Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Samenvatting

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Samenvatting

Identificatie van specifieke eiwit-DNA-interacties op het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt veel gebruikt om genoombrede bindingslocaties van DNA-bindende eiwitten te identificeren. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door zijn heterogeniteit in lengte van gesoniceerde DNA-fragmenten en niet-specifiek achtergrond-DNA, wat resulteert in een lage mappingresolutie en onzekerheid op DNA-bindende locaties. Om deze beperkingen te overwinnen, maakt de combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) gebruik van 5' tot 3' exonucleasevertering om het heterogene formaat immunogeprecipiteerde DNA te trimmen naar de eiwit-DNA-crosslinking site. Exonuclease behandeling elimineert ook niet-specifiek achtergrond DNA. Het door de bibliotheek voorbereide en exonuclease verteerde DNA kan worden verzonden voor sequencing met hoge doorvoer. De ChIP-exo-methode maakt een bijna base-pair mapping resolutie mogelijk met een grotere detectiegevoeligheid en een verminderd achtergrondsignaal. Een geoptimaliseerd ChIP-exo-protocol voor zoogdiercellen en sequencing van de volgende generatie wordt hieronder beschreven.

Inleiding

De locaties van eiwit-DNA interacties geven inzicht in de mechanismen van genregulatie. Chromatine immunoprecipitatie in combinatie met high-throughput sequencing (ChIP-seq) wordt al tien jaar gebruikt om genoombrede eiwit-DNA-interacties in levende cellen te onderzoeken^1,2. De ChIP-seq-methode wordt echter beperkt door heterogeniteit in DNA-fragmentatie en ongebonden DNA-besmetting die leiden tot een lage mappingresolutie, valse positieven, gemiste oproepen en niet-specifiek achtergrondsignaal. De combinatie van ChIP met exonucleasevertering (ChIP-exo) verbetert de ChIP-seq-methode door ChIP-DNA bij te snijden tot de eiwit-DNA-crosslinkingpunten, wat een bijna basispaarresolutie en een laag achtergrondsignaal^3,4,5biedt. De sterk verbeterde kaartresolutie en lage achtergrond van ChIP-exo maken het mogelijk om nauwkeurige en uitgebreide eiwit-DNA-bindingslocaties in het hele genoom te bepalen. ChIP-exo is in staat om functioneel verschillende DNA-bindende motieven, coöperatieve interacties tussen transcriptiefactoren (TF) en meerdere eiwit-DNA-crosslinking sites op een bepaalde genomische bindingslocatie te onthullen, niet detecteerbaar door andere genomische mapping methoden^3,4,6,7.

ChIP-exo werd aanvankelijk gebruikt in ontluikende gist om de sequentiespecifieke DNA-binding van TF 's te onderzoeken, om de precieze organisatie van het transcriptie pre-initiatiecomplex en subnuclesosomale structuur van individuele histonen in het genoom^4,8,9te bestuderen . Sinds de introductie in 2011⁴, ChIP-exo is met succes gebruikt in vele andere organismen, waaronder bacteriën, muizen en menselijke cellen^{7,10,11,12,13,14,15,16,17}. In 2016 gebruikten Rhee et al.¹⁴ ChIP-exo in zoogdierneuronen voor het eerst om te begrijpen hoe neuronale genexpressie werd gehandhaafd na de downregulatie van het programmeren van TF Lhx3, dat een heterodimercomplex vormt met een andere programmering TF Isl1. Deze studie toonde aan dat bij afwezigheid van Lhx3 Isl1 wordt gerekruteerd naar nieuwe neuronale versterkers gebonden door Onecut1 TF om genexpressie van neuronale effectorgenen te behouden. In deze studie onthulde ChIP-exo hoe meerdere TF's celtype en celfasespecifieke DNA-regulerende elementen dynamisch herkennen op een combinatorische manier bij de mappingresolutie van near-nucleotide. Andere studies gebruikten ook de ChIP-exo-methode om het samenspel tussen eiwitten en DNA in andere zoogdiercellijnen te begrijpen. Han et al.⁷ gebruikten ChIP-exo om genoombrede organisatie van GATA1 en TAL1 TFs in muis erythroid cellen te onderzoeken met behulp van ChIP-exo. Deze studie vond dat TAL1 direct wordt gerekruteerd naar DNA in plaats van indirect door eiwit-eiwit interacties met GATA1 tijdens erythroid differentiatie. Recente studies gebruikten ook ChIP-exo om de genoombrede bindingslocaties van CTCF, RNA Polymerase II en histonsporen te profileren om epigenomische en transcriptionele mechanismen in menselijke cellijnen^18,19te bestuderen .

