Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61113

⸱

13 juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

In dit artikel

Samenvatting

Gerichte echografie met microbubble-middelen kan de bloed-hersenbarrière focal en voorbijgaand openen. Deze techniek is gebruikt om een breed scala aan middelen over de bloed-hersenbarrière te leveren. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gelokaliseerde levering aan de knaagdierhersenen met of zonder MRI-begeleiding.

Samenvatting

Stereotaxische chirurgie is de gouden standaard voor gelokaliseerde medicijn- en genafgifte aan de knaagdierhersenen. Deze techniek heeft veel voordelen ten opzichte van systemische levering, waaronder nauwkeurige lokalisatie naar een doelbreingebied en vermindering van off-target bijwerkingen. Stereotaxische chirurgie is echter zeer invasief, wat de translationele werkzaamheid beperkt, lange hersteltijden vereist en uitdagingen biedt bij het richten op meerdere hersengebieden. Gerichte echografie (FUS) kan worden gebruikt in combinatie met circulerende microbubbles om de bloed-hersenbarrière (BBB) in millimetergrote gebieden tijdelijk te openen. Dit maakt intracraniale lokalisatie mogelijk van systeemgeleverde agenten die normaal gesproken de BBB niet kunnen overschrijden. Deze techniek biedt een niet-invasief alternatief voor stereotaxische chirurgie. Tot op heden moet deze techniek echter nog op grote schaal worden toegepast in neurowetenschappelijke laboratoria vanwege de beperkte toegang tot apparatuur en gestandaardiseerde methoden. Het algemene doel van dit protocol is om een benchtop-benadering van FUS BBB-opening (BBBO) te bieden die betaalbaar en reproduceerbaar is en daarom gemakkelijk door elk laboratorium kan worden aangenomen.

Inleiding

Ondanks de vele ontdekkingen in de basisneurologie blijft het aantal opkomende behandelingen voor neuroontwikkelings - en neurodegeneratieve aandoeningen relatief beperkt1,2. Een dieper begrip van de genen, moleculen en cellulaire circuits die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen heeft veelbelovende behandelingen gesuggereerd die niet te verbeelden zijn bij mensen met de huidige technieken3. Effectieve behandelingen worden vaak beperkt door de noodzaak om hersendoordringbaar en plaatsspecifiek te zijn4,5,6,7,8. Bestaande methoden voor gelokaliseerde medicijnlevering aan specifieke hersengebieden (bijv. levering via injectie of canule) zijn echter invasief en vereisen een opening in de schedel9. De invasieve werking van deze operatie voorkomt het routinematige gebruik van gelokaliseerde levering in het menselijk brein. Bovendien zijn weefselschade en de resulterende ontstekingsreacties alomtegenwoordige confounds voor basis- en preklinische studies die afhankelijk zijn van intracerebrale injectie10. Het vermogen om niet-invasief middelen over de bloed-hersenbarrière (BBB) te leveren en deze te richten op specifieke hersengebieden kan een enorme impact hebben op behandelingen voor neurologische aandoeningen, terwijl tegelijkertijd een krachtig onderzoeksinstrument voor preklinisch onderzoek wordt geboden.

Een methode voor gericht transport over de BBB met minimale weefselschade is transcraniële gerichte echografie (FUS) samen met microbubbles om deBBB 11 ,12, 13,14,15,16brandpunts- en transiëntieel te openen . FUS BBB opening heeft recente aandacht gekregen voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen, beroerte en glioom door het lokaliseren van therapieën om hersengebieden zoals neurotrofefactoren 17,18,19, gentherapieën20,21,22,antilichamen23, neurotransmitters24, en nanodeeltjes25,26,27,28,29te targeten . Met zijn brede scala aan toepassingen en zijn niet-invasieve aard30,31, FUS BBB opening is een ideaal alternatief voor routine stereotaxic intracraniale injecties. Bovendien, vanwege het huidige gebruik bij mensen30,32,kunnen preklinische onderzoeken met behulp van deze techniek als zeer translationeel worden beschouwd. De opening van FUS BBB moet echter nog een wijdverbreide techniek zijn in de basiswetenschap en het preklinisch onderzoek vanwege een gebrek aan toegankelijkheid. Daarom bieden we een gedetailleerd protocol voor een benchtop-benadering van FUS BBB-opening als uitgangspunt voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het opzetten van deze techniek.

