebreid protocol voor het gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie (TLFM) om de volledige levenscyclus van B. bacteriovoruste controleren. Een systeem bestaande uit een agarose pad wordt gebruikt in combinatie met een cel-imaging schotel, waarin de roofzuchtige cellen vrij kunnen bewegen onder de agarose pad, terwijl de geïmmobiliseerde prooi cellen in staat zijn om bdelloplasten te vormen (Figuur 2). Deze opstelling wordt voorbereid op basis van specifieke stammen van zowel E. coli als B. bacteriovorus,maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan de afzonderlijke stammen van een gebruiker (bijvoorbeeld het dragen van verschillende selectiemarkers, eiwitten die zijn versmolten met verschillende fluoroforen, enz.).

In dit geval, om B. bacteriovorus tijdens de aanvalsfase te visualiseren, werd een specifieke stam (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) gebouwd die een fluorescerende versie van het cytoplasmische eiwit uitdrukt, PilZ (beschikbaar in ons laboratorium op verzoek)⁷. Deze stam produceert bovendien DnaN (de β-schuifklem), een subunit van DNA polymerase III holo-enzym, versmolten met een fluorescerend eiwit. Hierdoor kan de lopende DNA-replicatie worden gecontroleerd in de roofzuchtige cellen als ze groeien binnen bdelloplasten.

Hoewel het beschreven protocol en de software die voor beeldverwerving worden gebruikt, verwijzen naar een omgekeerde microscoop die door een specifieke fabrikant wordt geleverd (zie tabel van materialen),kan deze techniek worden aangepast voor elke omgekeerde microscoop die is uitgerust met een milieukamer of andere externe verwarmingshouder en die in staat is om time-lapse beeldvorming te maken. Voor gegevensanalyse kunnen gebruikers alle beschikbare software kiezen die compatibel is met de afzonderlijke uitvoerindelingen.

Figuur 1: B. bacteriovorus levenscyclus in E. coli als gastheercel. Tijdens de aanvalsfase zoekt en hecht een vrijzwemende B. bacteriovoruscel naar en hecht deze aan een gastheer E. coli-cel. Na de invasie wordt de roofzuchtige cel gelokaliseerd in het periplasma van de prooi, waardoor de vorm van de gastheercel verandert en een bdelloplast wordt gevormd. De voortplantingsfase begint met bdelloplastformatie. De roofzuchtige cel verteert de prooicel en hergebruikt eenvoudige verbindingen om zijn eigen structuren te bouwen. B. bacteriovorus groeit als een lange gloeidraad in het periplasma van de gastheer. Wanneer de middelen van de prooicel uitgeput zijn, vertolft de B. bacteriovorus filament synchroon en vormt ze nakomelingencellen. Nadat de nakomelingen hun flagella hebben ontwikkeld, lyse ze bdelloplast. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van B. bacteriovorus lysaat voor microscopische analyse

1. In een kolf van 250 mL zet u de cocultuur op door 1 mL verse 24 uur B. bacteriovoruscultuur (bijv. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) en 3 mL nachtelijke prooicultuur (bijv. E. coli S17-1 pZMR100) met 50 mL Ca-HEPES buffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH = 7.6]) aangevuld met antibiotica indien nodig (hier, 50 μg/mL kanamycine).
2. Broed de cocultuur 24 uur bij 30 °C met schudden bij 200 tpm.
3. Controleer of de prooicellen volledig zijn gelyseerd door vloeistof gemonteerde fasecontrastmicroscopie. Op dit punt moeten talrijke motile aanvalsfase B. bacteriovoruscellen aanwezig zijn en geen E. coli-cel of bdelloplast zichtbaar moet zijn.
4. Filtreer de B. bacteriovoruscultuur door een filter van 0,45 μm poriegrootte om de resterende gastheercellen te verwijderen. Roofcellen (0,3–0,5 μm x 0,5–1,4 μm) dringen vrij door tot 0,45 μm poriën, terwijl gastheercellen op het filteroppervlak worden vastgehouden.
5. Draai het filtraat gedurende 20 minuten naar beneden bij 2469 x g en 30°C in een conische buis van 50 mL om roofcellen te verzamelen. Resuspend de B. bacteriovorus pellet in 3 mL ca-HEPES buffer (tot een laatste OD₆₀₀ van ongeveer 0,2) en incubeer bij 30 °C en 200 rpm gedurende 30 min.

2. Voorbereiding van gastheercellen voor B. bacteriovorus invasie

1. Gebruik een enkele kolonie van de gastheer stam(E. coli S17-1 pZMR100 wordt aanbevolen vanwege verschillende celgroottes wat resulteert in de vorming van ongelijke grootte bdelloplasten) om 10 mL YT medium in teen (0,8% Bacto tryptone, 0,5% gistextract, 0,5% NaCl [pH = 7,5]) dat is aangevuld met antibiotica, indien nodig (hier, 50 μg/mL kanamycine). Kweekcellen 's nachts bij 37 °C en 180 rpm.
2. Breng 2 mL van 's nachts E. coli cultuur (OD₆₀₀ van ~ 3.0) naar een 2 mL reageerbuis en centrifuge bij kamertemperatuur (RT) en 2469 x g gedurende 5 min. Resuspend de pellet in 200 μL ca-HEPES buffer.