Er zijn verschillende versies van het ChIP-exo protocol beschikbaar^3,5,20. Deze ChIP-exo-protocollen zijn echter moeilijk te volgen voor onderzoeken die niet bekend zijn met de voorbereiding van de volgende generatie sequencingbibliotheek. Een uitstekende versie van het ChIP-exo-protocol werd gepubliceerd met gemakkelijk te volgen instructies en een video²¹, maar bevatte veel enzymatische stappen die een aanzienlijke hoeveelheid tijd nodig hebben om te voltooien. Hier rapporteren we een nieuwe versie van het ChIP-exo-protocol met verminderde enzymatische stappen en incubatietijden, en uitleg voor elke enzymatische stap²¹. Eindreparatie en dA-tailingreacties worden in één stap gecombineerd met behulp van endprep-enzym. De incubatietijden voor index- en universele adapter ligatiestappen worden verminderd van 2 uur tot 15 minuten met behulp van een ligatieversterker. De kinasereactie na de indexadapter ligatiestap die in het vorige ChIP-exo-protocol wordt beschreven, wordt verwijderd. In plaats daarvan wordt tijdens de oligo-DNA-synthese een fosfaatgroep toegevoegd aan een van de 5'-uiteinden van de indexadapter (tabel 1), die zal worden gebruikt voor de lamda-exonucleaseverteringsstap. Terwijl het vorige ChIP-exo-protocol recj_f exonucleasevertering gebruikte om enkelstrengs DNA-verontreinigingen te elimineren, wordt deze spijsverteringsstap hier verwijderd omdat het niet van cruciaal belang is voor de kwaliteit van de ChIP-exo-bibliotheek. Bovendien wordt voor het zuiveren van omgekeerd gekruist DNA na ChIP-elutie een magnetische kralenzuiveringsmethode gebruikt in plaats van de extractiemethode fenol:chloroform:isoamylalcohol (PCIA). Dit vermindert de incubatietijd van DNA-extractie. Belangrijk is dat het de meerderheid van de adapterverteerders verwijdert die zijn gevormd tijdens indexadapter ligatie, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie van ligatiegemedieerde PCR.

Het hier gepresenteerde ChIP-exo-protocol is geoptimaliseerd voor de detectie van nauwkeurige eiwit-DNA-interacties in zoogdierneuronen die zijn onderscheiden van embryonale stamcellen (ES)-cellen van muizen. Kort, geoogste en gekruiste neuronale cellen worden gelyseerd, zodat chromatine kan worden blootgesteld aan sonicatie, vervolgens gesoniceerd zodat dna-fragmenten van de juiste grootte worden verkregen (figuur 1). Antilichaamomhulde kralen worden vervolgens gebruikt om selectief gefragmenteerde, oplosbare chromatine te immunoprecipiteren aan het eiwit van belang. Terwijl het immunogeprecipiteerde DNA nog op de kralen zit, worden eindreparatie, ligatie van sequencingadapters, invulreactie en 5' tot 3' lambda exonucleaseverteringsstappen uitgevoerd. De exonucleaseverteringsstap geeft ChIP-exo zijn ultrahoge resolutie en hoge signaal-ruisverhouding. Lambda exonuclease trimt het immunogeprecipiteerde DNA een paar baseparen (bp) van de crosslinking site, waardoor besmet dna wordt afgebroken. Het met exonuclease behandelde ChIP-DNA wordt ontlokt uit de met antilichamen bedekte kralen, eiwit-DNA-crosslinks worden omgekeerd en eiwitten worden afgebroken. DNA wordt geëxtraheerd en gedenatureerd tot enkelstrengs ChIP-DNA, gevolgd door primergloeien en uitbreiding om dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. Vervolgens wordt ligatie van een universele adapter naar de met exonuclease behandelde uiteinden uitgevoerd. Het resulterende DNA wordt gezuiverd, vervolgens PCR versterkt, gel gezuiverd en onderworpen aan sequencing van de volgende generatie.

