Methodenartikel

Evaluatie van oxidatieve stress in biologische monsters met behulp van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test

DOI:

10.3791/61122

⸱

12 mei 2020

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test is om oxidatieve stress in biologische monsters te beoordelen door de productie van lipide peroxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde, te meten met behulp van zichtbare golflengtespectrofotometrie bij 532 nm. De hier beschreven methode kan worden toegepast op menselijk serum, cellysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks zijn beperkte analytische specificiteit en robuustheid, is de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen (TBARS) -test op grote schaal gebruikt als een generieke metriek voor lipideperoxidatie in biologische vloeistoffen. Het wordt vaak beschouwd als een goede indicator van de niveaus van oxidatieve stress in een biologisch monster, op voorwaarde dat het monster op de juiste manier is behandeld en opgeslagen. De test omvat de reactie van lipideperoxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde (MDA), met thiobarbiturinezuur (TBA), wat leidt tot de vorming van MDA-TBA2-adducten genaamd TBARS. TBARS levert een rood-roze kleur op die spectrofotometrisch gemeten kan worden bij 532 nm. De TBARS-test wordt uitgevoerd onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C. Zuivere MDA is onstabiel, maar deze omstandigheden maken het mogelijk om MDA vrij te maken uit MDA bis (dimethylacetaal), dat in deze methode als analytische standaard wordt gebruikt. De TBARS-test is een eenvoudige methode die in ongeveer 2 uur kan worden voltooid. De bereiding van assay-reagentia wordt hier in detail beschreven. Prijsbewuste onderzoekers kunnen deze reagentia voor meerdere experimenten tegen lage kosten gebruiken in plaats van een dure TBARS-testkit te kopen die alleen de constructie van een enkele standaardcurve mogelijk maakt (en dus slechts voor één experiment kan worden gebruikt). De toepasbaarheid van deze TBARS-test wordt aangetoond in menselijk serum, lipoproteïnen met lage dichtheid en cellysaten. De test is consistent en reproduceerbaar en detectiegrenzen van 1,1 μM kunnen worden bereikt. Aanbevelingen voor het gebruik en de interpretatie van de spectrofotometrische TBARS-test worden gegeven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipideperoxidatie is een proces waarbij vrije radicalen, zoals reactieve zuurstofsoorten en reactieve stikstofsoorten, koolstof-koolstof dubbele bindingen in lipiden aanvallen, een proces waarbij een waterstof uit een koolstof wordt gewonnen en een zuurstofmolecuul wordt ingebracht. Dit proces leidt tot een mengsel van complexe producten, waaronder lipide peroxylradicalen en hydroperoxiden als primaire producten, evenals malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenaal als overheersende secundaire producten1.

MDA is veel gebruikt in biomedisch onderzoek als een marker van lipideperoxidatie vanwege de gemakkelijke reactie met thiobarbiturinezuur (TBA). De reactie leidt tot de vorming van MDA-TBA2, een conjugaat dat absorbeert in het zichtbare spectrum bij 532 nm en een rood-roze kleur produceert2. Andere moleculen afgeleid van lipideperoxidatie naast MDA kunnen ook reageren met TBA en licht absorberen bij 532 nm, wat bijdraagt aan het totale absorptiesignaal dat wordt gemeten. Evenzo kan MDA reageren met de meeste andere belangrijke klassen van biomoleculen, waardoor de toegankelijkheid voor reactie met TBA3,4 mogelijk wordt beperkt. Als zodanig wordt deze traditionele test eenvoudigweg beschouwd als het meten van "thiobarbiturinezuur reactieve stoffen" of TBARS5.

Wanneer de TBARS-test correct wordt toegepast en geïnterpreteerd, wordt deze over het algemeen beschouwd als een goede indicator van de totale niveaus van oxidatieve stress in een biologisch monster6. Helaas, zoals gedocumenteerd door Khoubnasabjafari en anderen, wordt de TBARS-test vaak uitgevoerd en geïnterpreteerd op manieren die dubieuze conclusies mogelijk maken3,4,7,8,9,10,11. De oorzaken hiervoor zijn voornamelijk geworteld in steekproefgerelateerde pre-analytische variabelen en een gebrek aan assay-robuustheid die schijnbaar kleine variaties in het assayprotocol verbiedt zonder substantiële veranderingen in assayresultaten1,7,12,13.

