Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het optisch extraheren en catalogiseren van aangeboren cellulaire fluorescentiehandtekeningen (d.w.z. cellulaire autofluorescentie) van elke individuele levende cel verdeeld in een driedimensionale ruimte. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van de aangeboren fluorescentiesignatuur van diverse biologische systemen met een eencellige resolutie, waaronder cellen van bacteriën, schimmels, gisten, planten en dieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Reconstructie van eencellige aangeboren fluorescentiehandtekeningen door confocale microscopie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier beschreven is confocale reflectie microscopie-geassisteerde eencellige aangeboren fluorescentie analyse (CRIF), een minimaal invasieve methode voor het reconstrueren van de aangeboren cellulaire fluorescentiesignatuur van elke individuele levende cel in een populatie verdeeld in een driedimensionale (3D) ruimte. De aangeboren fluorescentiesignatuur van een cel is een verzameling fluorescentiesignalen die worden uitgezonden door verschillende biomoleculen in de cel. Eerdere studies hebben vastgesteld dat aangeboren fluorescentiehandtekeningen verschillende cellulaire eigenschappen en verschillen in fysiologische status weerspiegelen en een rijke bron van informatie zijn voor celkarakterisering en identificatie. Aangeboren fluorescentiehandtekeningen zijn traditioneel geanalyseerd op populatieniveau, waardoor een klonale cultuur nodig is, maar niet op het niveau van één cel. CRIF is met name geschikt voor studies die 3D-resolutie en/of selectieve extractie van fluorescentiesignalen uit individuele cellen vereisen. Omdat de fluorescentiesignatuur een aangeboren eigenschap van een cel is, is CRIF ook geschikt voor tag-vrije voorspelling van het type en/of fysiologische status van intacte en enkele cellen. Deze methode kan een krachtig hulpmiddel zijn voor gestroomlijnde celanalyse, waarbij het fenotype van elke afzonderlijke cel in een heterogene populatie direct kan worden beoordeeld aan de hand van zijn autofluorescentiesignatuur onder een microscoop zonder cellabels.
Inleiding
Diverse biomoleculen in een cel1 zenden autofluorescentiesignalen uit en de aangeboren fluorescentiesignatuur van een cel bestaat uit de assemblage van deze signalen. Deze kenmerkende fluorescentie weerspiegelt verschillende cellulaire eigenschappen en ook verschillen in fysiologische status. Analyse van aangeboren fluorescentie is minimaal invasief en kan een aanvulling vormen op traditionele, meer invasieve microbiologische sondes die een reeks sporen achterlaten van milde metabole modificatie tot volledige celvernietiging. Hoewel traditionele technieken zoals DNA- of celinhoudextractie2,3, fluorescerende in situ hybridisatie4 en de introductie van fluorescerende reportergenen in het genoom effectief zijn bij het bepalen van het celtype of de fysiologische status, vereisen ze vaak manipulatie van de cellen of invasieve tagging.
Studies naar de aangeboren fluorescentie van verschillende levende en intacte microbiële kolonies, waaronder bulk microbiële cultuursuspensies5,6, actief slib7, zoogdierweefsels8,9 en zoogdiercellen1,10, hebben aangetoond dat aangeboren fluorescentieanalyse tagvrije analyse van celtypen en fysiologische status vergemakkelijkt. Aangeboren fluorescentiehandtekeningen zijn traditioneel geanalyseerd op populatieniveau en niet op het niveau van één cel, en vereisen dus een klonale cultuur. Daarentegen reconstrueert en catalogiseert de confocale reflectionmicroscopie-geassisteerde eencellige innate fluorescence analysis (CRIF) -techniek11 de aangeboren cellulaire fluorescentiesignatuur van elke individuele levende microbiële cel. Bovendien kan CRIF systematisch de aangeboren fluorescentiesignatuur van een enkele microbiële cel verzamelen binnen een populatie die is verdeeld in een driedimensionale (3D) ruimte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van het monster
- Plaats een 1 mm dikke siliconen pakking met putjes op een glazen schuif.
- Plaats een 1 mm dikke 0,8% (w/v) agarose plaat in de put van de siliconen pakking.
- Verdun de celdichtheid van een willekeurige microbiële celcultuur tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD660) = 1,0.
- Plaats een aliquot van 5 μL celsuspensie op de agaroseplaat.
- Dek voorzichtig af met een glazen afdekplaat.