Het ChIP-exo protocol is langer dan het ChIP-seq protocol, maar is technisch gezien niet erg uitdagend. Elk succesvol immunogeprecipiteerd ChIP-DNA kan worden onderworpen aan ChIP-exo, met verschillende extra enzymatische stappen. De opmerkelijke voordelen van ChIP-exo, zoals ultrahoge kaartresolutie, een verminderd achtergrondsignaal en verminderde vals-positieve en negatieven, met betrekking tot genomische bindingssites, wegen zwaarder dan de tijdskosten.

Protocol

OPMERKING: Autoclaveerd gedestilleerd en gedeïensioniseerd water (ddH₂O) wordt aanbevolen voor het maken van buffers en reactiemastermengsels. Sectie 1−4 beschrijven cellyse en sonicatie, secties 5−7 beschrijven chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), secties 8−11 beschrijven enzymatische reacties op kralen, secties 12 en 13 beschrijven ChIP-elutie en DNA-zuivering, en secties 14−19 beschrijven bibliotheekvoorbereiding.

1. Cellen oogsten en crosslinken

1. Voeg na het differentiëren van muis ES-cellen in postmitotische neuronen 11% formaldehyde toe aan de geoogste cellen tot een uiteindelijke concentratie van 1% (v/v). Rotscellen op een schommelplatform (een rocker, shaker of rotator) gedurende 15 minuten, bij kamertemperatuur (RT, 25 °C).
   OPMERKING: Afhankelijk van het te kruisen doeleiwit, minder formaldehyde crosslinking (bijvoorbeeld een uiteindelijke concentratie van 0,5%) of dubbele crosslinking met disuccinimidylglutaraat (DSG) kan worden gebruikt.
2. Voeg 2,5 M glycine toe aan een uiteindelijke concentratie van 150 mM om de crosslinkingreactie te stoppen. Rotscellen op een schommelplatform bij RT, gedurende 5 minuten.
3. Centrifugeer de gekruiste cellen in conische buizen van 15 ml bij RT, gedurende 6 minuten, bij 1.350 x g. Aspirateer de oplossing en resuspendeer vervolgens cellen in 5 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   OPMERKING: De gekruiste celkorrels kunnen worden opgeslagen bij -80 °C na het invriezen van de flits met vloeibare stikstof.

2. Cellyse

OPMERKING: De volgende stappen in dit protocol zijn voor ongeveer 2 x 10⁷ neuronale cellen die zijn onderscheiden van muis ES-cellen. Om cellen open te breken, worden lysisbuffers gebruikt die verschillende detergentia bevatten. Voeg vlak voor gebruik 50 μL van 1000x volledige proteaseremmer (CPI) voorraad toe aan 50 ml buffer.

1. Lysisbuffers voorbereiden 1−3 zoals beschreven in tabel 2.
2. Ontdooi gekruiste celkorrels op ijs en resuspendeer vervolgens celkorrels grondig in 3 ml lysisbuffer 1 op 15 ml conische buizen. Rock bij 4 °C gedurende 15 minuten op een schommelplatform. Centrifugeren bij 1.350 x g gedurende 5 min bij 4 °C en supernatant aanzuigen.
3. Resuspendeer gekorrelde cellen grondig in 3 ml lysisbuffer 2. Rock bij 4 °C gedurende 10 min op een schommelplatform. Centrifugeren bij 1.350 x g gedurende 5 min bij 4 °C en supernatant aanzuigen.
4. Voeg 1 ml lysisbuffer 3 toe aan elke pellet en houd deze vervolgens in het ijs. Ga onmiddellijk verder met sonicatie.

3. Sonicerende chromatine

OPMERKING: Bewaar monsters op ijs of bij 4 °C tijdens deze sonicatieprocedure om crosslinkomkering te verminderen.