Deze studies werden uitgevoerd met ofwel een high-power air backed FUS specifieke ultrasone transducer of een low power gedempte geconcentreerde ultrasone immersie transducer. De transducers werden aangedreven door een RF-eindversterker ontworpen voor reactieve belastingen en een standaard benchtop-functiegenerator. Details voor deze items zijn te vinden in de tabel met materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Gerichte ultrasone rijapparatuur setup

  1. Gebruik 50 Ohm coaxiale BNC-kabels om (1) de ingang van de ultrasone transducer aan te sluiten op de uitgang van de RF-versterker en (2) de ingang van de RF-versterker op de uitgang van de functiegenerator.
  2. Stel de werkingsgeneratormodus in op een sinusoïde burst eenmaal per seconde met een duty cycle van 1%.
    1. Voor de gedempte 1 MHz low-power immersietransducer met een brandpuntsafstand van 0,8 inch die wordt gebruikt met een 50 dB RF-versterker, stelt u de startinstellingen in op: 1 MHz sinusgolf, 1 V piek tot piek, 10k cyclus, 1 s interval (of periode).
    2. Voor de lucht backed, 1,1 MHz high-power transducer, stel de eerste instellingen in op: 1,1 MHz sinus, 50 mV piek tot piek, 11k cycli, 1 s interval.
      OPMERKING: Gebruik de transducers alleen als ze onder water staan. Plaats geen hand of ander lichaamsdeel bij de ultrasone focus en raak het transducergezicht niet aan terwijl het in werking is.

2. Gerichte ultrasone benchtop setup

  1. 3D-print het stereotaxic frame en de stereotactische framehouder.
  2. Sluit de transducer aan op de XYZ-positioner met behulp van een klem die een PVC-buis vasthoudt(figuur 1a). Bout de klem op de X-asschuif en vergrendel met een vleugelmoer.
    1. Als u de krachtige ultrasone transducer gebruikt, bevestigt u deze aan de PVC-buis met behulp van een bijpassend paar magneten. Zorg ervoor dat de ene magneet een gat heeft en de andere een bijpassend uitsteeksel heeft. Bedek de onderkant van de PVC-buis en bevestig er een van de magneten aan met epoxy (zie figuur 1b).
    2. Bevestig de tweede magneet aan het bovenste midden van de krachtige ultrasone transducer met epoxy. Zorg ervoor dat het zich in het midden van de transducer bevindt(figuur 1c).
  3. Als u de krachtige ultrasone transducer gebruikt, maakt u een aanwijzer voor het tenietdoen van de XYZ-positioner. De punt van deze aanwijzer geeft de locatie in de ruimte van het midden van de transducerfocus aan wanneer de ultrasone transducer aan de XYZ-positioner is bevestigd. Maak een aanwijzer van een naaldsnede van 18 G om de lengte van de brandpuntsafstand van de transducer plus de dikte van de transducer te zijn (figuur 1d).
    1. Breng epoxy aan op een derde magneet (deze magneet combineert ook met de PVC-dopmagneet) en bevestig deze aan de bovenkant van de aanwijzer. De aanwijzer kan dan aan de magneet op de PVC-buis worden bevestigd voor XYZ-nulling(afbeelding 1d).
  4. Als u de low-power dompeltransducer gebruikt, drukt u het bestand voor de aanwijzer en de montageclip 3D-printen.
    1. Bevestig de low-power onderdompelingstransducer aan de PVC-buis door de montageklem op de PVC-buis te knippen en plaats de transducer in de ring(afbeelding 1f).
  5. Maak een waterbad door stukken aan elkaar te lijmen die zijn gesneden uit acrylplaat die boven het stereotactische frame op het hoofd van het dier kunnen rusten (figuur 1e).
    1. Snijd een opening in de bodem van het bad die ongeveer zo groot is als het hoofd van het dier. Bedek het gat in het waterbad met een polyimidetape.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen water rond de polyimidetape lekt, omdat het de vacht van de rat nat kan maken en onderkoeling kan veroorzaken.
  6. Maak een MRI-fiducieel door een dunne plastic of glazen bol met een diameter van 4 mm te vullen met een MRI-zichtbare vloeistof (bijv. vitamine E-olie) en sluit deze af. Plaats het in de MRI-fiduciale houder aan de rechterkant van het 3D-geprinte stereotaxicframe (figuur 2a).
  7. Bevestig de 3D-geprinte framehouder stevig aan de XYZ-positioner op een goede locatie voor het positioneren van dieren. Schuif het lipje op het rostrale uiteinde van de framehouder in het bijpassende kanaal op de Y-asrail en bevestig met ingestelde schroeven(afbeelding 1h,rode pijlen).
  8. Voor het aandrijven van de XYZ-positioner installeert u de USB-naar-seriële converter op een computer door de aanwijzingen van de fabrikant te volgen en de converter aan te sluiten. Installeer de runtime-omgeving en motorcontrollersoftware op de pc.
    1. Zorg ervoor dat de juiste seriële poort in de software is geselecteerd door de USB-naar-seriële converter te selecteren in de vervolgkeuzelijst poortselectie op het voorpaneel van de controllersoftware. Sluit de USB op de seriële converter aan op de steppermotorcontrollerbox met behulp van een 9-pins seriële crossover-kabel (bijv. RS232 null-modemkabel).
    2. Voer de controllersoftware uit om te testen of de stappenmotoren onder softwarebesturing kunnen worden aangedreven. Voor deze stap kan de hulp van lokale IT-ondersteuning nodig zijn.

