Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61110

⸱

21 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Montpellier, INSERM, Institut des Neurosciences de Montpellier, 2Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 3Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, MIRCen, Laboratoire des Maladies Neurodégénératives, 4Laboratory for Optics and Biosciences, Ecole polytechnique, CNRS, INSERM, IP Paris

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Astrocyten betegelen de hersenschors uniform, waardoor de analyse van hun complexe morfologie uitdagend is op cellulair niveau. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt gebruik van multicolor-etikettering op basis van in utero-elektroporatie om corticale astrocyten uit te schakelen en hun volume en morfologie te analyseren met een gebruiksvriendelijke pijplijn voor beeldanalyse.

Samenvatting

Protoplasmatische astrocyten (PrA) in de hersenschors van de muis worden strak naast elkaar geplaatst en vormen een schijnbaar continue driedimensionale matrix in volwassen stadia. Tot nu toe kan geen enkele immunostainingstrategie hen onderscheiden en hun morfologie segmenteren bij volwassen dieren en in de loop van corticogenese. Corticale PrA is afkomstig van voorlopers in het dorsale pallium en kan gemakkelijk worden gericht met behulp van utero-elektroporatie van integratieve vectoren. Hier wordt een protocol gepresenteerd om deze cellen te labelen met de multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers-strategie, die afhankelijk is van piggyBac/Tol2-omzetting en Cre /lox-recombinatie om stochastically verschillende fluorescerende eiwitten (blauw, cyaan, geel en rood) uit te drukken die zijn gericht op specifieke subcellulaire compartimenten. Deze veelkleurige fate mapping strategie maakt het mogelijk om in situ nabijgelegen corticale voorlopers te markeren met combinaties van kleurmarkers voorafgaand aan het begin van gliogenese en om hun nakomelingen, waaronder astrocyten, te volgen van embryonale tot volwassen stadia op individueel celniveau. Semi-schaarse etikettering bereikt door het aanpassen van de concentratie van elektroporated vectoren en kleurcontrast geleverd door de Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers of MM) maken het mogelijk om astrocyten te individualiseren en hun territorium en complexe morfologie te onderscheiden ondanks hun dichte anatomische opstelling. Hier wordt een uitgebreide experimentele workflow gepresenteerd, inclusief de details van de elektroporatieprocedure, multichannel beeldstapels acquisitie door confocale microscopie en computerondersteunde driedimensionale segmentatie waarmee de experimenteerder het individuele PrA-volume en de morfologie kan beoordelen. Kortom, elektroporatie van MAGIC Markers biedt een handige methode om individueel talrijke astrocyten te labelen en toegang te krijgen tot hun anatomische kenmerken in verschillende ontwikkelingsstadia. Deze techniek zal nuttig zijn om corticale astrocytenmorfologische eigenschappen in verschillende muismodellen te analyseren zonder toevlucht te nemen tot complexe kruisen met transgene reporterlijnen.

Inleiding

Astrocyten spelen talrijke vitale functies in de ontwikkeling en fysiologie van de hersenen1. Naast hun rol bij de bloed-hersenbarrière waar ze de opname van voedingsstoffen en de bloedstroom reguleren, dragen ze actief bij aan synapsvorming en -functie terwijl ze neuromodulatoren produceren die neuronale activiteit en gedrag kunnen veranderen2. Bovendien draagt astrocytendisfunctie bij aan een verscheidenheid aan neurologische aandoeningen3. Astrocyten in de hersenschors vertonen een uitgebreide morfologie die uitgebreid contact met neuronale processen mogelijk maakt. Deze contacten, essentieel voor circuitfunctie, regelen ook astrocytenmorfogenese en synaptogenese door celhechtingseiwitten4. Neurowetenschappers hebben handige en robuuste tools nodig om de ontwikkeling van astrocyten en morfogenese in hun neurologische interessemodellen te onderzoeken. Vanwege de nauwe aanleg van astrocyten bij hun buren en hun uniforme driedimensionale tegels, is het echter een uitdaging om corticale astrocyten uit te kiezen en hun morfologie uitgebreid te beoordelen met behulp van immunomarkers.