1. Voeg met behulp van een steriele spatel sonicatieparels(Materialentabel)toe tot de 0,2 ml graduatiemarkering op 15 ml polystyreenbuizen. Was sonicatieparels door vortexing in 600 μL van 1x PBS totdat er geen droge plekken zichtbaar zijn. Centrifugeer de buizen voor 5 s bij 30 x g en aspirate 1x PBS.
   OPMERKING: Sonicatie in polystyreenbuizen is efficiënter dan sonicatie in polypropyleen buizen. Als een kleiner aantal cellen (bijvoorbeeld <10⁶ cellen) gesoniceerd is, gebruikt u 1,5 ml polystyreenbuizen zonder sonicatieparels toe te voegen.
2. Resuspendeer de nucleaire lysaten grondig in 1 ml lysisbuffer 3 (vanaf stap 2.4) en breng vervolgens over naar de 15 ml polystyreenbuizen die sonicatieparels bevatten. Draai de polystyreenbuizen kort om.
3. Om het gekruiste chromatine-DNA te fragmenteren, soniceert nucleaire lysaten bij 4 °C voor een geoptimaliseerd aantal cycli, met vermogensamplitude bij 30 W en sonicatiecycli ingesteld op 30 s aan/30 s uit.
   OPMERKING: Optimalisatie van sonicatie voor elk celtype en batch resulteert in de beste ChIP-exo-opbrengst. Gedurende 2 x 10⁷ muisneuronale cellen zullen 20−30 sonicatiecycli bij de genoemde instellingen het chromatine fragmenteren in het bereik van 100−500 bp.
4. Nadat de sonicatie is voltooid, brengt u alle supernatant (gesoniceerde lysaten), van elk monster, over naar 1,5 ml buizen. Voeg 10% 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)fenoxy]ethanol) toe aan elk monster bij een uiteindelijke concentratie van 1%. Mix door pipetten.
5. Centrifugeer monsters bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng alle gesoniceerde lysaten (supernatant) over van elk monster naar nieuwe 1,5 ml buizen.
6. Neem 30 μL gesoniceerd lysaat uit elk monster (~ 3% gesoniceerd lysaat) en voeg toe aan nieuwe 1,5 ml buizen om de sonicatie te controleren. Bewaar de resterende gesoniceerde lysaten op 4 °C tot ze klaar zijn voor incubatie met met antilichamen bedekte kralen.

4. Sonicatie controleren

1. Maak 20 ml 2x proteinase K buffer door toevoeging van 2 ml van 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 2 ml van 0,5 M EDTA, 10 ml 10% natrium dodecylsulfaat (SDS) en 6 ml autoclaaf ddH₂O. Voeg geen CPI toe aan deze buffer. Bewaren in 50 ml buis bij RT.
2. Om de eiwit-DNA-crosslink om te keren, door de eiwitten te verwijderen, neemt u de 30 μL gesoniceerde chromatine uit elk monster (vanaf stap 3.6), voegt u 166 μL autoclaved ddH₂O toe, 200 μL 2x proteinase K buffer en 4 μL van 20 mg/ml proteinase K. Draai de monsters kort om en incubeer vervolgens bij 65 °C gedurende 1−3 uur bij 24 x g.
3. OPMERKING: De gesoniceerde lysaten kunnen 's nachts bij 65 °C worden omgekeerd gekruist.
4. Extract DNA met behulp van PCIA (25:24:1) en ethanol neerslag methode als volgt.
   LET OP: PCIA is giftig. Gebruik onder een afzuigkap met standaard persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
   1. Voeg 400 μL PCIA toe aan elk monster in buizen van 1,5 ml, stel vortex in op maximale snelheid en vortexmonsters gedurende 20 s. Centrifugeren bij 18.400 x g gedurende 6 minuten bij RT. Er zullen twee fasen worden waargenomen. Breng de bovenste waterige laag (heldere fase) van elk monster voorzichtig over op nieuwe buizen van 1,5 ml.
   2. Voeg 1 μL van 10 mg/ml RNase A toe. Incubeer monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten.
   3. Voeg aan elk monster 1 μL glycogeen van 20 mg/ml toe en precipiteer vervolgens met 1 ml ijskoude 100% ethanol (opgeslagen in een vriezer van -20 °C). Meng kort en incub vervolgens monsters in een vriezer van -80 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur. Centrifugeer monsters bij 18.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en giet voorzichtig 100% ethanol uit.
   4. Was pellets met 500 μL ijskoude 70% ethanol (bewaard in een vriezer van -20 °C). Centrifugeren bij 18.400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Giet voorzichtig 70% ethanol uit.
   5. Incubeer monsters in buizen van 1,5 ml bij 50 °C totdat de resterende ethanol is verdampt. Resuspend DNA pellets in 15 μL van autoclaved ddH₂O of nuclease-vrije ddH₂O.
   6. Voer de geëxtraheerde DNA-monsters, samen met een DNA-ladder, uit in een 1,5% agarosegel bij 120−180 V en controleer de grootte van het gesoniceerde DNA.