3. Intracraniële targetingprocedure

OPMERKING: Mannelijke Sprague Dawley ratten met een gewicht van 250-350 g werden gebruikt voor deze experimenten. Dieren hadden gratis toegang tot water en ratten chow, en werden onderhouden op een 12:12 uur lichte: donkere cyclus.

  1. Plaats het dier onder narcose (3% isofluraan met zuurstof) en controleer op het gebrek aan respons op de teenknijper. Plaats vervolgens de katheter zoals hieronder beschreven.
    1. Verwarm de staart met een lamp om te maken is gemakkelijker om de ader te raken. Zorg ervoor dat u het dier niet oververhit of de staart verbrandt.
    2. Zodra het dier slaapt (reageert niet op een teenknijper), plaatst u de 24 G staartaderkatheter die zal worden gebruikt om microbubbles, Evans blue dye (EBD), gadobutrol MRI-contrast te leveren bij gebruik van MRI en het experimentele middel van belang. Zodra de ader is geraakt, zal bloed de schede vullen, langzaam de binnennaald verwijderen terwijl de schede verder in de ader wordt geduwd.
      OPMERKING: Zie een gids zoals Stuart en Schroeder33 als u de rattenstaartaderinjecties voor de eerste keer doet.
    3. Als er geen bloedstroom is, beweeg dan langzaam de kathetermant uit de ader om te testen of de naald mogelijk door de ader is geprikt. Als er bloed stroomt wanneer de katheter iets wordt teruggetrokken, gaat de eerste por door de ader en moet de plaatsing van de katheter opnieuw worden gestart op een andere locatie op de staart die rostral is ten opzichte van de vorige locatie.
  2. Vul de katheterplug met zoutoplossing en schroef de katheterplug in het uiteinde van de katheterpoort zodra de poort met bloed is gevuld. Wikkel de labtape voorzichtig om de katheter en de staart om deze op zijn plaats te houden. Begin met een klein stukje aan de bovenkant en werk in de caudale richting, waardoor het uiteinde van de katheterplug bloot blijft.
  3. Sluit de anesthesielijn aan op de anesthesieconnector op het stereotaxicframe(afbeelding 2a)en bevestig de dierenkop in het frame door de mond op de bijtstang te plaatsen en door de oorbalken in beide gehoorgangen te leiden en vervolgens de ingestelde schroeven vast te draaien. Zorg ervoor dat het hoofd van de dieren stevig en vlak is.
  4. Verplaats het dier in het MRI-bed en sluit de anesthesielijn aan op de neuskegel. In dit protocol werd een 9,4 T mri van kleine boringen gebruikt.
  5. Verzamel coronale en axiale T2-gewogen beelden die zowel de hele hersenen als de MRI-fiduciale (figuur 2b) vastleggen voor coördinatenmetingen. Geef de lokale MRI-fysicus of tech de volgende informatie zodat ze het MRI-protocol kunnen bouwen.
    1. Gebruik voor coronale afbeeldingen (afbeelding 2b boven) de volgende parameters: aantal afbeeldingen: 27, breedte: 62,2 mm, hoogte: 62,2 mm, diepte: 37,97 mm, Voxel-formaat: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
    2. Gebruik voor axiale afbeeldingen (figuur 2b onder) de volgende parameters: aantal afbeeldingen: 13, Breedte: 61,47 mm, Hoogte: 53,81 mm, Diepte: 16,7 mm, Voxel-formaat: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
      OPMERKING: Het is niet nodig om deze exacte parameters te hebben, zolang de coronale in vliegtuigresolutie bijna 0,25 mm is en de beelden de hele hersenen en fib induceel bedekken.