Momenteel maken twee belangrijke genetische manipulatiestrategieën etikettering en individualisering van corticale astrocyten in situ mogelijk: schaarse reporteractivering in transgene muislijnen of somatische transgenese met behulp van elektroporatie van reporter plasmiden. De eerste strategie is gebaseerd op het fokken van een floxed reporter muislijn met muizen die een induceerbare vorm van Cre recombinase uitdrukken die specifiek bij astrocyten wordt geactiveerd bij de levering van tamoxifen (bijv. Aldh1l1-CreERT25). Aan deze strategie zijn verschillende nadelen verbonden. Ten eerste vereist het fokken van transgene muizen een groot aantal dieren en meerdere tests zijn meestal nodig om de juiste dosis tamoxifen te bepalen om voldoende schaarse etikettering van corticale astrocyten te bieden. Het analyseren van corticale astrocyten fenotypen in een genetisch muismodel van belang vereist nog meer fokkerij en muisconsumptie. Bovendien is bekend dat bij utero tamoxifen-injectie de bevalling interfereert, waardoor deze strategie moeilijk toe te passen is op de studie van de vroegste stadia van de ontwikkeling van astrocyten. In vivo DNA-elektroporatie is een alternatieve tamoxifenvrije strategie die afhankelijk is van een minimumaantal dieren6. Deze aanpak wordt uitgevoerd in embryonale of postnatale stadia en bestaat uit het injecteren van reporter plasmiden in de laterale ventrikels van knaagdieren, gevolgd door elektrische pulsen die poriën in het celmembraan creëren, waardoor DNA in stamvadercellen langs de ventrikel kan komen. Vervolgens worden de door de geëlektroporeerde plasmiden gedragen reporter transgenes verwerkt door de doelcelmachines en uitgedrukt7. Twee elektroporatiemethoden zijn eerder beschreven om corticale astrocyten van muizen te labelen: 1) Postnatale astrocytenetikettering door elektroporatie (PALE), die afhankelijk is van de elektroporatie van 1-2 enkelkleurige episomale reporter plasmiden in vroege postnatale stadia4; 2) De StarTrack-strategie gebaseerd op in utero elektroporatie (IUE) van meerdere single-color integratieve reporter plasmids8,9,10. Hoewel deze twee technieken PrA efficiënt labelen in de hersenschors, vertonen ze ook enkele beperkingen. In hun oorspronkelijke versie vertrouwen beide methoden op een gliale fibrillaire zure eiwitpromotor (GFAP) om expressie in astrocyten te stimuleren, wat de etikettering naar radiale glia kan vertekenen, evenals piale en reactieve astrocyten die GFAP sterker uitdrukken dan normale rustende PrA11,12. Wat PALE betreft, zijn andere nadelen het late stadium van elektroporatie, dat etikettering van vroeggeboren PrA (of die afkomstig van vroege delaminerende voorlopers) en analyse van vroege stadia van astroglia-ontwikkeling voorkomt, en het gebruik van episomale vectoren die verdund raken door opeenvolgende divisies tijdens de massale proliferatie die PrA ondergaat tijdens de eerste postnatale week13,14. In tegenstelling tot PALE is StarTrack gebaseerd op de embryonale elektroporatie van integratieve reporter plasmiden die het mogelijk maken om de bijdrage van zowel embryonale als postnatale stamvaders aan PrA te volgen. Een bijgewerkt StarTrack-schema dat vertrouwt op de ubiquitine C-promotor (UbC-StarTrack) bereikt een bredere expressie van fluorescerende verslaggevers in zowel de neuronale als gliale afdaling (inclusief astrocyten) van neurale voorlopers15,16,17. In de huidige versie is de implementatie van deze aanpak echter complex, omdat het steunt op een equimolar-mengsel van 12 verschillende plasmiden die zes fluorescerende eiwitten (FP) uitdrukken met gedeeltelijke excitatie en emissiespectra-overlapping.