5. Antilichaam incubatie met kralen

OPMERKING: De volgende stappen in dit protocol zijn voor ongeveer 2 x 10⁷ neuronale cellen die zijn onderscheiden van muis ES-cellen. Bevries en ontdooi magnetische kralen op geen enkel moment tijdens het ChIP-exo-protocol, omdat de kralen kunnen barsten en vervuiling van het monster kunnen veroorzaken of de prestaties van het antilichaam in gevaar kunnen komen.

1. Bereid na cellyse en sonicatie eiwit G magnetische kralen(tabel met materialen)voor chip, meng magnetische kralen tot homogeen en voeg vervolgens 25 μL magnetische kralen toe aan 2 ml eiwitarme bindbuizen.
   OPMERKING: Het type magnetische kralen dat wordt gebruikt, hangt af van de soort antilichamen.
2. Was kralen met 1 ml blokkeeroplossing(tabel 2),meng goed en plaats ze vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek. Terwijl u nog steeds op een magnetisch rek zit, verwijdert u supernatant zodra het duidelijk is.
3. Voeg 1 ml blokkeringsoplossing toe aan de magnetische kralen. Rotsbuizen gedurende 10 min bij 4 °C op een schommelplatform. Draai kort, plaats vervolgens buizen op een magnetisch rek en verwijder supernatant.
4. Herhaal stap 5.3 nog twee keer.
5. Voeg 500 μL blokkeeroplossing toe aan magnetische kralen. Draai het antilichaam kort tegen Isl1 (0,04 μg/μL, tabel met materialen),voeg vervolgens 4 μg antilichaam toe aan overeenkomstige 2 ml eiwitarme bindbuizen die de magnetische kralen in de blokkerende oplossing bevatten.
6. Herhaal stap 5.5 zonder antilichaam (d.w.z. de no antilichaamcontrole voor ChIP).
   OPMERKING: De hoeveelheid toe te voegen antilichamen kan empirisch worden bepaald door rekening te houden met de kwaliteit van het antilichaam en het aantal cellen dat voor ChIP wordt gebruikt.
7. Rotsmonsters bij 4 °C gedurende 6−24 uur op een schommelplatform.

6. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP)

1. Was antilichaam gecoate kralen van stap 5.8 met 1 ml blokkeeroplossing. Plaats monsters op een schommelplatform op 4 °C gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant.
2. Herhaal stap 6.1 nog twee keer.
3. Resuspend antilichaam gecoate kralen in 50 μL van blokkerende oplossing, dan overbrengen naar nieuwe 2 ml eiwitarme bindbuizen. Voeg voor elk ChIP-monster gesoniceerde lysaten (~ 1,0 ml vanaf stap 3.6) toe aan met antilichamen bedekte kralen in 2 ml eiwitarme bindbuizen.
4. Incubeer elk monster 's nachts op een schommelplatform bij 4 °C.

7. ChIP wast

OPMERKING: Bewaar monsters op ijs of bij 4 °C om eiwit-DNA-crosslinking te behouden tijdens ChIP-wasbeurten.

1. Maak een hoge zoutwasbuffer, LiCl-wasbuffer en 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7.4) zoals beschreven in tabel 3. Bewaren in buizen van 50 ml bij 4 °C. Voeg vlak voor gebruik 50 μL van 1000x CPI-voorraad toe aan alle buffers.
2. Draai kort monsters in 2 ml eiwitarme bindbuizen om vloeistof uit de doppen te verzamelen, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder supernatant voorzichtig met een pipet.
3. Voeg voor ChIP-wasbeurten 1 ml lysisbuffer 3 (bij 4 °C) toe aan elke buis. Meng op een schommelplatform bij 4 °C gedurende 5 minuten. Draai kort monsters, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant met een pipet.
4. Voeg 1 ml koude hoge zoutwasbuffer toe aan elke buis. Meng op een schommelplatform bij 4 °C gedurende 5 minuten. Draai kort monsters, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant met een pipet.
5. Voeg 1 ml koude LiCl-wasbuffer toe aan elke buis. Meng op een schommelplatform bij 4 °C gedurende 5 minuten. Draai kort monsters, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant met een pipet.
6. Voeg 1 ml koude 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) toe aan elke buis. Meng op een schommelplatform bij 4 °C gedurende 5 minuten. Draai kort monsters, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant met een pipet.
   OPMERKING: Tris-EDTA-buffer (pH 8.0) kan worden gebruikt in plaats van Tris-HCl-buffer (pH 7.4).
7. Herhaal stap 7.4−7.6 drie keer.
8. Breng de monsterparels met 500 μL Tris-HCl buffer (pH 7.4) over in verse buizen van 1,5 ml. Draai kort monsters, plaats vervolgens gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en verwijder het supernatant met een pipet.