3. Opstelling van de microscoop (zie Tabel van Materialen)

1. Verwarm een microscopische kamer voor ten minste 1 uur voor gebruik voor aan 30 °C. Deze stap is vereist om fouten bij het handhaven van de focus tijdens het experiment te voorkomen.
2. Schakel zowel de microscoop- als microscopieautomatisering in. Initialiseer de besturingssoftware en selecteer de juiste filters om brightfield/DIC/phase-contrast- en fluorescentiebeelden te verkrijgen, indien nodig (hier: BF-beelden, GFP/mCherry polychromic filter en emissie/excitatie voor mCherry en GFP).

4. Verzameling van lay-outs voor time-lapse fluorescentie microscopie

1. Meng 200 mg lage fluorescerende moleculaire graad agarose met 20 mL Ca-HEPES buffer (1% uiteindelijke agarose concentratie) en los de agarose in een magnetron. De batch kan meerdere keren worden hergebruikt nadat deze is stolt, dus herhaal gewoon de verwarmingsstap.
2. Giet 3 mL gesmolten agarose in een 35 mm glazen bodemschotel(Tafel van materialen). Laat de agarose stollen.
3. Verwijder met behulp van een microspatel in het laboratorium voorzichtig het agarosepad uit de 35 mm schotel zonder de middenstok van het agarosepad te verstoren. Flip de pad onderkant naar boven en plaats het in een petrischaal deksel(Figuur 2).
4. Leg 5 μL geconcentreerde E. coli suspensie bovenop het omgedraaide pad en verspreid cellen in de middenpool met behulp van een inentingslus. Voeg 5 μL geconcentreerde B. bacteriovorussuspensie (OD₆₀₀ van ~0.2) toe aan het oppervlak met E.coli-gecoate laag. Spreid de cellen niet uit.
5. Breng de agarosegel snel terug naar de 35 mm glazen bodemschaal (bovenzijde naar beneden gericht) en dek af met een deksel. Verwijder indien nodig luchtbellen door de agar voorzichtig tegen de plaat te drukken.

Figuur 2: Schematische weergave van de experimentele workflow. De agarose pad wordt verwijderd uit de 35 mm schotel en omgedraaid, zodat de onderkant naar boven kijkt. Verse suspensies van roofzuchtige cellen en 's nachts cultuur van prooicellen worden geplaatst op de omgedraaidpad om de "bodem" kant jas. De agarose pad wordt vervolgens omgedraaid naar zijn oorspronkelijke oriëntatie en terug geplaatst in de 35 mm schotel, die is gemonteerd op de omgekeerde microscoop stadium in de microscoopkamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

5. Geleiding van time-lapse fluorescentiemicroscopie

1. Plaats de 35 mm schotel in de petrischaalhouder zodanig dat deze niet beweegt tijdens het experiment. Plaats een druppel onderdompelingsolie (1.518 brekingsindex) op het doel en de onderkant van de 35 mm schotel.
2. Monteer de houder op het podium van de omgekeerde microscoop in de microscoopkamer.
3. Stel de opties in de microscoop controle software om meerdere beelden te verzamelen op meerdere fase posities in de tijd.
   1. Stel de vergroting (100x) en polychromische lens (GFP/mCherry) in. Met behulp van een oogstuk en brightfield (BF) vindt u het brandpuntsvlak en opent u de puntenlijstbeheerder.
   2. Selecteer ten minste 10 posities van belang door het podium te verplaatsen en de coördinaten voor elke positie in de microscoopsoftware op te slaan door op de knop Markeringspunt te klikken. Vermijd posities die zich dicht bij elkaar bevinden om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen. Draai de cameraklep van het oculair naar de monitor en kalibreer elk punt door het brandpuntsvlak in te stellen en op de knop Punt vervangen in de puntenlijstmanager te klikken.
   3. Open de ontwerpontwerper van het experiment en stel alle experimentele parameters in elk tabblad als volgt in:
      1. Markeert de vak met Z-stapelen.
      2. Kies fluorescerende kanalen en stel de optimale verlichtingsinstellingen in. Hier werden de volgende instellingen gebruikt: voor het mCherry-kanaal, mCherry-filtersets (EX575/25; EM625/45), 50% intensiteit en 200 ms blootstellingstijd; voor het GFP-kanaal, de GFP-filterset (EX475/28; EM525/48), 50% intensiteit en 80 ms; en voor de BF-beelden, POL-kanaal, 5% intensiteit en 50 ms.
      3. Selecteer intervallen tussen het verkrijgen van afbeeldingen en de totale tijd van het experiment. Hier werden 5 min intervallen uitgevoerd over de 10 uur periode van het experiment.
      4. Schakel focusonderhoud in voor de gekozen posities (voor het systeem dat hier wordt gebruikt, door het selectievakje Focus onderhouden met UltimateFocus te markeren).
      5. Selecteer de gegevensmap waarin de afbeeldingsbestanden automatisch moeten worden opgeslagen.
      6. Controleer alle instellingen in de microscoopsoftwarebesturing opnieuw en start het time-lapse-experiment.
4. Controleer na het eerste uur van het experiment of alle podiumposities nog steeds scherp zijn. Pas de focus aan tijdens tijdsintervallen tussen het verwerven van afbeeldingen, indien nodig.
5. Wanneer het time-lapse-experiment is voltooid, verwijder je de petrischaal en gebruik je de 35 mm schotel met een agarosepad volgens het bioveiligheidsprotocol.
   LET OP: Alle substappen na stap 5.2 zijn specifiek voor DeltaVision Elite-gebruikers. Onderzoekers die andere systemen gebruiken, moeten de instellingen aanpassen aan individuele systemen.