  6. Verzamel coördinatenmetingen van de bovenstaande beelden door de afstand van de MRI-fiduciale tot het hersengebied vast te leggen die met FUS zal worden gericht.
    1. Bij de scanner, op de coronale beelden verzameld in stap 3.5, vindt u het beeld waarin de fiducial de grootste is, wat het centrum van de fiducial aangeeft. Noteer de afstand van de bovenkant van de fiducial tot het hersengebied dat van belang is voor mm (de MRI-software heeft een schaal- of puntmeetinstrument, raadpleeg lokale MRI-technologie of fysicus over hoe dit te doen) in zowel de mediale / laterale richting als in de dorsale ventrale richting(figuur 2b,boven).
    2. Bij de scanner, op de axiale beelden verzameld in stap 3.5, vindt u de afbeelding die de bovenkant van de fiducial toont en meet u de afstand van het centrum van de fiducial tot het doelbreingebied in zowel de dorsale/ ventrale richting als in de mediale / laterale richting(figuur 2b, onder).
    3. Vergelijk de twee mediale/laterale metingen en als ze verschillend zijn, gebruik dan het gemiddelde. Deze coördinatenmetingen worden later in stap 4.3 gebruikt om het FUS-brandpunt met de XYZ-positioner naar het doelhersengebied te leiden.
  7. Verzamel MRI-prescanbeelden. Vergelijk deze afbeeldingen met de beelden die zijn verzameld na het openen van FUS BBB (figuur 4). T1-gewogen beelden zullen later worden gebruikt om BBB-opening te visualiseren, T2-gewogen beelden zullen later worden gebruikt om ervoor te zorgen dat er geen weefselschade is opgetreden na FUS-behandeling34.
    1. Gebruik voor T1-gewogen axiale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 51,2 mm, diepte: 3,0 mm, voxelgrootte: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, aantal afbeeldingen: 13.
    2. Gebruik voor T2-gewogen axiale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 51,2 mm, diepte: 2,6 mm, voxelgrootte: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, aantal afbeeldingen: 13.
    3. Gebruik voor T1-gewogen coronale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 30 mm, diepte: 27 mm, voxelgrootte: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, aantal afbeeldingen: 27.
    4. Gebruik voor T2-gewogen coronale afbeeldingen de volgende parameters: breedte: 30 mm, hoogte: 30 mm, diepte: 27 mm, voxelgrootte: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, aantal afbeeldingen: 27.
      OPMERKING: Net als in stap 3.5 hoeven deze beeldparameters niet exact hetzelfde te zijn als vermeld. Deze afbeeldingen hebben een kleinere FOV en een hogere resolutie dan die verzameld in stap 3.5.
  8. Houd het dier in het stereotaxicframe en transporteer het dier snel van het MRI-bed naar de FUS-opstelling op het bankje. Zorg ervoor dat het dier in slaap blijft voor de overdracht onder invloed van anesthesie.
  9. Gebruik voor langere overdrachtstijden een doos voor overdracht die groot genoeg is om het dier en het frame te passen. Als de anesthesieplug nog steeds is bevestigd, plaatst u het dier en het frame in de doos en laat u het overtollige isofluraan de doos een paar minuten vullen. Haal de stekker uit het stopcontact en breng snel over.