8. Eindreparatie en dA-tailing reactie op parels

OPMERKING: Sonicatie genereert vaak niet-botte beëindigde dsDNA. Een eindreparatiereactie is vereist om bot DNA te maken voorafgaand aan de dA-tailing-reactie, gevolgd door de ligatiestap van de indexadapter. Voor sticky end DNA ligatie met index adapter DNA wordt dATP door de dA-tailing reactie toegevoegd aan het 3' uiteinde van een stomp, dsDNA fragment. End prep reactie mix bevat dATP.

1. Voeg na chip-wasbeurten 38 μL autoclaaf ddH₂O toe aan de monsterparels in buizen van 1,5 ml voor eindreparatie en dA-tailingreactie.
2. Voeg 5,6 μL eindvoorbereidingsreactiemix en 2,4 μL eindvoorbereidingsenzymmix(Materialentabel)toe aan elk monster (totaal reactievolume: 46 μL). Incubeer monsters bij 20 °C gedurende 30 minuten.
3. Was kralen zoals beschreven in eerdere ChIP wasstappen 7.4−7.6.

9. Index adapter ligatie op kralen

OPMERKING: De indexadapter heeft 6−10 basissen van indexsequenties met streepjescode, die specifiek zijn voor een bepaald monster dat wordt gebruikt voor het multiplexen van meerdere monsters in sequencing met hoge doorvoer. Dna-sequenties van indexadapters worden beschreven in tabel 1.

1. Voeg voor indexadapter ligatie 27 μL koude 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) toe aan de monsterparels. Voeg aan elk monster 2 μL van 15 μM-indexadapter, 0,5 μL ligatieversterker en 15 μL ligase-mastermix(Materialentabel)toe (totaal reactievolume: 44,5 μL).
2. Incubeer monsters bij 20 °C gedurende 15 minuten. Was kralen zoals beschreven in stap 7.4−7.6.

10. Invulreactie op kralen

OPMERKING: Na de afgifte van de adapter is er geen fosfodiësterbinding tussen het 5'-uiteinde van de adapter en het 3'-uiteinde van het ChIP-DNA. De inkeping kan worden gerepareerd door een invulreactie.

1. Voeg 47 μL koude 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) toe aan de monsterparels.
2. Maak de invulreactiemix (tabel 4 en tafel met materialen) op ijs.
3. Voeg 11,1 μL invulmix toe aan elk monster (totaal reactievolume: 58,1 μL). Incubeer monsters bij 30 °C gedurende 20 minuten. Was kralen zoals beschreven in stap 7.4−7.6.

11. Lambda exonuclease spijsvertering op kralen

1. Voeg na de invulreactie op kralen 50 μL koude geautoclaveerde ddH₂O toe aan de monsterparels.
2. Om het ChIP-DNA in de richting van 5' tot 3' te verteren, voegt u 6 μL 10x lambda exonucleasebuffer en 2 μL lambda exonuclease(Tabel met materialen, totaal reactievolume: 58 μL) toe. Incubeer monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten. Was kralen zoals beschreven in stap 7.4−7.6.

12. Elution en reverse crosslinking

1. Maak chip-elutiebuffer zoals beschreven in tabel 5.
   OPMERKING: Voeg geen CPI toe aan de ChIP-elutiebuffer.
2. Om ChIP-monsters van de kralen te eluteeren, resuspend monsters in 75 μL ChIP-elutiebuffer en incuberen bij 65 °C gedurende 15 minuten bij 130 x g.
3. Voeg 2,5 μL 20 mg/ml proteinase K (Materialentabel) toe aan de monsters. Kort vortex, dan incuberen de monsters 's nachts bij 65 °C.