2. Opstelling van een microscoop
OPMERKING: De CRIF-techniek combineert confocale reflectiemicroscopie (CRM) en meerkanaals confocale microspectroscopie. CRM dient als de bron van informatie voor cellulaire morfologie en ruimtelijke lokalisatie, die onafhankelijk is van cellulaire aangeboren fluorescentie. Meerkanaals confocale microspectroscopie levert de spectrale informatie van cellulaire aangeboren fluorescentie. In het volgende protocol wordt elke afbeelding die is verkregen met CRM of confocale fluorescentiesmicrospectroscopie respectievelijk een CRM-afbeelding of een meerkanaals confocale microspectroscopieafbeelding genoemd.
- Sluit een confocale microscoop met gedescande spectrale kanalen aan op een fotomultiplicatorbuis (PMT) of GaAsP-detector.
OPMERKING: Deze opstellingen zijn verkrijgbaar bij verschillende fabrikanten. - Rust de microscoop uit met een na-objectief (high numerical aperture) met voldoende vergroting.
OPMERKING: Een 63x objectief met NA > 1,4 wordt aanbevolen voor het analyseren van bacteriële cellen. - Rust de microscoop uit met een halfreflectiespiegel (bijv. NT 80/20) om CRM te accommoderen, die afhankelijk is van de cellulaire verstrooiing van invallend licht om de celmorfologie te visualiseren.
- Voor meerkanaals confocale microspectroscopie, rust de microscoop uit met dichroïsche spiegels. Gebruik bijvoorbeeld MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 of MBS 488/543/633 bundelsplitters voor respectievelijk 405, 458, 488, 514, 543 of 633 nm excitatie.
- Pas de verlichtingsintensiteit voor elke excitatiegolflengte aan met behulp van een laservermogensmeter. Houd de output onder de microscoop constant door excitatiegolflengten (gebruik bijvoorbeeld 50 μW met het 63x objectief).
3. Beeldverwerving
- Stel de pinhole-grootte in op 1 AE met behulp van de microscoopsoftware.
- Stel de pixelbezettingstijd (d.w.z. scansnelheid) in voor elke excitatiegolflengte.
OPMERKING: Een te lange pixelverblijftijd kan cellen beschadigen. Vermijd een te lange pixelverblijftijd om fotoschade voor de cellen te minimaliseren. Voor bacteriële monsters is een pixelverblijftijd <55,6 μs/μm2 (wanneer de stralingsuitvoer onder de microscoop ~17 μW/cm2 is) meestal geschikt om groeiremming te voorkomen. Deze parameter kan variëren afhankelijk van de organismen en experimentele opstellingen. - Stel de scanresolutie in. Gebruik voor kleine cellen zoals bacteriën een scangebied van 1.024 x 1.024.
- Stel het Z-scanbereik zo in dat de interessegebieden worden gedekt.
OPMERKING: Voor bacteriële en gistcelmonsters verdeeld over een agarose-plaat is een Z-scanbereik van ~ 15 μm meestal voldoende. - Stel de gescande detector in om het zichtbare golflengtebereik vast te leggen (bijvoorbeeld 416−691 nm). Gebruik een spectraal venster van 8−10 nm.
- Verkrijg meerkanaals confocale microspectroscopiebeelden in een volgorde van langste tot kortste excitatiegolflengten om Z-stapels fluorescentiebeelden te maken.
- CRM-afbeeldingen aanschaffen.
- Sla de verkregen afbeeldingen op als 16-bits tiff-bestanden in een map. Geef de bestanden een naam met behulp van de naamgevingsconventie XXXcYYzZZ.tif, waarbij XXX de excitatiegolflengte is, YY het detectorkanaalnummer is, ZZ het Z-segmentnummer en "c" en "z" respectievelijk voorvoegsels zijn voor het detectornummer en het Z-slice-nummer.
- Als bijvoorbeeld een meerkanaals confocale microspectroscopieafbeelding wordt gemaakt met een excitatiegolflengte van 405 nm, 1e detectorkanaal van de detectorarray, en het 5e segment van de Z-stack is, noem het dan "405c01z05.tif". Gebruik voor CRM-afbeeldingen de tekenreeks "CRM" in plaats van XXX (bijvoorbeeld "CRMc01z05.tif").).