4. Gerichte echografieprocedure

  1. Bij aankomst op de FUS benchtop setup, sluit onmiddellijk de anesthesie lijn in de neuskegel en blijven lopen 1,5-3% isofluraan met zuurstof. Doe dit zo snel mogelijk om te voorkomen dat het dier wakker wordt.
  2. Schuif het frame in de framehouder en klik het stevig vast. Gebruik tondeuses om het hoofd van het dier te scheren. Borstel overtollig haar weg en breng haarverwijderaarcrème aan op de hoofdhuid. Laat 3 minuten zitten en veeg weg met water en gaas.
  3. Als MRI niet beschikbaar is voor targeting, gebruik dan een standaard (niet 3D-geprint) stereotactisch frame om de aanwijzerpositie teniet te doen aan bregma door de aanwijzertip aan te raken op bregma (hiervoor is een hoofdhuidincisie nodig) en de software te vernietigen of de coördinaten vast te nemen. Beweeg de XYZ-slede 50 mm omhoog door op de 50-knop omhoog in de software te klikken en de aanwijzer voor de transducer te verwisselen. Op basis van een rattenhersenatlas zoals eerderbeschreven 35, ga naar de gewenste hersencoördinaten met behulp van de stapknoppen in de software. Als u deze methode gebruikt in plaats van MRI, gaat u naar rubriek 4.6.
  4. Als u MRI-geleiding gebruikt, bevestigt u de aanwijzer en verplaatst u de aanwijzer naar de locatie van de MRI-fiduciale (figuur 1d,g). Plaats de aanwijzer helemaal bovenaan en in het midden van de MRI-fiduciale (een klein gaatje in de bovenkant van de fiduciale houder is voorzien voor het wijzen). Klik op de null-positieknop, het punt van waaruit alle afstanden in het MRI-beeld zijn berekend.
  5. Verwijder de aanwijzer en verplaats de positioner naar de mediale/laterale coördinaten en de rostral/caudale coördinaten. Verhoog de positioner omhoog door op de 50-knop omhoog te drukken om de plaatsing van het waterbad en de ultrasone gel mogelijk te maken. Als de bovenkant van de Z-asreis wordt bereikt, wordt de nullinglocatie ongeldig gemaakt. De dorsale/ventrale coördinaat wordt ingesteld nadat de transducer is toegevoegd.
  6. Breng ultrasone gel aan op de hoofdhuid van het dier en plaats het waterbad over het dier met het polyimidetapevenster op de gel gedrukt. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de ultrasone gel zitten.
  7. Vul het waterbad met ontgast water.
  8. Als u de krachtige transducer gebruikt, laat u de positioner zakken zodat de magneet zich net boven het water bevindt. Bevestig de transducer aan de positioner door de transducer voorzichtig schuin in het water te laten zakken om te voorkomen dat luchtbellen onder het gezicht vast komen te zitten en de magneten aan te sluiten.
  9. Als u de laagvermogensonderdompelingstransducer gebruikt, laat u de positioner in het water net boven de transducerclip zakken. Clip vervolgens de transducer op zijn plaats door deze langzaam onder een hoek in het water te laten zakken om te voorkomen dat luchtbellen onder het gezicht vast komen te zitten.
    OPMERKING: Een transparant bad is handig bij het kijken onder het transducergezicht naar bubbels.
  10. Verlaag de positioner naar de dorsale/ventrale coördinaat.
  11. Schakel de RF-eindversterker in.
  12. Injecteer 1 ml/kg 3% Evans blauwe kleurstof (EBD) door de naaldpunt in de katheterplug te steken en te injecteren. Laat het 5 minuten circuleren.
  13. Activeer de microbubbles door ze hevig te schudden met de met de bubble shaker.
    1. Bereid 5x de dosis van 30 μL/kg microbubbles (bubble conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml zoutoplossing om rekening te houden met de 2 FUS-behandelingen en de slang in de 18 G gevleugelde infusieset. Als de rat bijvoorbeeld 200 g weegt, vul dan de spuit met 18 G naaldpunt met 30 μL microbubbles in 1 ml zoutoplossing.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u 18 G naaldpunten gebruikt voor zowel het gebruik als het injecteren met de gevleugelde infusieset.
    2. Keer de spuit meerdere keren om om een uniforme verdeling van microbubbels te krijgen. Bevestig en vul vervolgens de gevleugelde infusieset. Plaats de spuit op de infuuspomp en stel de infuuspomp in op 0,2 ml met een snelheid van 6 ml/h. Dit zorgt voor een langzame infusie van de microbubbles gedurende de 2-min FUS blootstelling.
    3. Steek de gevleugelde naald in de katheterplug.
  14. Voer eerst de infuuspomp uit, wacht 3 s en start de FUS-behandeling door op de uitgangsknop op de functiegenerator te drukken (gelabeld "op" op de functiegenerator in de materialentabel). Herhaal deze twee keer per regio met 5 minuten ertussen om de microbubbles te laten wissen.
    1. Druk nogmaals op de aan-knop op de functiegenerator om de FUS-behandeling te stoppen wanneer de infuuspomp na 2 minuten stopt.
    2. Wacht 5 minuten tot de microbubbles zijn gewist. Start vervolgens de infusie en de tweede FUS-behandeling.
    3. Injecteer onmiddellijk na de tweede FUS-behandeling gadobutrolcontrast (bij gebruik van MRI) en het agent van belang, bijvoorbeeld virale deeltjes. Het totale geleverde volume van alle agentia mag niet meer dan 5 ml/kg bedragen.
      OPMERKING: Het tijdstip van levering (bijv. voor of na de opening van FUS BBB) van de belangenbehartige kan verschillen, afhankelijk van de gebruikte agent.
  15. Schakel de RF-eindversterker uit en breng het dier onmiddellijk terug naar de MRI.