13. DNA-extractie

1. Nadat de monsters 's nachts bij 65 °C zijn geïncubeerd, draait u de monsters kort, plaatst u deze gedurende 1 minuut op een magnetisch rek en plaatst u het supernatant vervolgens van elk monster naar nieuwe buizen van 1,5 ml.
2. Voeg 1 μL van 10 mg/ml RNase A toe aan de monsters. Kort vortex, dan incuberen de monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten. Voeg ~25 μL autoclaaf ddH₂O toe aan volume tot 100 μL.
3. Zuiver DNA met behulp van magnetische kralen(Tabel met materialen). Elute DNA met 16 μL geautoclaveerde ddH₂O of nucleasevrije ddH₂O.

14. Denatureren, primergloeien en primerverlenging

1. Breng na chip-elutie en reverse crosslinking 16 μL van de geëxtraheerde DNA-monsters over van stap 13.3 naar PCR-buizen.
2. Maak denaturering en primer gloeimix(tabel 6 en tafel van materialen)op ijs. Voeg aan elk monster 1,2 μL denaturerings- en primergloeimengsel toe (totaal reactievolume: 17,2 μL). Voer monsters uit met behulp van het programma beschreven in tabel 6 om primers te denatureren en gloeien naar het sjabloon-DNA.
3. Maak primerverlengingsmix(tabel 7 en tafel met materialen)op ijs.
4. Zodra het programma voor denatureren en gloeiprimeren is voltooid, voegt u 3 μL primerverlengingsmix toe aan de monsters (totaal reactievolume: 20,2 μL). Voer voorbeelden uit met behulp van het programma voor primerextensie beschreven in tabel 7.
5. Ga onmiddellijk verder met de dA-tailing-reactie.

15. dA-tailing reactie

OPMERKING: Voor kleverige DNA-ligatie met universeel adapter-DNA wordt dATP door de dA-tailingreactie toegevoegd aan het 3' uiteinde van blunt, dsDNA.

1. Maak dA-tailing mix(Tabel 8 en Table of Materials)op ijs.
2. Voeg 4,1 μL dA-tailing mix toe aan elk monster (totaal reactievolume: 24,3 μL). Voer monsters uit met behulp van het programma voor dA-tailing (tabel 8).
3. Ga onmiddellijk verder met de ligatie van de universele adapter.

16. Universele adapter ligatie

OPMERKING: De universele adapter bevat sequencingspecifieke sequenties met hoge doorvoer voor DNA-monsterherkenning voor sequencingchemie. De DNA-sequenties van de universele adapter worden beschreven in tabel 1.

1. Na dA-tailing reactie, maak universele adapter ligatie mix(tabel 9 en tafel van materialen)voor universele adapter ligatie.
2. Voeg 21,5 μL toe aan elk monster (totaal reactievolume: 45,8 μL) en incubeer monsters gedurende 15 minuten bij 20 °C.

17. DNA-opruiming

1. Zuiver DNA met behulp van magnetische kralen(Tabel met materialen). Elute DNA met 21 μL autoclaaf ddH₂O of nucleasevrije ddH₂O.
2. Bewaar monsters bij -20 °C tot ze klaar zijn om ligatiegemedieerde PCR (LM-PCR) en PCR-zuivering uit te voeren.

18. Ligatiegemedieerde PCR

OPMERKING: LM-PCR primersequenties worden beschreven in tabel 1.

1. Maak na DNA-opschoning LM-PCR-mix(tabel 10 en materialentabel)op ijs.
2. Voeg 29 μL LM-PCR-mix toe aan elk monster (totaal reactievolume: 50 μL) en voer monsters uit met behulp van het programma voor LM-PCR(tabel 10).
3. Ga onmiddellijk over tot gelzuivering van PCR versterkt DNA, gevolgd door DNA-zuivering voor sequencing met hoge doorvoer.