Hier gepresenteerd is een eenvoudige in utero elektroporatie-gebaseerde multicolor labeling methode met behulp van integratieve reporter constructies gedreven door een sterke en breed actieve promotor om corticale astrocyten14uit te kiezen . Bovendien wordt een eenvoudige pijplijn voor beeldanalyse met behulp van zowel gelicentieerde (bijv. Imaris) als open access (Vaa3D18,19,20) beeldanalysesoftware geleverd om respectievelijk astrocytenterritoriaal volume en arborisatie te segmenteren. In vergelijking met de eerder beschreven methoden deze strategie is uitsluitend gebaseerd op 1–2 multicolor integratieve transgenes Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers of MM21) gericht op het cytoplasmatische en (optioneel) nucleaire celcompartiment waarvan de expressie wordt aangedreven door een synthetische CAG promotor bestaande uit een cytomegalovirus enhancer, kip β-actine promotor, en konijn β-globine splice acceptor site22. Dit maakt etikettering en tracking van corticale astrocyten mogelijk, van embryonale tot late postnatale stadia, onafhankelijk van GFAP-expressie14,23. Elk van deze transgenen heeft de volgende vier verschillende FP's: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP en tdTomato/mCherry, die minimale spectrale overlapping vertonen die gemakkelijk kan worden omzeild met 1) Sequentiële kanaalverwerving; 2) Geoptimaliseerde excitatiekracht en inzamelingswinst; en 3) Specifieke dichroïsche filters om smalle KP-emissievensters te verzamelen. De MM-strategie maakt gebruik vanCre/lox recombinatie met een zelfuitsnijdbare Cre recombinase (seCre) om stochastische expressie van FP in een cellulaire populatie te stimuleren. Een enkele kopie van MM-transgene drukt FP op een wederzijds exclusieve manier uit, terwijl meerdere transgenen aanleiding geven tot FP-combinaties, waardoor tientallen verschillende tinten ontstaan. De genomische integratie van de transgenen wordt aangedreven door het piggyBac (PB) of Tol2-omzettingssysteem24,25,26. Daarom maken de MM-toolkit en het veelkleurige 'mozaïek' dat het genereert, door in utero-elektroporatie gelijktijdige markering van meerdere aangrenzende corticale voorlopers mogelijk en het volgen van hun gliale afdaling, inclusief corticale astrocyten, over lange perioden. Kleurcontrast als gevolg van de expressie van verschillende FP maakt het mogelijk om de contour van PrA af te bakenen en vervolgens belangrijke informatie over hun territoriale volume (met behulp van IMARIS) en complexe morfologie (met vaa3D) te extraheren. De veelkleurige strategie die hier in detail wordt gepresenteerd, is een handige en robuuste methode die snelle en gemakkelijke toegang geeft tot het corticale astrocytenoppervlak en morfologie bij wilde muizen in verschillende ontwikkelingsstadia, en is gemakkelijk aanpasbaar om astrocytenanatomische kenmerken in muismodellen van neurologische ziekten te onderzoeken zonder transgene reporterlijnen te gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven dierprocedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren. Dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Charles Darwin animal experimentation ethical board (CEEACD/N°5).

1. Bereiding van endotoxinevrije plasmiden voor MAGIC Markers bij utero-elektroporatie

  1. Bacteriële transformatie
    1. Ontdooi op ijs dh5 alfa competente cellen opgeslagen bij -70 °C.
    2. Warm de agarplaten met het juiste antibioticum (100 μg/ml ampicilline of 50 μg/ml kanamycine) op bij 37 °C.
    3. Voeg 1 μL van 5-50 ng MAGIC Markers plasmid DNA toe in 10 μL ontdooide DH5 alfa competente cellen en incubeer gedurende 10 minuten op ijs zonder te mengen.
    4. Voor de warmteschoktransformatie plaatst u de aliquot gedurende 45 s in een waterbad van 42 °C, plaatst u deze onmiddellijk op ijs en wacht u 3-5 minuten.
    5. Voeg onder steriele omstandigheden 230 μL SOC-medium toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    6. Verdeel het gehalte van de aliquot over de agarplaat en incubeer 's nachts bij 37 °C.
  2. Plasmide cultuur
    1. De volgende ochtend, onder steriele omstandigheden, pak je een kolonie van de agarplaat en doe je deze in een tube van 14 ml met 2 ml LB-medium met een geschikt antibioticum. Laat het gedurende de dag bij 37 °C incuberen in een schuddende incubator bij 300 tpm.
    2. Zaai aan het einde van de dag 300 ml LB met antibioticum met behulp van de 2 ml startcultuur uit stap 1.2.1 en broed 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 300 tpm.
  3. Plasmide DNA-voorbereiding
    1. Ga de volgende ochtend verder met de zuivering van MAGIC Markers plasmid DNA (d.w.z. PB-CAG-Cytbow en Tol2-CAG-Nucbow, evenals CAG-aangedreven plasmiden die PB- en Tol2-transposases en Cre recombinase uitdrukken) met behulp van een endotoxinevrije maxiprepkit volgens het protocol van de fabrikant.
    2. Eluteer het DNA in 200 μL steriel water en schat de concentratie ervan met behulp van een spectrofotometer voorafgaand aan opslag bij -20 °C.