Preanalytische variabelen met betrekking tot de hantering en opslag van biospecimenen (bv. bloedplasma dat tijdelijk op -20 °C wordt gehouden)14,15 kunnen een grote invloed hebben op de resultaten van de TBARS-test16,17; zozeer zelfs dat de resultaten van TBARS-assays niet tussen verschillende laboratoria mogen worden vergeleken, tenzij dit wordt gerechtvaardigd door expliciete interlaboratoriumanalyseve validatiegegevens. Deze aanbeveling is vergelijkbaar met hoe western blots vaak worden gebruikt en geïnterpreteerd. Vergelijkingen van banddichtheden zijn geldig voor binnen-blot en misschien binnen-laboratoriumstudies, maar het vergelijken van banddichtheden tussen laboratoria wordt over het algemeen als een ongeldige praktijk beschouwd.

Sommige onderzoekers hebben gesuggereerd dat MDA zoals gemeten door de TBARS-test eenvoudigweg niet voldoet aan de analytische of klinische criteria die vereist zijn voor een aanvaardbare biomarker3,9,10,18,19. Inderdaad, als de test niet meer dan 50 jaar geleden was ontwikkeld, zou het waarschijnlijk niet het wijdverspreide gebruik en de stilzwijgende aanvaardbaarheid hebben gekregen die het vandaag heeft. Hoewel er andere assays zijn met een grotere analytische gevoeligheid, specificiteit en robuustheid die worden gebruikt voor het bepalen van oxidatieve stress, blijft de TBARS-assay op basis van absorptie bij 532 nm veruit een van de meest gebruikte assays voor de bepaling van lipideperoxidatie20, en daarmee beoordeling van oxidatieve stress.

De TBARS-test is alleen te vinden als een dure kit (meer dan 400 Amerikaanse dollars), waarin de instructies geen gedetailleerde informatie geven over de meeste concentraties van de gebruikte reagentia. Bovendien kunnen de meegeleverde reagentia slechts voor één experiment worden gebruikt, omdat er slechts één colorimetrische standaardcurve per kit kan worden gemaakt. Dit kan problematisch zijn voor onderzoekers die van plan zijn om niveaus van oxidatie te bepalen binnen een paar monsters op verschillende tijdstippen, omdat dezelfde standaardcurve niet op meerdere tijdstippen kan worden gebruikt. Daarom moeten meerdere kits worden gekocht voor meerdere experimenten. Momenteel is er, tenzij een dure kit wordt gekocht, geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor het uitvoeren van een TBARS-test. Sommige onderzoekers hebben in het verleden vaag beschreven hoe een TBARS-assay21,22 moet worden uitgevoerd, maar noch een volledig gedetailleerd protocol of uitgebreide video over het uitvoeren van de TBARS-test zonder een dure kit is beschikbaar in de literatuur.

Hier rapporteren we een gedetailleerde, analytisch gevalideerde methodologie voor doeleinden over het uitvoeren van een TBARS-test op een eenvoudige, reproduceerbare en goedkope manier. Veranderingen in de lipideperoxidatie van menselijk serum, HepG2-lysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid bij behandeling met Cu(II)-ionen worden aangetoond als illustratieve toepassingen voor de TBARS-test. De resultaten tonen aan dat deze TBARS-test consistent en reproduceerbaar is op een dagelijkse basis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke serummonsters werden verkregen van instemmende vrijwilligers onder IRB-goedkeuring en volgens de principes die zijn uitgedrukt in de Verklaring van Helsinki. Monsters werden gecodeerd en gedeïdentificeerd voordat ze naar het analytisch laboratorium werden overgebracht.