19. DNA-purificatie van LM-PCR versterkt DNA

1. Voer de LM-PCR versterkte DNA-monsters uit, samen met een DNA-ladder, in een 1,5% agarosegel bij 120−180 V en accijnsbanden van 200-400 bp.
2. Zuiver DNA van de verwijderde gel met behulp van een gelextractiekit(Materialentabel).
3. Controleer na DNA-zuivering de concentratie (Tabel met materialen) van elk ChIP-exo-bibliotheekmonster. Verzend voorbeelden voor sequencing met hoge doorvoer voor sequencing met één lees.
   OPMERKING: De voorkeursleeslengte voor single-read sequencing is ten minste 35 bp, wat voldoende is om de sequencing-reads uniek uit te lijnen op het referentiegenoom in muis- of menselijke cellen. Voor de meeste transcriptiefactoren in muis- of menselijke cellen zijn 10−20 miljoen reads per ChIP-exo-monster voldoende om hun genomische bindingslocaties te identificeren. Er zijn ten minste 30 miljoen reads per monster nodig om genomische gebieden in kaart te brengen die zijn verrijkt met histonsporen in zoogdiercellen.

Resultaten

Figuur 2A illustreert sonicatieresultaten na cellyse en sonicatie, met verschillende cycli, van motorneuroncellen onderscheiden van muis ES-cellen. Het optimale aantal sonicatiecycli (bijvoorbeeld 12 cycli in figuur 2A)genereerde een sterke DNA-intensiteit in 100−400 bp DNA-fragmenten. Hoogwaardige ChIP-exo bibliotheken zijn gebaseerd op de grootte en kwantiteit van gefragmenteerd chromatine DNA. Optimalisatie van sonicatie wordt dus aanbevolen voor elk celtype ...

Discussie

In dit protocol wordt ChIP gevolgd door exonucleasevertering gebruikt om DNA-bibliotheken te verkrijgen voor de identificatie van eiwit-DNA-interacties in zoogdiercellen met een ultrahoge kaartresolutie. Veel variabelen dragen bij aan de kwaliteit van het ChIP-exo experiment. Kritieke experimentele parameters omvatten de kwaliteit van antilichamen, optimalisatie van sonicatie en het aantal LM-PCR-cycli. Deze kritische experimentele parameters zijn ook wat ChIP-exo experimenten kan beperken en zullen hieronder worden besp...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose, UltraPure	Invitrogen	16500	Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98%	BioShop	ALB003	Blocking Solution
Antibody against Isl1	DSHB	39.3F7	Antibody incuation with beads (Section 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	Sonicating Chromatin (Section 3.3)
Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade	New England BioLabs	B9000S	Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4)
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	22623508	Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1)
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer
dATP Solution	New England BioLabs	N0440S	dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Deoxycholic Acid Sodium Salt	fisher scientific	BP349	Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer
dNTP Mix, Molecular Biology Grade	Thermo Scientific	R0192	Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x	Thermo Scientific	K1081	Ligation-Mediated PCR (Section 18.1)
EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0	BioShop	EDT111	Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer
Ethyl Alcohol Anhydrous, 100%	Commercial alcohols	P006EAAN	Checking Sonication (Section 4.3.3)
Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol	Sigma	F8775	Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1)
Glycerol, Reagent Grade, min 99.5%	BioShop	GLY002	Lysis Buffer 1
Glycine, Biotechnology Grade, min. 99%	BioShop	GLN001	Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2)
Glycogen, RNA Grade	Thermo Scientific	R0551	Checking Sonication (Section 4.3.3)
HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3	BioShop	HEP003	Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer
Klenow Fragment (3->5 exo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Lambda exonuclease	New England BioLabs	M0262S	Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2)
Ligase Enhancer	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Ligase Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1)
Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade	Bioshop	LIT704	LiCl Wash Buffer
Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)	Antibody incubation with beads (Section 5)
Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads)	Beckman Coulter	A63880	DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1)
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet)	Invitrogen	12321D	Used in many steps in Sections: 5 - 11, 13
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2)
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC)	Sigma	61747	Lysis Buffer 3
Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1)	BioShop	PHE512	Checking Sonication (Section 4.3.1)
phi29 DNA Polymerase	New England BioLabs	M0269L	Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4)
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning	21040CV	Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1)
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1)
ProFlex PCR System	Applied Biosystems	ProFlex PCR System	Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2
Protein LoBind Tube, 2.0 mL	Eppendorf	22431102	Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)
Proteinase K Solution, RNA Grade	Invitrogen	25530049	Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)
Qubit 4.0 Fluorometer	Invitrogen	Q33226	Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Quibit dsDNA BR assay kit	Invitrogen	Q32853	Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)
Rnase A, Dnase and Protease-free	Thermo Scientific	EN0531	Check