2. Voorbereiding voor MAGIC Markers bij utero elektroporatie (MM IUE)

  1. Oplossingsvoorbereiding
    1. Warm 30 ml zoutoplossing van 0,9% bij 37 °C in een waterbad en houd het warm gedurende de hele duur van de operatie.
    2. Bereid een plasmidemengsel met PB-CAG-Cytbow en Tol2-CAG-Nucbow (eindconcentratie, 0,8 μg/μL elk), PB en Tol2 transposases (eindconcentratie, 0,4 μg/μL elk), CAG-seCre (eindconcentratie, 0,16 μg/μL) en 0,01% Fast Green kleurstof in PBS zonder Ca2+ en Mg2+.
      OPMERKING: Voor anatomische reconstructie van astrocyten kan de Tol2-CAG-Nucbow-constructie worden weggelaten. Dit plasmide is echter nuttig om doubletten van nauw naast elkaar geplaatste astrocyten te onderscheiden en bij het gebruik van MAGIC Markers om klonale relaties tussen astrocyten te onderzoeken14.
    3. Bereid verdovende oplossing voor die 100 μL ketamine (100 mg/ml) en 100 μL xylazine (20 mg/ml) bevat, verdund in 2 ml zoutoplossing.
    4. Bereid pijnstillende oplossing door 0,3 mg/ml buprenorfine-stamoplossing 1:10 in zoutoplossing te verdunnen.
  2. Voorbereiding van het operatiemateriaal
    1. Steriliseer de chirurgische hulpmiddelen (zie Tabel met materialen)op hoge temperatuur in een glazen kraalsterilisator of gelijkwaardig.
    2. Doe een druppel elektrodegel in een schaal van 35 mm.
    3. Steek de micropipette in de micro-injectorhouder, breek de punt van de micropipette en streef naar de DNA-oplossing.
    4. Plaats een druppel Fast Green-oplossing van 1 μL (0,01%) in het deksel van een schaal van 3 cm en pas, met behulp ervan als referentie, de diameter van de punt van de micropipette aan door de punt met fijne tang te breken. Pas de drukparameter aan zodat de micro-injector druppels van gelijke grootte produceren, waardoor ongeveer 1 μL DNA-oplossing per injectie kan worden geleverd.
  3. Voorbereiding van de zwangere vrouwelijke muis
    1. Weeg de RjOrl: SWISS zwangere muis.
    2. Voer een intraperitoneale injectie uit met 12,5 μL per gram lichaamsgewicht (BW) verdovende oplossing. Wacht 5 minuten en controleer of de muis slaapt door in zijn teen te knijpen.
    3. Zodra het dier niet reageert op knijpen, injecteert u het subcutaan met 1,6 μL/g BW analgetische oplossing.
    4. Voeg een druppel ooggel toe aan elk oog om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen en plaats de buik van het dier op het verwarmingskussen.
    5. Scheer voorzichtig zijn buik, maak hem schoon met een pad gedrenkt in jodium en ontsmet het geschoren gebied met een alcoholpad.
    6. Rangschik een werkveld door steriele kompressen rond het geschoren, gereinigde en gereinigde gebied te plaatsen.