1. Monstervoorbereiding

  1. HepG2-cellysaten
    1. Zaai ongeveer 10 x 106 HepG2-cellen per kolf in 16 T75-kolven met 14 ml EMEM-media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en kweekcellen gedurende 2 dagen.
    2. Bereid RIPA-buffer voor: voeg in een buis van 50 ml 1,5 ml 5 m NaCl, 2,5 ml 1 m Tris-HCl (pH = 7), 500 μl NP-40-reagens toe en breng het uiteindelijke volume vervolgens op 50 ml met DI-water.
    3. Bereid lysisbuffer voor: aliquot 20 ml RIPA-buffer in een buis van 50 ml en voeg 200 μl van een 100x proteaseremmeroplossing toe om eiwit- en lipideafbraak te remmen. Bewaren bij 4 °C.
      OPMERKING: Lysisbuffer is compatibel met TBARS-reagentia en interfereert niet met de absorptie bij 532 nm. Als u van plan bent een andere lysisbuffer te gebruiken of extra ingrediënten aan de lysisbuffer toe te voegen, moeten voorbereidende validatiestudies worden uitgevoerd om te verifiëren of lysisbuffercomponenten compatibel zijn met de TBARS-test.
    4. Verwijder media met 10% FBS en was de cellen 2x met 5 ml koude, steriele 1x PBS.
    5. Voeg 1 ml lysisbuffer toe aan de T75-kolven die de cellen bevatten en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) met constant wervelen om ervoor te zorgen dat de buffer goed wordt verdeeld.
    6. Verzamel lysaten in de juiste geëtiketteerde 2 ml snap-cap polypropyleen buizen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
    7. Draai de lysaten op 5.000 x g gedurende 10 minuten bij RT om celresten te verzamelen en zuig supernatanten op in een enkele buis van 15 ml.
    8. Concentraat cellysaat supernatant viervoudig met behulp van een Speed Vac bij 50 °C en 3 mbar en maak aliquots van 94 μL elk in 2 ml snap-cap polypropyleen buizen. Bewaar monsters bij -80 °C totdat ze worden gebruikt voor in vitro oxidatie en/of TBARS-assay.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat de cel lysaat supernatant wordt geconcentreerd, kunnen cellen ook worden losgemaakt met behulp van 3 ml 1x trypsine, geneutraliseerd met 6 ml media en 2x gewassen met 5 ml koude PBS. Celkorrels kunnen vervolgens worden gereconstitueerd in 250 μL lysisbuffer en vervolgens kunnen stappen 1.1.6 en 1.1.7 worden uitgevoerd.
    9. Bereid een 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4).
      1. Bereid azijnzuuroplossing (pH = 4): Verdun 1 μL ijsazijn in 100 ml DI-water (pH moet ongeveer 4 zijn, maar bevestig dit met een pH-meter). Voeg meer water of azijnzuur toe om de pH op 4 te zetten.
      2. Gewicht ongeveer 0,1936 g koper II-chloride en los op in 10 ml van de azijnzuuroplossing (pH = 4) om een CuCl2-kolf van 144 mM te maken. Vul 490 μL uit deze oplossing en voeg toe aan 1.510 μL azijnzuur (pH = 4) om een CuCl2-oplossing van 35 mM te maken.
    10. Aliquot 6 μL uit de 35 mM CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 94 μL cellysaat bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ongeveer 2 mM te maken. Voeg 6 μL van een azijnzuuroplossing (pH = 4) zonder CuCl2 toe aan zes monsters met 94 μL cellysaten om als controle te gebruiken. Het uiteindelijke volume cellysaat moet 100 μL zijn, wat zal worden gebruikt voor de TBARS-test.
      OPMERKING: Het maken van de 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4) is noodzakelijk om precipitatie van koperhydroxide te voorkomen.
    11. Incubeer monsters in een oven bij 37 °C gedurende 24 uur en voer een TBARS-test uit op elk monster met een eindvolume van 100 μL.
    12. Herhaal stap 1.1.9 en 1.1.11 2x op afzonderlijke dagen om de reproduceerbaarheid van de TBARS-test voor HepG2-cellysaten te controleren.
  2. Lipoproteïnen met lage dichtheid
    OPMERKING: Typisch, voorgezuiverd lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) bevat een bepaalde hoeveelheid EDTA. LDL-monsters die hier worden gebruikt, bevatten 0,01% EDTA. EDTA kan de in vitro Cu(II)-gemedieerde oxidatie van LDL remmen. Daarom kan het nodig zijn om EDTA uit LDL-monsters te verwijderen voorafgaand aan experimenten of analyse. Stappen 1.2.1–1.2.5 beschrijven dit proces.