5. MRI-bevestiging van BBB-opening

  1. Als MRI niet beschikbaar is, gaat u naar rubriek 6 en gebruikt u ebd-expressie voor bevestiging van de opening van de BBB.
  2. Plaats het dier terug op het MRI-bed op exact dezelfde locatie als in stap 3.7 en sluit de anesthesielijn aan.
  3. Verzamel de MRI-postscans met dezelfde beeldvormingsparameters die in stap 3.7 worden gebruikt om de verbetering van de MRI van gadobutrol in het gebied van BBB-opening te visualiseren (figuur 3b,e).

6. Perfusie en weefselverzameling

  1. Perfuse het dier met koude 4% formaline totdat het bloed volledig helder is.
  2. Verwijder de hersenen en plaats in 4% formaline of PFA bij 4 °C 's nachts. Plaats vervolgens de hersenen in 30% sucrose-oplossing totdat de hersenen zinken (ongeveer 2-3 dagen). Tot slot, flash bevriezen in vloeibare stikstof of op droogijs en bewaren bij -80 °C tot cryosectioning.
  3. Bevries de hersenen in OCT en neem cryosections.
  4. Fix en coverslip secties voor fluorescentie microscopie. EBD-excitatiepieken bij 470 en 540 nm en emissiepieken bij 680 nm. Coverslip met DAPI-montagemedium om de algehele cellulaire morfologie te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier tonen we aan dat gerichte echografie met microbubbles gelokaliseerde BBB-opening kan induceren met behulp van de hierboven gespecificeerde parameters met zowel de low-power immersietransducer (figuur 3) als de FUS-transducer(figuur 4). Ten eerste werd in vroege experimenten de laagvermogensonderdompelingstransducer gericht op één hersenhelft , ofwel voorste (figuur 3b) of mediaal (figuur 3a). Diere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschreven we een benchtop-benadering van microbubble-ondersteunde FUS BBB-opening met alternatieve benaderingen, waaronder twee verschillende transducers en methoden voor intracraniële targeting met en zonder MRI-begeleiding. Momenteel is er, om MRI-geleide FUS BBB-opening in het lab tot stand te brengen, de mogelijkheid om uitstekende kant-en-klare apparaten aan te schaffen die zeer gestandaardiseerde en reproduceerbare resultaten bieden met gebruiksvriendelijke interfaces. Veel laboratoria zijn echter niet voorbe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een NSF EPSCoR Research Infrastructure grant aan Clemson University (1632881). Daarnaast werd dit onderzoek mede ondersteund door het Civitan International Research Center, Birmingham, AL. De auteurs erkennen dankbaar het gebruik van de diensten en faciliteiten van de Universiteit van Alabama bij Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. De auteurs erkennen Rajiv Chopra voor zijn steun en begeleiding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bubble shakerLantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, activeringsapparaat gebruikt om Definity-microbelletjes te activeren
Catheter plug/ Injection capSAI infusion technologiesPart Number: ICCatheter plug/ Injection cap
Evans blue dyeSigmaE2129-10GEvans blue dye
Function generatorTektronixAFG3022BDual kanaal, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHzFUS InstrumentsTX-1101 MHz MRI-compatibele sferisch gefocuste echografie transducer met een hydrofoon
Heating pad for Mice and RatsKent ScientificPS-03Verwarmingspad- PhysioSuite voor muizen en ratten
Infusion pumpKD Scientific780100KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tapeGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) voor 3D-printers en printen, 8 x 8 inches, 10 vellen per pak
Low power immersion transducer, 1MHzOlympusV303-SUImmersie Transducer, 1 MHz, 0.50 inch. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet setsWINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps voor naaien, scrapbooking - 10 sets
RF amplifierE&IA07575W
Tail vein catheterBD382512/ Fisher Item: NC122851324g BD Insyte Autoguard afgeschermde IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubblesLantheus Medical ImagingDE4, DE16DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gelAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller softwareN/AN/Aaangepaste software geschreven in LabView voor het besturen van de Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller softwareNational InstrumentsLabView runtime engine version 2017 or betterhttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner)Velmex
boltsVelmexMB-1BiSlide Bolt 1/4-20x3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controllerVelmexVXM-3Control, 3 axis programmeerbare stapmotor control, Qty:1
mounting cleatsVelmexMC-2Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleatsVelmexMC-2Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converterVelmexVXM-USB-RS232USB naar RS232 Serie Communicatie Kabel 10ft, Qty:1
x-axis linear stageVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motorVelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stageVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motorVelmexPK266-03A-P1Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damperVelmexD6CL-6.3FD6CL Damper voor Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stageVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motorVelmexPK266-03B-P2Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointerhttps://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic framehttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holderhttps://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRIBrukerBruker BioSpec 94/20ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
Cream hair removerChurch & DwightNair cream
gadobutrol MRI contrast agentBayerGadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frameStoelting#51500niet MRI compatibel
turnkey FUS delivery deviceFUS InstrumentsRK-300klaar voor gebruik MRI compatibele FUS voor knaagdieren