3. Bij utero-elektroporatie (IUE)

  1. Intraventriculaire injectie
    1. Snijd een verticale incisie van 2 cm langs de middellijn, beginnend in het onderste deel van de buik, door de huid en vervolgens door de onderliggende spier. Stel de baarmoederhoorns bloot door de embryonale zakken zachtjes te manipuleren en de locatie van de baarmoederhals en het aantal embryonale zakken aan elke kant van de baarmoederhals te beoordelen.
    2. Oriënteer de hersenen van het E15.5-embryo om geëlektroporated te worden om de bregma te zien, gemakkelijk te herkennen omdat de locatie overeenkomt met de kruising van de drie hoofdbloedvaten die langs de hersenspleten lopen.
    3. Stel je een virtuele lijn voor tussen de bregma (zichtbaar door de schedel) en het oog; introduceer de micropipette tussen de virtuele lijn en de longitudinale spleet en druk vervolgens op het voetpedaal van de injector om 1 μL DNA-oplossing in de laterale ventrikel van de beoogde hemisfeer te leveren.
      OPMERKING: Bij injectie op de juiste plaats lijkt de gevulde zijventrikel blauw, wat aangeeft dat deze is gevuld met de DNA-oplossing.
  2. Elektroporatie
    1. Breng de elektroden (zie Tabel met materialen),eerder ondergedompeld in elektrodegel, aan beide zijden van het geïnjecteerde embryo aan met de anode die de geïnjecteerde hemisfeer bedekt. Druk op het voetpedaal van de elektroporator om een serie van vier pulsen van 50 ms van 35 V te leveren, elk gescheiden door een interval van 950 ms.
    2. Bevochtig het embryo met een verwarmde zoutoplossing.
      OPMERKING: De embryo's moeten vochtig worden gehouden met behulp van een verwarmde zoutoplossing tijdens de hele chirurgische ingreep en de baarmoeder mag niet uitdrogen.
    3. Herhaal stap 3.1.2–3.2.2 voor elk embryo.
    4. Zodra alle doelembryo's zijn geëlektroporated, vervangt u de baarmoederhoorns in de buik door ze voorzichtig met een tang terug te duwen naar hun oorspronkelijke positie. Vul de buikholte met een verwarmde zoutoplossing om te voorkomen dat de baarmoeder droogt terwijl hechtingen worden gemaakt.
    5. Sluit eerst de buikspier met een continue opneembare hechting en vervolgens de huid met meerdere individuele hechtingen (~ 10) met behulp van 4-0 hechtingen.
    6. Leg het dier in een schone kooi, liggend op zijn kant op een schone papieren handdoek en draai het dier elke 5-10 minuten naar de andere kant totdat het wakker wordt en op zichzelf begint te bewegen.
    7. Beoordeel de toestand van het dier de volgende dag, vooral als er een nest is gemaakt.
      OPMERKING: Er is geen behandeling met postsurgery vereist. Bij afwezigheid van een nest, elk teken van pijn (bijv. prostratie, ruige vacht) en/of zware bloedingen moet het dier onmiddellijk worden geëuthanaseerd.

4. Weefsel oogsten en doorsneden

  1. Weefselverzameling
    1. Injecteer fenobarbital (100 mg/kg LICHAAMSGEWICHT) intraperitoneaal voor terminale anesthesie op de gewenste oogsttijd. In dit geval waren de oogsttijden op postnatale (P) dagen P4, P7 en P21.
    2. Voer intracardiac perfusie uit met behulp van koude premade paraformaldehyde-gebaseerde oplossing.
    3. Ontleed de hersenen en plaats deze 's nachts bij 4 °C in de op paraformaldehyde gebaseerde oplossing voor postfixatie.
  2. Histologie
    1. Spoel de hersenen de volgende ochtend 3x gedurende 10 minuten met 1x PBS.
    2. Embed de hersenen in 3% agarose opgelost in 1x PBS.
    3. Snijd 80 μm secties met behulp van een vibrerende microtome.
    4. Verzamel secties in een 24 putplaat voorgevuld met 1x PBS.
    5. Monteer secties in het montagemedium (zie Tabel met materialen)tussen de dia en de afdeklip. Houd de gemonteerde dia's op -20 °C voor optimale fluorescerende eiwitbehoud en langdurige opslag.

5. Multichannel confocale beeldvorming

  1. Microscoopinstellingen
    1. Stel de configuratie van de confocale microscoop in om mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry afzonderlijk op te wekken met respectievelijk 440, 515 en 559 nm laserlijnen.
    2. Gebruik een doelstelling van 20x 0,8 NA (of hoger NA) en pas de XY-bemonstering en de Z-stapgrootte aan volgens nyquistcriteria.
      OPMERKING: Afbeeldingen verkregen met een hogere resolutie (bijv. 60x 1.4 NA oliedoelstelling) en deconvolutie-algoritmen maken reconstructie van de fijnere details van astrocyten prieeltjes mogelijk. De experimenteerder moet er echter rekening mee houden dat de beste astrocytenprocessen mogelijk niet worden opgelost door conventionele optische beeldvorming.
  2. Beeldverwerving
    1. Zoek de helderste astrocyten in het elektroporaat.
    2. Omdat gelabelde cellen in de buurt van het oppervlak er helderder uit kunnen zien dan cellen die dieper in het segment staan, past u de acquisitie-instellingen op de oppervlaktecellen aan om te voorkomen dat de afbeeldingen worden verzadigd.
    3. Pas de acquisitie-instellingen afzonderlijk aan voor elk van de drie kanalen en zorg ervoor dat pixelverzadiging wordt vermeden met HiLo LUT, dat nul waarden weergeeft als blauwe en maximale pixelwaarden als rood.
      OPMERKING: Een voldoende gebalanceerd beeld mag slechts een paar blauwe en bijna geen rode pixels weergeven.
    4. Verkrijg betegelde Z-stacks van 1.024 x 1.024 pixels met behulp van de gemotoriseerde fase van de microscoop, met een overlapping van 10% tussen aangrenzende stapels om vervolgens mozaïekreconstructies van het geëlektriseerde gebied of de interessezone mogelijk te maken.