6. Verwerking van time-lapse beelden en het genereren van films met behulp van Fiji-software

1. Breng experimentele gegevens over naar een computer geladen met de Fiji-software. Start het Fiji-programma en open een afbeelding met Bestand | Open of door simpelweg het afbeeldingsbestand naar Fiji te slepen en te laten vallen.
2. Kies in Importopties voor bio-opmaakde optie Stapel weergeven met Hyperstack in de weergaveopties voor stapel, Klik op Samengestelde kleurmodus in de kleuropties en markeer Automatisch schalen.
3. Door door de beeldstapels te scrollen, beoordeelt u of de cellen en bdelloplasten in de loop van het experiment scherp bleven. Controleer of groene fluorescerende vlekken van DnaN-mNeonGreen aanwezig zijn in B. bacteriovoruscellen in bdelloplasten gedurende de groeifase, en zorg ervoor dat alle stadia van de roofzuchtige levenscyclus kunnen worden gevisualiseerd.
4. Als u een bepaalde B. bacteriovoruscel/bdelloplast wilt analyseren, markeert u deze met behulp van de selectiegereedschappen in het Fiji-menu(Rechthoek, Ovaal, Polygon of Vrije hand). Het gekozen gebied dupliceren met afbeelding | Dupliceren of gebruiken met Ctrl + Shift + D.
5. Pas de helderheid en het contrast voor elk fluorescentiekanaal als volgt aan:
   1. Als u één kanaal wilt kiezen, opent u Kanaalgereedschappen door op Afbeelding te klikken | Kleur | Kanalen tools of Ctrl + Shift + Z, en selecteer het kanaal van belang(Channel 1: mCherry, Channel 2: mNeonGreen, Channel 3: brightfield).
   2. Pas de helderheid en het contrast van beelden in het fluorescentiekanaal aan door het B&C-menu in Afbeelding te openen | Aanpassen | Helderheid/contrast of door op Ctrl + Shift + Cte klikken.
6. Schaalbalk toevoegen met Analyseren | Hulpmiddelen | Schaalbalk. Voeg de tijdstempel toe aan de afbeeldingen door op Afbeeldingen te klikken | Stapels | Tijd Stamper.
7. Als u gewijzigde afbeeldingen wilt opslaan, gaat u naar Bestand | Opslaan als en kies TIFF om op te slaan als een beeldreeks, AVI om een film te produceren of PNG om één afbeelding van het huidige frame op te slaan.

Resultaten

Het beschreven TLFM-gebaseerde systeem maakt het mogelijk om individuele cellen van B. bacteriovorus op tijd bij te houden (figuur 3, film 1) en biedt waardevolle informatie over elke fase van de complexe roofzuchtige levenscyclus. De PilZ-mCherry fusie maakt het mogelijk de gehele roofcel te labelen in de aanvalsfase en het vroege stadium van de groeifase(figuur 3). De overgang van de aanval naar de replicante fase werd niet alleen gev...

Discussie

Vanwege de toegenomen interesse in het gebruik van B. bacteriovorus als levend antibioticum, zijn nieuwe instrumenten nodig om de roofzuchtige levenscyclus te observeren, met name interacties tussen roofdieren en pathogenen. Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de gehele B. bacteriovorus levenscyclus te volgen, vooral tijdens de groei in de gastheer, in real-time. Bovendien maakte de toepassing van een stam die fluorescerend getagde bètaklem van DNA polymerase III holoenzym produceert, het moni...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Centrifuge	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertifiedMolecular Biology Agarose	BIO-RAD	161-3100	low fluorescence agarose for agarose pad
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Open source image processing package
Glass Bottom Dish 35 mm	ibidi	81218-200	uncoated glass
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0.45 µm	Sartorius	16555----------K	Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet
Start SoftWoRx	GE		Manufacturer-supplied imaging software