OPMERKING: Bepaal of 2D- of 3D-segmentatie het meest geschikt is voor de afbeeldingsgegevens. Gebruik een 2D-segmentatiemethode in situaties waarin kleine cellen beperkt zijn tot een 2D-vlak (bijvoorbeeld een bacteriële populatie die zich aan een glazen oppervlak hecht). Gebruik de 3D-segmentatiemethode in situaties waarin de celpopulatie is verdeeld in een driedimensionale ruimte (bijvoorbeeld biofilms en weefselmonsters) of de celgroottes groter zijn dan de dikte van de optische plak (bijvoorbeeld gistcellen, zoogdiercellen). Voor 2D-segmentatie zie paragraaf 4; voor 3D-segmentatie, refereer je naar paragraaf 5.
- Als bijvoorbeeld een meerkanaals confocale microspectroscopieafbeelding wordt gemaakt met een excitatiegolflengte van 405 nm, 1e detectorkanaal van de detectorarray, en het 5e segment van de Z-stack is, noem het dan "405c01z05.tif". Gebruik voor CRM-afbeeldingen de tekenreeks "CRM" in plaats van XXX (bijvoorbeeld "CRMc01z05.tif").).
4. 2D beeldanalyse
- Rust een werkstation uit met beeldanalysesoftware (bijv. MATLAB).
- Voer celsegmentatie en reconstructie uit van eencellige aangeboren fluorescentiehandtekeningen.
- Open de beeldanalysesoftware.
- Dubbelklik en open een van de meegeleverde scripts "Script2D.m".
- Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Er zou een mapselectievenster moeten verschijnen.
- Selecteer de map die in stap 3.8 is gemaakt en klik vervolgens op Openen om door te gaan. Er verschijnt automatisch een dialoogvenster waarin de invoer van de segmentatieparameter wordt gevraagd.
OPMERKING: Selecteer voor testdoeleinden de verstrekte dataset ("Sample_2D"). De voorbeeldgegevensset wordt geleverd als een gecomprimeerd bestand en moet van tevoren worden uitgepakt. - Voer de segmentatieparameters in: Drempelwaarde voor binarisatie van afbeeldingen (0−1) voor binarisatie van afbeeldingen = 0,45, bovenste drempel voor een celgebied (in pixels) = 200, onderste drempel voor een celgebied (in pixels) = 10 en het aantal detectoren = 32. Klik op OK om door te gaan.
OPMERKING: Deze parameters moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de beeldkwaliteit. - Er moet een nieuw afbeeldingsvenster met een CRM-afbeelding worden weergegeven. Selecteer een willekeurig achtergrondgebied (d.w.z. een gebied waar cellen afwezig zijn) om te gebruiken voor het aftrekken van de achtergrond. Teken een rechthoek in de CRM-afbeelding door met de muis te slepen. Dubbelklik binnen het geselecteerde gebied om de selectie te bevestigen.
- Zoek een nieuwe map met de naam Handtekening in dezelfde map die is geselecteerd in stap 4.2.4.
OPMERKING: Met de opgegeven code wordt deze map automatisch gemaakt. De map "Signature" slaat de aangeboren fluorescentiesignatuur van elke microbiële cel binnen een populatie op als .png bestanden die serieel zijn genummerd naar een gemeenschappelijk voorvoegsel "Signature".
5.3D beeldanalyse
- Rust een werkstation uit met de beeldanalysesoftware (Tabel met materialen).
- Voer celsegmentatie en reconstructie uit van eencellige aangeboren fluorescentiehandtekeningen.
- Open de beeldanalysesoftware.
- Dubbelklik en open het meegeleverde script "Script3D.m".
- Ga naar het tabblad Editor en klik op Uitvoeren. Er zou een mapselectievenster moeten verschijnen.
- Selecteer de map die in stap 3.8 is gemaakt en klik vervolgens op Openen om door te gaan. Er verschijnt automatisch een dialoogvenster waarin de invoer van de segmentatieparameters wordt gevraagd.
OPMERKING: Selecteer voor testdoeleinden de verstrekte dataset ("Sample_3D"). De voorbeeldgegevensset wordt geleverd als een gecomprimeerd bestand en moet van tevoren worden uitgepakt. - Voer de segmentatieparameters in: Drempel van afbeeldings binarisatie (0-1) voor afbeeldings binarisatie = 0,01, Bovenste drempel voor een celvolume (in pixels) = 1.000, Onderste drempel voor een celgebied (in pixels) = 20, X Pixelgrootte [μm / pixel] = 0,26, Y Pixelgrootte [μm / pixel] = 0,26, Z-pixelgrootte [μm / pixel] = 0,42 en Het aantal detectoren = 32. Klik op OK om door te gaan; er verschijnt een dialoogvenster waarin de invoer wordt gevraagd om het aantal excitatiegolflengten.