Referenties

  1. Markou, A., Chiamulera, C., Geyer, M. A., Tricklebank, M., Steckler, T. Removing obstacles in neuroscience drug discovery: the future path for animal models. Neuropsychopharmacology. 34 (1), 74-89 (2009).
  2. Schoepp, D. D. Where will new neuroscience therapies come from. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 715-716 (2011).
  3. Insel, T. R., Landis, S. C. Twenty-five years of progress: the view from NIMH and NINDS. Neuron. 80 (3), 561-567 (2013).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcão, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 3-14 (2005).
  6. Millan, M. J., Goodwin, G. M., Meyer-Lindenberg, A., Ove Ögren, S. Learning from the past and looking to the future: Emerging perspectives for improving the treatment of psychiatric disorders. European Neuropsychopharmacology. 25 (5), 599-656 (2015).
  7. Correll, C. U., Carlson, H. E. Endocrine and metabolic adverse effects of psychotropic medications in children and adolescents. Journal of the American Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 45 (7), 771-791 (2006).
  8. Girgis, R. R., Javitch, J. A., Lieberman, J. A. Antipsychotic drug mechanisms: links between therapeutic effects, metabolic side effects and the insulin signaling pathway. Molecular Psychiatry. 13 (10), 918-929 (2008).
  9. Patel, M. M., Goyal, B. R., Bhadada, S. V., Bhatt, J. S., Amin, A. F. Getting into the brain: approaches to enhance brain drug delivery. CNS Drugs. 23 (1), 35-58 (2009).
  10. McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. Journal of Neuroimmunology. 194 (1-2), 27-33 (2008).
  11. Thanou, M., Gedroyc, W. MRI-Guided Focused Ultrasound as a New Method of Drug Delivery. Journal of drug delivery. 2013, 616197(2013).
  12. Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
  13. Burgess, A., Shah, K., Hough, O., Hynynen, K. Focused ultrasound-mediated drug delivery through the blood-brain barrier. Expert Review of Neurotherapeutics. 15 (5), 477-491 (2015).
  14. Shin, J., et al. Focused ultrasound-mediated noninvasive blood-brain barrier modulation: preclinical examination of efficacy and safety in various sonication parameters. Neurosurgical Focus. 44 (2), 15(2018).
  15. Bing, C., et al. Characterization of different bubble formulations for blood-brain barrier opening using a focused ultrasound system with acoustic feedback control. Scientific Reports. 8 (1), 7986(2018).
  16. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  17. Baseri, B., et al. Activation of signaling pathways following localized delivery of systemically administered neurotrophic factors across the blood-brain barrier using focused ultrasound and microbubbles. Physics in Medicine and Biology. 57 (7), 65-81 (2012).
  18. Rodríguez-Frutos, B., et al. Enhanced brain-derived neurotrophic factor delivery by ultrasound and microbubbles promotes white matter repair after stroke. Biomaterials. 100, 41-52 (2016).
  19. Karakatsani, M. E., et al. Amelioration of the nigrostriatal pathway facilitated by ultrasound-mediated neurotrophic delivery in early Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 303, 289-301 (2019).
  20. Lin, C. -Y., et al. Non-invasive, neuron-specific gene therapy by focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in Parkinson's disease mouse model. Journal of Controlled Release. 235, 72-81 (2016).