6. Territoriale volumesegmentatie van astrocyten

OPMERKING: Dit wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel softwareprogramma (bijv. IMARIS).

  1. Voorbereiding van de dataset
    1. Snijd de gelabelde astrocyten bij in de 3D-reconstructie (250 x 250 pixels) door cellen te selecteren die volledig in de afbeeldingsweefselsectie zijn ingesloten.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om direct op grotere volumes te werken als de gebruikte computer ze aankan.
    2. Klik op de knop Blauw oppervlak in de werkbalk Object van de weergave Overtreffen om voor elke astrocyte een nieuw oppervlak te maken.
    3. Om een beter visualisatiecontrast te verkrijgen, past u eerst de minimale en maximale kleurcontrastwaarden aan door op bewerken | Weergave aanpassingsoptie weergeven en beide handgrepen slepen. Wijzig indien nodig de kanaalkleur door rechtstreeks op de kanaalnaam in het venster Weergaveaanpassing te klikken om een nieuwe kleur te selecteren.
      OPMERKING: Werk bij voorkeur altijd met hetzelfde kleurendisplay om visuele vooroordelen te voorkomen.
    4. Klik op Bewerken | Afbeeldingseigenschappen om handmatig de voxelgrootte in micrometers aan te geven. Als de voxelgrootte niet nauwkeurig is, zijn de volumeberekeningen onjuist.
    5. Sla de nieuwe instellingen op.
  2. Oppervlaktesegmentatie
    1. Gebruik het blauwe pictogram om een oppervlak te introduceren. Er verschijnt een Surface-pictogram en -vak in de lijst Scène. Met een vak Volume u de gegevensset zien/verbergen.
    2. Selecteer de oppervlaktelijn en klik op Automatische creatie overslaan | Handmatig bewerken.
    3. Klik op Contour | Zichtbaarheid en klik op Geen. Ga vervolgens naar de weergave Selecteren en klik op de knop Tekenen.
    4. Klik op Modus om de tekenmodus te selecteren.
    5. Gebruik het snelle en efficiënte Isoline semiautomated tekengereedschap. Definieer de celcontour door de muisaanwijzer erop te verplaatsen. Als het isolinevoorbeeld niet overeenkomt met de omtrek van de astrocyten, past u de positie van de muisaanwijzer aan. Om het voorbeeld te valideren, klikt u met de linkermuisknop op de selectie. Als u mogelijke fouten wilt corrigeren, gebruikt u het venster Bord om de huidige Z-vlakcontour te verwijderen of drukt u op Ctrl + Z.
    6. Segment | gebruiken Positie om door de Z-vlakken te navigeren, ga naar het volgende vlak door het Z-vlaknummer te wijzigen en een nieuwe contour te starten. Begin bij voorkeur vanuit het midden van de cel en ga dan naar de ledematen.
    7. Wanneer contouren zijn getekend in alle Z-vlakken die de astrocyte bevatten, klikt u op Oppervlak maken. Voordat u een oppervlak maakt, controleert u of alle onderdelen zijn aangesloten. Als dit niet het geval is, selecteert u de grootste of verbindt u relevante gegevens voordat u volumegegevens exporteert.
    8. Controleer de kwantitatieve gegevens die worden weergegeven in het gegevenspaneel en exporteer statistieken in spreadsheetformaat, waardoor volumewaarde en eenheid worden opgeslagen.
    9. Sla het oppervlak op onder een nieuwe naam om het later te openen.

7. Tracering van astrocyten arborisatie

OPMERKING: Dit gebeurt met behulp van open access softwareprogramma Vaa3D.