    LET OP: Natriumhydroxide is corrosief en veroorzaakt irritatie in huid en ogen. Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
    1. Aliquot 24 μL uit een 5,51 mg / ml LDL-voorraad (eiwitconcentratie bepaald door gemodificeerde Lowry-methode met BSA als standaard) in correct gelabelde 1 ml snap-cap polypropyleenbuizen. Maak zoveel aliquots als nodig is en bewaar bij 4 °C tot gebruik in oxidatie en/of TBARS-assay.
    2. Bereid een HEPES-buffer van 10 mM in 0,15 M NaCl, aangepast tot pH = 7 met NaOH-kralen: los 4,39 g NaCl op in 0,49 l water en voeg vervolgens 1,19 g HEPES toe. Los goed op met een roerstaaf. Voeg natriumhydroxideparels toe tot de pH 7 is. Verdun tot 0,5 L met water. Buffer bewaren bij 4 °C en binnen 3 maanden gebruiken.
    3. Voeg 476 μL van de 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) toe aan de aliquoted LDL-monsters om het uiteindelijke volume op 500 μL te brengen. Voeg verdund LDL-monster toe aan een centrifugaal spinfilterapparaat van 0,5 ml met een afsnijding van het molecuulgewicht van 100 K.
    4. Spin monsters bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij RT, waardoor een eindretentaatvolume van ongeveer 30 μL overblijft. Reconstitueer monsters in 480 μL van de 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7) en draai opnieuw bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij RT. Voer deze stap 2x uit voor een totaal van vier spin-throughs.
    5. Plaats het filterapparaat ondersteboven in een nieuwe polypropyleen buis met snap-cap van 2 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1000 x g om LDL-monster te verzamelen (eindvolume = ongeveer 30 μL).
    6. Aliquot monster in de juiste gelabelde buis van 1 ml en voeg 20 μL water toe aan elk monster om een eindvolume van 50 μL te bereiken.
    7. Bereiding van 200 μM CuCl2 stamoplossing in azijnzuur (pH = 4)
      1. Azijnzuuroplossing bereiden (pH = 4): zie stap 1.1.9.1.
      2. Bereid een CuCl2-stamoplossing van 144 mM (zie stap 1.1.9.2), vervolgens 5,5 μL uit de CuCl2-voorraad van 144 mM en los op in een eindvolume van 4 ml azijnzuur (pH = 4) om de 200 μM-oplossing te maken.
    8. Aliquot 2,7 μL uit de 200 μM CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 50 μL LDL bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ~ 10 μM te bereiken. Voeg 2,7 μL uit een azijnzuuroplossing (pH = 4) die geen CuCl2 bevat toe aan zes monsters met 50 μL LDL die voor de controles moeten worden gebruikt.
    9. Incubeer LDL-monsters gedurende 2 uur in een oven bij 37 °C. Breng na 2 uur het uiteindelijke volume op 100 μL voor elk monster met 10 mM HEPES-buffer in 0,15 M NaCl (pH = 7). Voer onmiddellijk een TBARS-test uit.
    10. Herhaal stap 1.2.3–1.2.9 2x op twee verschillende dagen om de reproductiviteit van de TBARS-test te testen.
  3. Menselijk serum
    1. Maak van een menselijk serummonster aliquots van elk 94 μL in 2 ml karapropyleenbuizen met snap-cap en bewaar monsters bij -80 °C.
    2. Bereid een 35 mM CuCl2-stamoplossing in azijnzuur (pH = 4): zie stap 1.1.9.
    3. Aliquot 6 μL uit de CuCl2-stamoplossing en voeg deze toe aan zes monsters die 94 μL menselijk serum bevatten om een uiteindelijke CuCl2-concentratie van ongeveer 2 mM te maken. Voeg 6 μL van een azijnzuuroplossing (pH = 4) zonder CuCl2 toe aan zes monsters met 94 μL menselijk serum om als controle te gebruiken.
    4. Incubeer menselijke serummonsters gedurende 24 uur in een oven bij 37 °C en bepaal de oxidatieniveaus met de TBARS-test (rubriek 4).
    5. Herhaal stap 1.3.2–1.3.4 2x op twee afzonderlijke dagen om de reproduceerbaarheid van de TBARS-test te bepalen.