  21. Long, L., et al. Treatment of Parkinson's disease in rats by Nrf2 transfection using MRI-guided focused ultrasound delivery of nanomicrobubbles. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2016).
  22. Fan, C. -H., Lin, C. -Y., Liu, H. -L., Yeh, C. -K. Ultrasound targeted CNS gene delivery for Parkinson’s disease treatment. Journal of Controlled Release. 261, 246-262 (2017).
  23. Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
  24. Todd, N., et al. Modulation of brain function by targeted delivery of GABA through the disrupted blood-brain barrier. Neuroimage. 189, 267-275 (2019).
  25. Nance, E., et al. Non-invasive delivery of stealth, brain-penetrating nanoparticles across the blood-brain barrier using MRI-guided focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 189, 123-132 (2014).
  26. Mulik, R. S., et al. Localized delivery of low-density lipoprotein docosahexaenoic acid nanoparticles to the rat brain using focused ultrasound. Biomaterials. 83, 257-268 (2016).
  27. Lin, T., et al. Blood-Brain-Barrier-Penetrating Albumin Nanoparticles for Biomimetic Drug Delivery via Albumin-Binding Protein Pathways for Antiglioma Therapy. ACS Nano. 10 (11), 9999-10012 (2016).
  28. Timbie, K. F., et al. MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 263, 120-131 (2017).
  29. Fan, C. -H., et al. SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced brain-tumor drug delivery. Biomaterials. 34 (14), 3706-3715 (2013).
  30. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321(2019).
  31. Chen, K. -T., Wei, K. -C., Liu, H. -L. Theranostic Strategy of Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for CNS Disease Treatment. Frontiers in Pharmacology. 10, 86(2019).
  32. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336(2018).
  33. Stewart, K., Schroeder, V. Compound Administration I. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i (2020).
  34. Liu, H. -L., et al. Magnetic resonance imaging enhanced by superparamagnetic iron oxide particles: usefulness for distinguishing between focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption and brain hemorrhage. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 29 (1), 31-38 (2009).
  35. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  36. Marty, B., et al. Dynamic study of blood-brain barrier closure after its disruption using ultrasound: a quantitative analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (10), 1948-1958 (2012).
  37. Alonso, A., Reinz, E., Fatar, M., Hennerici, M. G., Meairs, S. Clearance of albumin following ultrasound-induced blood-brain barrier opening is mediated by glial but not neuronal cells. Brain Research. 1411, 9-16 (2011).
  38. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
  39. McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The Effects of Oxygen on Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Disruption in Mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
  40. O'Reilly, M. A., Muller, A., Hynynen, K. Ultrasound insertion loss of rat parietal bone appears to be proportional to animal mass at submegahertz frequencies. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (11), 1930-1937 (2011).
  41. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MicrobelinfusieEvans Blue kleurstofgadobutrolcontrastMRI begeleidingstereotactisch framestaartveneuterechogelwaterbad
Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.