Method Article

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

DOI:

10.3791/61127

⸱

May 16th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die door vrijwel alle cellen worden afgegeven en in alle biologische vloeistoffen worden uitgescheiden. Er zijn veel methoden ontwikkeld voor de isolatie van deze blaasjes, waaronder ultracentrifugatie, ultrafiltratie en chromatografie met uitsluiting van grootte. Ze zijn echter niet allemaal geschikt voor grootschalige exosoomzuivering en -karakterisering. Hier wordt een protocol beschreven voor het opzetten van culturen van primaire fibroblasten geïsoleerd uit skeletspieren van volwassen muizen, gevolgd door zuivering en karakterisering van exosomen uit de kweekmedia van deze cellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van opeenvolgende centrifugatiestappen gevolgd door sucrosedichtheidsgradiënten. De zuiverheid van de exosomale preparaten wordt vervolgens gevalideerd door western blot-analyses met behulp van een reeks canonieke markers (d.w.z. Alix, CD9 en CD81). Het protocol beschrijft hoe bioactieve exosomen kunnen worden geïsoleerd en geconcentreerd voor elektronenmicroscopie, massaspectrometrie en opname-experimenten voor functionele studies. Het kan gemakkelijk worden opgeschaald of verkleind en aangepast voor exosoomisolatie uit verschillende celtypen, weefsels en biologische vloeistoffen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen zijn heterogene extracellulaire blaasjes met een grootte van 30-150 nm. Ze zijn gevestigde sleutelspelers in fysiologische en pathologische processen, gezien hun alomtegenwoordige verspreiding in weefsels en organen 1,2. Exosomen dragen een complexe lading eiwitten, lipiden, DNA-typen en RNA-typen, die variëren afhankelijk van het type cellen waaruit ze zijn afgeleid 1,2,3. Exosomen zijn verrijkt met eiwitten die verschillende functies hebben (d.w.z. tetraspanines, waaronder CD9 en CD63) die verantwoordelijk ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures bij muizen werden uitgevoerd volgens dierprotocollen die zijn goedgekeurd door het St. Jude Children's Research Hospital, Institutional Animal Care and Use Committee en de richtlijnen van de National Institutes of Health.

1. Voorbereiding van oplossingen en media

  1. Bereid de digestieoplossing door 15,4 ml PBS te mengen met 2,5 ml 20 mg/ml collagenase P (eindconcentratie van 5 mg/ml), 2 ml 11 E/ml dispase II (eindconcentratie van 1,2 E/ml) en 100 μl 1,0 M CaCl2 (eindconcentratie van 5 mM).
  2. Bereid 500 ml primair fibroblastenmedium (DMEM compleet) door 440 ml DMEM te mengen met 50 ml FBS (10%), 5,0 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is geschikt voor het op een kosteneffectieve manier zuiveren van exosomen uit grote hoeveelheden geconditioneerd medium. De procedure is zeer reproduceerbaar en consistent. Figuur 1 toont transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-beeld van exosomen die zijn gezuiverd uit het kweekmedium van primaire fibroblasten van muizen. Figuur 2 toont het eiwitexpressiepatroon van canonieke exosomale markers en de afwezigheid van cytosolische (LDH) en ER (calnexin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een cruciale stap voor de succesvolle isolatie van exosomen uit de kweekmedia, zoals beschreven in dit protocol, is de juiste vestiging en instandhouding van primaire fibroblastculturen van muizen uit volwassen skeletspieren. Deze culturen moeten op een laag zuurstofgehalte worden gehouden om fysiologisch achtige omstandigheden te garanderen (O2-niveau in skeletspieren is ~2,5%)15. Primaire fibroblasten zullen van karakter veranderen wanneer ze te vaak in cultuur worden gebracht. Daarom.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alessandra d'Azzo bekleedt de Jewelers for Children (JFC) Endowed Chair in Genetics and Gene Therapy. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies R01GM104981, RO1DK095169 en CA021764, de Assisi Foundation of Memphis en de American Libanese Syrian Associated Charities.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm dishesMidwest Scientific, TPPTP93100
15 cm dishesMidwest ScientificTP93150
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific, Pierce23225
Bovine serum albumin Fraction VRoche10735094001
CaCl2SigmaC1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11Eppendorf022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging systemBioRad12003154
Collagenase PSigma, Roche11 213 857 001100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktailMillipore/Sigma, Roche11697498001
Criterion Blotter with plate electrodesBioRad1704070
Criterion TGX stain-free protein gelBioRad567803410% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)BioRadNC0165100
Dispase IISigma, Roche04 942 078 001neutral protease, grade II
DithiothreitolSigma/Millipore, Roche10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles MediumCorning15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineCorning21-031-CV
Ethanol 200 proofPharmco by Greenfield Global111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubesCorning352070
Fetal Bovine SerumGibco10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate readerBMG Labtech
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific, Gibco35050-061
Hydrochloric acidFisher ScientificA144S-500
Immobilon-P Transfer membranesMilliporeIPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)BioRad1610747
Magnesium acetate solutionSigma63052-100ml
Non-fat dry milkLabScientificM-0842
O2/CO2 incubatorSanyoMC0-18M
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, Gibco15140-12210,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubesFisher Scientific, Midwest ScientificAVSC15101.7 mL
Protected disposable scalpelsFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker372610
Running bufferBioRad1610732
Sodium ChlorideFisher Scientific, Fisher ChemicalS271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration systemMilliporeS2GPU05RE500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)Fisher Scientific, Fisher brand22-363-548
SucroseFisher Scientific, Fisher ChemicalS5-500
SuperSignal west FemtoThermo Fisher Scientific34096
Thin wall Polypropylene tubesBeckman Coulter326823
Transfer bufferBioRad16110734
Trichloroacetic AcidSigma91228-100G
Tris baseBioRad1610719
Triton-X100 solutionSigma93443-100mL
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific, Gibco12604-013No phenol red
Tween-20BioRad#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPMBeckman CoulterA99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)Beckman Coulter344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)Beckman Coulter344058
Water bath Isotemp 220Fisher ScientificFS220

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  2. Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Exosome IsolationSkeletal Muscle FibroblastsDifferential CentrifugationSucrose Density GradientWestern Blot AnalysisExosome CharacterizationPrimary Cell CultureConditioned MediumElectron MicroscopyMass Spectrometry

Related Articles