2. Reagensvoorbereiding

LET OP: Thiobarbiturinezuur veroorzaakt huid- en oogirritatie en kan schadelijk zijn bij inademing of huidabsorptie. Azijnzuur kan bij inademing inwendige organen beschadigen. Bereid alle zure oplossingen in een zuurkast.

  1. Bereiding van 8,1% (m/v) natriumdodecylssulfaat (SDS)-oplossing
    1. Weeg 32,4 g SDS uit en los op in 350 ml DI-water in een bekerglas. Gebruik een magnetische roerstaaf om SDS voorzichtig op te lossen en te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Breng het uiteindelijke volume op 400 ml met di-water en bewaar de SDS-oplossing bij RT.
      OPMERKING: Hier wordt overtollige 8,1% SDS-oplossing bereid; voor 96 monsters is echter slechts ongeveer 20 ml van de 8,1% SDS-oplossing nodig. Bereid deze oplossing voor op basis van het aantal monsters dat wordt geanalyseerd.
  2. Bereiding van 3,5 M natriumacetaatbuffer (pH = 4)
    1. Verdun 100 ml ijsazijn in 350 ml DI-water in een bekerglas. Gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.
    2. Bereid een 6,5 M NaOH-oplossing met natriumhydroxideparels in water. Los 13 g NaOH-kralen op in 40 ml DI-water en breng tot een eindvolume van 50 ml met DI-water.
    3. Voeg langzaam ongeveer 46 ml van de 6,5 M NaOH-oplossing toe aan de azijnzuuroplossing terwijl u mengt met de roerstaaf (dit zou de pH tot 4 moeten verhogen, maar bevestig door langzaam de NaOH-oplossing toe te voegen tijdens het meten met behulp van een pH-meter).
    4. Breng het uiteindelijke volume op 500 ml met DI-water en bewaar natriumacetaatbuffer bij RT.
  3. Bereiding van 0,8% waterige oplossing van thiobarbiturinezuur (aangepast aan pH = 4)
    OPMERKING: In deze stap is de bereiding van thiobarbiturinezuur geoptimaliseerd voor grote volumes, omdat een groot aantal monsters zal worden geanalyseerd (108 monsters, exclusief de normen). Bereid deze oplossing voor afhankelijk van het aantal monsters dat voor analyse is gepland.
    1. Bereid een natriumhydroxideoplossing van 5 M met natriumhydroxideparels en water: los 4 g natriumhydroxideparels op in een eindvolume van 20 ml water. Bewaren in een plastic bakje. Deze oplossing moet voor elke batch vers worden bereid.
    2. Gewicht 4 g thiobarbiturinezuur en voeg 450 ml DI-water toe. Gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.
      OPMERKING: Deze oplossing zal uiteindelijk worden gebracht tot een totaal volume van 500 ml.
    3. Voeg tijdens het oplossen van thiobarbiturinezuur met een roerstaaf (langzaam en druppelsgewijs) ongeveer 3 ml van de 5 M NaOH-oplossing toe in stappen van 100 μL. Na toevoeging van de NaOH-oplossing zullen de thiobarbiturinezuurdeeltjes beginnen op te lossen.
    4. Als de thiobarbiturinezuurdeeltjes nog steeds niet volledig zijn opgelost, voeg dan meer van de 5 M NaOH-oplossing toe in stappen van 100 μL totdat alle thiobarbiturinezuurdeeltjes volledig zijn opgelost. Voor dit specifieke volume oplossing wordt in totaal 4 ml van de 5 M NaOH-oplossing toegevoegd om de thiobarbiturinezuurdeeltjes volledig op te lossen.
      OPMERKING: Bij deze concentratie zal thiobarbiturinezuur niet volledig oplossen tenzij de pH bijna 4 is.
    5. Stop met het toevoegen van NaOH nadat al het thiobarbiturinezuur volledig is opgelost. Vermijd het overschrijden van een pH van 4. De uiteindelijke pH kan worden gecontroleerd door 1 μL uit de mengoplossing thiobarbiturinezuur te nemen en deze op pH-papier te plaatsen.
    6. Breng het uiteindelijke volume op 500 ml met di-water en bewaar waterige 0,8% thiobarbiturinezuuroplossing bij RT.

3. Malondialdehyde bis(dimethylacetaal) standaard monstervoorbereiding

OPMERKING: Malondialdehyde (MDA) is onstabiel en niet in de handel verkrijgbaar. Er zijn echter verschillende chemische vormen van MDA die in de handel verkrijgbaar zijn, zoals MDA tetrabutylammoniumzout, MDA bis (dimethylacetaal) en MDA bis (diethylacetaal). Van deze drie chemische vormen wordt hier MDA bis (dimethylacetaal) gebruikt, omdat een meerderheid van de studies dezelfde standaard gebruikt21,22. Als u ervoor kiest om de andere twee chemische vormen van MDA te gebruiken, moet vooraf worden gevalideerd of ze geschikt zijn.