  1. Voorbereiding van de dataset
    1. Laad de afbeeldingsstapel en zoek naar geïsoleerde astrocyten of nabijgelegen astrocyten met verschillende kleuren.
      OPMERKING: De afwikkeling van de reconstructie kan worden verbeterd door de doelstelling NA en de bemonstering te verhogen. Uiteindelijk kunnen de beste astrocytenprocessen echter niet nauwkeurig worden getraceerd vanwege de resolutielimiet van confocale microscopie. Er moet op worden gelet dat oversegmenting niet verder gaat dan de resolutie van de verkregen beelden.
    2. Snijd met Fiji afbeeldingsstapels van 250 x 250 pixels rond elke astrocyte.
    3. Aangezien Vaa3D-tracering slechts op één kleur wordt uitgevoerd, selecteert u één kanaal en deactiveert u de andere kanalen.
    4. Converteer de afbeelding naar RGB en sla deze op in .tiff-indeling.
  2. Prieeltracering
    1. Open de RGB-afbeelding in Vaa3D. Ga naar Afbeelding | Gegevens | Geometrie vervolgens beeld resampling, en pas X / Y en Z voxel grootte waarden.
      OPMERKING: Bij het reconstrueren van astrocyten prieeltjes moet ervoor worden gezorgd dat details niet fijner worden getraceerd dan de resolutie die door de afbeeldingen wordt geboden.
    2. Open een 3D-venster door te klikken op Visualize | 3D-viewer voor de hele afbeelding. Klik met de rechtermuisknop op een 3D-afbeelding en kies 1-rechtsklik om markering te definiëren. Wijs met de cursor het midden van de astrocyte aan en klik vervolgens met de rechtermuisknop om een markering in te stellen.
      OPMERKING: Klik op Escape om weer toegang te krijgen tot de 3D-weergave.
    3. Ga naar Advanced | 3D tracing | Vaa3D-Neuron2-automatisch traceren.
    4. Selecteer in het nieuw geopende venster het kanaal waarop u de plug-in wilt toepassen.
    5. Kies een achtergronddrempel (vaak tussen 30 en 90). Pas deze waarde indien nodig aan voor elke astrocyte.
    6. Schakel Radius uit op 2D en houd het voorbeeld van Automatisch omlaag en automatisch opnieuw inchecken.
    7. Zet cnn_type op 3, length_thresh op 1 en SR_ratio op 0,1.
    8. Nadat u op OK hebtgeklikt, moet u ervoor zorgen dat de plug-in automatisch twee bestanden genereert op basis van de oorspronkelijke naam. Het achtervoegsel -ini.swc en -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc wordt toegevoegd. Voeg handmatig een onderscheidend label toe aan deze naambestanden om ze niet te overschrijven terwijl u doorgaat met het uitvoeren van de plug-in.
    9. Open Object Manager, ga naar Neuron | Lijnstructuur, selecteer de getraceerde astrocyte, klik op Weergavemodusen selecteer Altijd lijnmodus.
    10. Ga terug naar het 3D-venster, waar een skelet van de astrocyte verschijnt.
      OPMERKING: Als segmentatie en signaal niet overeenkomen, herhaalt u stap 7.2.3–7.2.10 en past u de drempel aan totdat ze dat doen. Zorg ervoor dat u de andere parameters opnieuw invoert wanneer ze worden gereset wanneer de plug-in opnieuw wordt gestart.
    11. Klik met de rechtermuisknop op skelet en selecteer eerste keus neuron | regel #1... APP2_Tracing om toegang te krijgen tot kwantitatieve metingen die op een nieuw venster Surface verschijnen| Objectannotatie.
      OPMERKING: Vanwege de beperkte resolutie van lichte microscopie bieden metingen die worden weergegeven onder de vermelde items Aantal takken en aantal splitsingen slechts een ruwe schatting van de complexiteit van astrocyten prieel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Elektroporatie van MAGIC Markers in embryonale corticale voorlopers maakt het mogelijk astrocyten te labelen van vroege tot late stadia van de ontwikkeling van de hersenschors (figuur 1). Deze astrocyten werden gevonden in alle corticale lagen in verschillende postnatale stadia (P4, P7, P21) omdat ze zich wijd verspreidden in de hele hersenschors. Ze werden beoordeeld met betegelde confocale beelden verkregen met een doelstelling van 20x 0,8 NA (of hoger NA) en geassembleerd als Z-stack reco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Bij utero-elektroporatie (IUE) van MAGIC Markers in corticale voorlopers (figuur 1) maakte etikettering van astrocyten in de postnatale hersenschors in verschillende postnatale stadia mogelijk (P4-P7-P21, figuur 2). Interessant is dat het stadium van IUE niet kritiek is, omdat elektroporatie uitgevoerd van E13,5 tot E15,5 vergelijkbare etiketteringspatronen oplevert met betrekking tot corticale astrocyten14. De locatie van gelabelde piram...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken S. Fouquet en de beeldvormings- en dierenkernfaciliteiten van Institut de la Vision en Institut des Neurosciences de Montpellier (MRI en RAM) voor technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door fellowships van Région Ile-de-France en Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer aan S.C, en van Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) tot L.A., door financiering van de Europese Onderzoeksraad (ERC-SG 336331, PI J. Valette) aan E.H., door Agence Nationale de la Recherche onder contracten ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , door Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), door de Europese Onderzoeksraad (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) en door ATIP-Avenir programma (PI K. Loulier).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.1 Bacteriën transformatie