OPMERKING: Deze parameters moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de beeldkwaliteit. - Voer het aantal golflengten in dat wordt gebruikt voor beeldacquisitie (als bijvoorbeeld 405, 488, 561, 630 worden gebruikt, voert u 4 in het dialoogvenster in). Klik op OK.
- Voer de excitatiegolflengten in een reeks in van de kortste (d.w.z. de doosnaam: Excitatie nr. 1) tot de langste golflengte in de dialoogvensters. Klik op OK om door te gaan; er zou een nieuw afbeeldingsvenster moeten verschijnen met een CRM-afbeelding.
- Selecteer het willekeurige achtergrondgebied (d.w.z. het gebied waar cellen afwezig zijn) dat moet worden gebruikt voor het aftrekken van de achtergrond. Teken een rechthoek in de CRM-afbeelding door met de muis te slepen. Dubbelklik binnen het geselecteerde gebied om de selectie te bevestigen.
- Zoek de map met de naam Handtekening in de map die is geselecteerd in stap 5.2.4.
OPMERKING: Met de opgegeven code wordt deze map automatisch gemaakt. De map "Signature" slaat de aangeboren fluorescentiesignatuur van elke afzonderlijke microbiële cel binnen een populatie op als .png bestanden die serieel zijn genummerd naar een gemeenschappelijk voorvoegsel "Signature".
6. Statistische analyse
OPMERKING: Voer dimensionale reductietechnieken uit (bijv. Principal Component Analysis [PCA]) om de verdeling van hyperspectrums van de celpopulaties te visualiseren. Het meegeleverde script (PCA.py) voert PCA uit voor twee celpopulaties (d.w.z. twee klassen).
- Rust een werkstation uit met de programmeertaal en bijbehorende bibliotheken en modules (Tabel met materialen).
- Maak een lege map in de C-schijf (of gelijkwaardig) en geef de map de naam "Parent_directory" (d.w.z. C:/ Parent_ directory).
- Sla de fluorescentiehandtekeningen (bijvoorbeeld de .png bestanden die zijn gegenereerd in stap 4.2.7) van elk van de twee celpopulaties op in twee afzonderlijke mappen.
OPMERKING: De twee mappen moeten zich beide in de "Parent_directory" bevinden.
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Handtekening01.png Handtekening02.png :putidaKT2442/
Handtekening01.png
Handtekening02.png
: - Download PCA.py naar de "Parent_directory".
- Open de opdrachtregelinterface van het werkstation.
- Typ "python C:/Parent_directory/PCA.py" in de opdrachtregelinterface.
- Selecteer de "Parent_directory" nadat het bericht 'Selecteer doelmap' is weergegeven.
- Zoek in de "C:/Parent_directory" "PCA.png", die een resulterende PCA-plot bevat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1A toont de typische eencellige fluorescentiesignatuur van een bacteriële cel gepresenteerd als een traditionele spectrumplot (boven) en als een heatmap (midden). Figuur 1B toont het resultaat van een nauwkeurige 2D-celsegmentatie bovenop het oorspronkelijke CRM-beeld van een populatie bodembacteriën (Pseudomonas putida KT2440)12. De resulterende aangeboren fluorescentiehandtekeningen voor de populatie worden gepresenteerd...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee kritieke punten in deze methode die nauwlettend moeten worden gevolgd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen: 1) houd het laservermogen onder het microscoopobject objectief consistent door excitatiegolflengten en experimenten, en 2) voer nauwkeurige celsegmentatie uit.
Het eerste punt is vooral belangrijk bij het vergelijken van de aangeboren fluorescentiesignatuur tussen verschillende experimenten. Vermijd eenvoudigweg het toepassen van dezelfde "procent output" -instellinge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport en Technologie van Japan (18K04843) aan Y. Yawata, de JST ERATO (JPMJER1502) aan N. Nomura.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, of MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (vermogensmeterconsole) en S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | Voor bacteriecultuur |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB versie 2019a of nieuwer, Image Processing Toolbox is nodig | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | bijv. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss), NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python en bibliotheken, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) zijn vereist om het meegeleverde PCA-script uit te voeren. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | Een high-performance workstation met discrete GPU's wordt aanbevolen. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | Voor gistcultuur |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
Referenties
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