  1. Bereid een 550 μM MDA bis(dimethylacetaal)stamoplossing door 92 μL zuivere MDA bis(dimethylacetaal) te verdunnen in 1 L DI-water. Gebruik een magnetische roerstaaf om de oplossing gedurende 10 minuten grondig te mengen. Bewaar de oplossing bij 4 °C en gebruik deze binnen 1 maand.
  2. Bereid een 200 μM MDA bis(dimethylacetaal) door 726 μL uit de 550 μM MDA bis(dimethylacetaal)voorraad te verdunnen in 1274 μL DI-water. Deze 200 μM MDA bis(dimethylacetaal)oplossing moet vers worden bereid telkens wanneer een TBARS-test wordt uitgevoerd.
  3. Standaardcurvevoorbereiding: neem acht polypropyleenbuizen van 2 ml met snap-cap en label ze met de letters A tot en met H. Voeg MDA bis (dimethylacetaal) toe uit de voorraad van 200 μM en verdun in water zoals beschreven in tabel 1.
  4. Neem acht glazen buizen (13 mm x 100 mm) en label ze A-H en voeg vervolgens 100 μL standaard toe aan de overeenkomstige buizen. Voer zes replicaties uit voor de blanco standaard (monster A) om de detectiegrenzen van de TBARS-test te berekenen.
    OPMERKING: Het protocol kan hier niet langer dan 1 uur worden gepauzeerd.

4. TBARS-test

OPMERKING: Zodra de TBARS-test is gestart, moet deze worden voltooid zonder te stoppen.