AmpicillineEuromedexEU0400-C
DH5 alpha competente cellenFisher Scientitic11563117
IJsboxDutscher139959
KanamycineSigma60615
LB AgarSigmaL2897
SOC mediumFisher Scientitic11563117
Steriele petrischaal - 10 cmThermo Fisher150350
WaterbadVWR462-0556H
1.2 Plasmide kweek
14 ml kweekbuisDutscher187262
Glas erlenmeyer- 2LFisher Scientitic11383454
LB mediumSigmaL3522
1.3 Plasmide DNA voorbereiding
NucleoBond Xtra Maxi Plus EFMacherey-Nagel740426.10
2.1 Voorbereiding van de oplossingen
26 G x 1/2 naaldTerumo8AN2613R1
30 G x 1/2 naaldTerumo8AN3013R1
Fast GreenSigma AldrichF7272
NaClVWR27810.295
Polypropyleen wegwerpspuit, 1 mLDutscher50002
2.2 Voorbereiding van het chirurgisch materiaal
Adson Forceps - DeBakey Patroon- 12,5 cmFST11617-12
Bog tip Forceps- 10 cmFST11071-10
Glaskralen sterilisator Steri 250SigmaZ378569
Glas micropipet 1 mm diameterFHC10-10-L
Graefe Forceps - Titanium 1 mm tips lichte curve- 10 cmFST11651-10
Graefe Forceps - Titanium 1 mm tips recht- 10 cmFST11650-10
Iris schaar - delicaat recht- 9 cmFST14060-09
LaboratoriumtapeFisher Scientitic11730454
MicroinjectorINJECT+MATICGeen catalogusnummer
Olsen-Hegar naaldhouder - 12 cmFST12002-12
Optische vezelVWR631-1806
Plastic-gecoat wit papierDistrimed700103
Signagel elektrode gelFree-Med15-60
Steriele petrischaal- 35 mmDutscher056714
Sterisator, glas droge kraal, Steri 250SigmaZ378569
2.3 Voorbereiding van de zwangere vrouwelijke muis
Alcohol padAlcomed1731000
BuprecareAxience0,3 mg/ml
ComprestRAFFIN70189
KetamineMerialImalgene 1000
Oculair geltvm labOcry-gel
RjOrl:SWISS muizenJanvier Labs
Vetadine, 10% oplossingVetoquinol4337400113B
VerwarmingspadHarvard Apparatus72-0493
XylazinBayerRompun 2%
3.2 Elektroporatie
Absorbeerbare hechting Maat 4-0 45 cm Hechting 1-Naald 19 mm Lengte 3/8 Cirkel OmgekeerdNovosynC0068220
Elektroporateur SonidelSonidelNEPA 21
Steriele overdracht pipetten (individueel verpakt)Dutscher043202S
Pincet met 3 mm platina schijf elektrodenSonidelCUY650P3
4.1 Weefsel oogsten en snijden
24-putjes plaatFalcon353047
AgarosLonza50004
AntigenfixMicrom MicrotechU/P0014
DekglasDutscher100266
DolethalVetoquinolDOL202
DPBS (10X), geen calcium, geen magnesiumFisher Scientific11540486
NagellakEMS72180
GlijmiddelDutscher100001
VectashieldVectorlabsH-1000
VibratomeLeicaVT1000S
5. Multichannel confocale beeldvorming
20X olie NA 0.85Olympus
Confocale Laser Scanning MicroscoopCarl ZeissLSM880
Confocale Laser Scanning MicroscoopOlympusFV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27Carl Zeiss
6. Territoriale volume segmentatie van astrocyten
IMARIS 8.3 en latere versiesBitplane
7. Arborisatie tracering van astrocyten</

Referenties

  1. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  2. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  3. Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
  4. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  5. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  7. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
  8. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  9. Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039(2013).
  10. Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
  11. Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  12. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697(2017).
  13. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  14. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  15. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896(2016).
  16. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87(2015).
  17. Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
  18. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  19. Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
  20. Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342(2014).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662(2019).
  24. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  25. Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  26. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
  27. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Corticale astrocytenconfocale microscopiefluorescerende eiwittenPiggyBac Tol2Cre-Lox-recombinatiemulticolor fate mappingZ-stack-reconstructieastrocytenmorfologie
In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers om Cortical Mouse Astrocytes te individualiseren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.