  1. Neem zoveel glazen buizen als nodig is voor het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd en label ze met de namen van de monsters. Voeg vervolgens 100 μL van elk voorbereid monster (zoals hierboven beschreven) toe aan elke glazen buis.
  2. Voeg 200 μL van 8,1% SDS toe aan elk monster en standaard en draai de glazen buis voorzichtig in een cirkelvormige beweging om het monster te mengen.
  3. Voeg 1,5 ml van de 3,5 M natriumacetaatbuffer (pH = 4) toe aan elk monster en elke standaard.
  4. Voeg 1,5 ml van de waterige 0,8% thiobarbiturinezuuroplossing (pH = 4) toe aan elk monster en standaard.
  5. Breng het uiteindelijke volume op 4 ml voor elk monster en standaard door 700 μL DI-water toe te voegen.
  6. Sluit elke glazen buis goed af en incubeer in een verwarmingsblok dat gedurende 1 uur op 95 °C is ingesteld. Bedek de glazen buizen met aluminiumfolie om condensatie aan de bovenkant van de buizen te voorkomen.
  7. Verwijder de glazen buizen uit het verwarmingsblok en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  8. Centrifugeer monsters en normen bij 1500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bewaar na het centrifugeren de glazen buizen met de monsters en normen bij RT.
    OPMERKING: Als u de monsters op ijs of bij 4 °C bewaart, zal het gehele monster of de standaard neerslaan.
  9. Onmiddellijk na het centrifugeren, aliquot 150 μL supernatant uit elke buis en plaats in een aparte put van een 96 putplaat.
  10. Verwijder eventuele bubbels uit elke put met behulp van een pipetpunt.
    OPMERKING: De aanwezigheid van bubbels zal inconsistente absorptiemetingen opleveren, wat leidt tot een hoge onnauwkeurigheid van de test.
  11. Lees absorpties af bij 532 nm. Trek de gemiddelde absorptiewaarde van de blancomonsters af van alle andere absorptiemetingen.
  12. Maak een standaardcurve door de blanco-afgetrokken absorptiemetingen uit te zetten op 532 nm versus de bekende concentratie van elke standaard. Pas de gegevenspunten aan met lineaire regressie. Bereken onbekende monsterconcentraties met behulp van de vergelijking van de lineaire regressielijn die wordt verkregen uit de standaardcurve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C levert malondialdehyde (MDA) bis(dimethylacetaal) MDA23 op. MDA en nauw verwante chemische congeneren reageren met twee moleculen thiobarbiturinezuur (TBA) om verbindingen te produceren die thiobarbiturinezuurreactieve stoffen (TBARS) worden genoemd, die een roodroze kleur geven en een absorptie λmax hebben bij 532 nm (figuur 1, figuur 2). Met MDA bis (dimethylacetaal) als standaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks zijn beperkingen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 en een gebrek aan geschiktheid voor vergelijking tussen laboratoria, is de TBARS-test een van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gerapporteerde onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award no. R33 CA217702 en het Initiative for Maximizing Student Development (IMSD) programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x Sterile PBS pH 7.4 1 LVWR, PA101642--262cel lysis reagens
50 mL zelfstandige centrifugeerbuisCorning, NYCLS430897Algemeen materiaal
96-wellplaat, niet-behandeld, helder, met deksel, niet-sterielThermo Fisher Scientific, MA280895Om absorptie te meten
Amicon Ultra-0,5 100 kD centrifugaal spinfilterapparaatFisher Scientific, NHUFC510024LDL-zuivering
Doppen voor glazen buizenThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dvoor TBARS-test
Koper II ChlorideSIGMA, MO222011-250Gom oxidatie te induceren
Kweekbuisjes, wegwerpbaar, met schroefdop, boorsilicaatglas (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800voor TBARS-test
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC, VAHB-8065HepG2-celmedium
Eppendorf Safe-Lock buizen, 1,5 mLeppendorf, NY22363204Algemeen materiaal
Eppendorf Safe-Lock buizen, 2,0 mLGenesee Sceitific, CA22363352Algemeen materiaal
Fetaal bovien serum US-bronOmega Scientific, CAFB-11voor celkweek
Glazuur azijnzuurSIGMA, MO27225-1L-RTBARS-reagens
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)Thermo Scientific, MA87786cel lysis reagens
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL-oplosmiddel
HepG2-cellenATCC, VAHB-8065Biologische matrix prototype
Hydrochloorzuur (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212cel lysis reagens
Legend Micro 17 CentrifugeThermo Scientific, MA75002431Algemeen materiaal
Laag dichtheid Lipoproteïne, menselijk plasmaAthens Research & Technology, GA12-16-120412Biologische matrix prototype
Magnetische roerstaven, achthoek 6-sortimentVWR, PA58948-025Algemeen materiaal
Malondialdehyde bis (dimethylacetaal)SIGMA, MO8207560250TBARS-standaard
Multiskan Go Microplate SpectrofotometerFisher Scientific, NH51119200Om absorptie te meten
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLcel lysis reagens
NatriumchlorideSIGMA, MOS7653-1KGcel lysis reagens
Natriumdodecylsulfaat (SDS)SIGMA, MO436143-100GTBARS-reagens
NatriumhydroxideSIGMA, MO367176-2.5KGTBARS-reagens
SpeedVac ConcentratorThermo Scientific, MASC250EXPVoor het concentreren van cellopbrenging
T-75 Kolf, behandeld voor weefselcultuur, 250 mL, met filterdopUSA Scientific, FL658175celkweek
ThiobarbituurzuurSIGMA, MOT5500-100GTBARS-reagens
TRIS-basisFluka, GA93362cel lysis reagens
Trypsine (1x)VWR, PA16777-166Om HepG2-cellen los te maken

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
  2. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
  3. Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
  4. Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
  5. Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
  6. Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
  7. Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
  8. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
  9. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning "Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis". Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
  10. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on "Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action". Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
  11. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on "An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer". Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
  12. Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
  13. Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
  14. Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
  15. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  16. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  17. Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
  18. Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
  19. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  20. Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
  21. Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
  22. Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
  23. Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
  24. Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 7 153-196 (2014).
  25. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , Cengage - Brooks/Cole. Belmont, CA. Ch. 1 1-24 (2007).
  26. Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
  27. Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
  28. Yagi, K. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. Armstrong, D. , Humana Press. Totowa, NJ. 101-106 (1998).
  29. Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
  30. Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
  31. Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
  32. Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
  33. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
  34. Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
  35. Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
  36. Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
  37. Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
  38. Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
  39. Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
  40. Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Thiobarbituric Acid Reactive SubstancesTBARS AssayLipid PeroxidationOxidative StressMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisBiological SamplesStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

Gerelateerde artikelen