Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

5.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61138

⸱

10 juni 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Samenvatting

Het bestuderen van de structuur en de dynamiek van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosomale instabiliteit (CIN) en kankerprogressie. Hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie is een fundamentele vraag. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.

Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren, wat suggereert dat alomtegenwoordigheid bij een andere lysine wordt veroorzaakt door de EYFP-tagging in het CENP-A K124R gemuteerd eiwit. Lysine 306 (K306) alomtegenwoordigheid in EYFP-CENP-A K124R werd met succes geïdentificeerd, wat overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrie analyse. Een voorbehoud wordt besproken in het gebruik van GFP /EYFP of het taggen van eiwit met een hoog moleculair gewicht als hulpmiddel om de functie van een eiwit te analyseren. Huidige technische limiet wordt ook besproken voor de detectie van alomquitylated banden, identificatie van site-specifieke alomtegenwoordigheid(en), en visualisatie van alomtegenwoordigheid in levende cellen of een specifieke eencellige cel tijdens de hele celcyclus.

De methode van massaspectrometrie analyse hier gepresenteerd kan worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore eiwitten. Deze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests / analyses kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid.

Inleiding

In de meeste eukaryoten moeten spindelmicrotubuli zich hechten aan één enkel gebied van elk chromosoom, centromere genoemd. De kinetochore is een complex van eiwitten die zich op de centromere bevinden. Het bestuderen van de timing van centromere en kinetochore eiwit bewegingen en de structuur van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosoom instabiliteit (CIN) en kanker progressie. De belangrijkste vragen zijn hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en hoe ze deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie. In de meeste soorten, de aanwezigheid van een speciaal nucleosoom met een specifieke histone-achtige eiwit genaamd CENP-A definieert de centromere identiteit. Daarom wordt voorgesteld dat CENP-A de niet-DNA-indicator (epigenetisch merk) van centromere identiteit is. Het is belangrijk om het mechanisme op te helderen van hoe CENP-A de centromere identiteit bij mensen definieert.

De Holliday junction recognition protein (HJURP) is de CENP-A-specifieke chaperon die CENP-A in centromerische nucleosomen1,2,3deponeert . We have previously reported that the CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase is required for CENP-A ubiquitylation on lysine 124 (K124) and centromere localization4. Ook onze resultaten toonden aan dat de centromere werving van nieuw gesynthetiseerde CENP-A vereist reeds bestaande ubiquitylated CENP-A5. Thus, a model was provided suggesting that CENP-A ubiquitylation is inherited through dimerization between cell divisions.

In tegenstelling tot onze bevindingen en die van Yu et al., werden de negatieve resultaten betreffende CENP-A en zijn centromeric lokalisatie onlangs gepubliceerd6. Het artikel beweerde dat CENP-A wijzigingen op lysine 124 (K124) zijn onmisbaar voor de oprichting, onderhoud, en de functie op lange termijn van de menselijke centromeres, op basis van hun negatieve resultaten waaruit blijkt dat de mutatie van K124R niet van invloed CENP-A centromere lokalisatie noch cel levensvatbaarheid6. Er is echter voldoende ruimte voor discussie in hun resultaten en conclusies, en we hebben al beschreven welk probleem er zou kunnen zijn in hun vorige publicatie7. Er moet op worden gelet dat ze eiwitten hebben versmolten met CENP-A, die veel grotere moleculaire gewichten hebben dan de grootte van endogene CENP-A: bijvoorbeeld, ze gesmolten ~ 30 kDa verbeterde gele fluorescente eiwitten (EYFP) tot ~ 16 kDa CENP-A en analyseerde EYFP-CENP-A K124R fusie eiwit in hun RPE-1 CENP-A-/F knock-out systeem. K124 ubiquitine zal naar verwachting niet rechtstreeks binden aan HJURP op basis van structurele voorspellingen4,maar de toevoeging van mono-ubiquitine zal naar verwachting een impact hebben op de eiwitcontenschap van CENP-A. Het eiwit van CENP-A-conformatie kan worden veranderd door de aanwezigheid van een groot fusie-eiwit, en deze conformatieverandering kan de structurele veranderingen maskeren die worden veroorzaakt door het verlies van alomtegenwoordigheid. Wij stellen voor dat de fusie van groot-en klein-grote eiwit alome alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt / maskeert de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype. Bewijs dat alomtegenwoordigheid optreedt bij verschillende lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit met een large tag eiwit (EYFP) werd gemeld in onze vorige publicatie8. Er werd vastgesteld dat EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert van een andere lysinesite van EYFP-CENP-A K124R en dat EYFP-CENP-A K124R mutant bindt aan HJURP. Als gevolg hiervan remt/maskeert deze alomtegenwoordigheid op een andere locatie het oorspronkelijke K124R enkel mutantene fenotype, en zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden centromere lokalisatie (we gebruikten en vergeleken pBabe-EYFP-CENP-A WT en K124R mutant, samen met pBabe-EYFP control.). The results demonstrated that Flag-tagged or untagged CENP-A K124R mutants are lethal but can be rescued by a monoubiquitin fusion, suggesting that CENP-A ubiquitylation is indispensable to cell viability.

In de afgelopen jaren hebben veel studies verschillende tests ontwikkeld om posttranslationele modificaties (PTMs) van CENP-A-eiwit en andere centromere-kinetochore-eiwitten te identificeren, zowel in vivo als in vitro9,10,11. Analoog aan de PTMs van histoneiwitten die een belangrijk mechanisme zijn dat de functie van chromatine regelt, zijn PTMs van centromerische chromatinecomponenten ook betrokken bij een essentieel mechanisme om de algehele structuur en functie van centromeres te reguleren. De meeste CENP-A PTM-sites zijn specifiek voor CENP-A-bevattende nucleosomen, hoewel een paar daarvan in histone H3 worden bewaard, wat suggereert dat wijziging van deze residuen bijdraagt aan de centromere-specifieke functie. PTMs van CENP-A met inbegrip van fosforylatie, acetylatie, methylatie, en alomtegenwoordigheid werden eerder gemeld9, wat suggereert dat CENP-A wordt onderworpen aan een verscheidenheid van PTM's en hun combinatorische arrays op zijn amino terminus en C-terminus histone-fold domein. Het belang van CENP-A wijzigingen in meerdere functies werd onthuld door vele groepen, waaronder de onze. Deze functies omvatten CENP-A depositie bij centromeres, eiwitstabiliteit en rekrutering van het CCAN (constitutief centromere-geassocieerd netwerk)9. Beperkte studies en bevindingen van CENP-A PTM's zijn echter voorgevormd wanneer vergelijkingen worden gemaakt met een van canonieke histonen die hun functie direct of indirect reguleren. Technische rapporten die zich richten op de methodologie om deze CENP-A PTMs te identificeren zijn ook beperkt.

Because CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere12, inherited through dimerization between cell division5, and indispensable to cell viability8, the method to identify CENP-A ubiquitylation would be essential in future to study the functional activity, positioning, and structure of the centromere. Daarom beschrijven we hier massaspectrometrie-analyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R-mutant te identificeren, wat suggereert dat de EYFP-tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in het CENP-A K124R gemuteerde eiwit8. Protocollen van andere controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) worden ook gepresenteerd om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celcultuur en retrovirustransfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructies

OPMERKING: EYFP-CENP-A wordt uitgedrukt uit pBabe-EYFP-CENP-A op een vergelijkbaar eiwitniveau als endogene CENP-A. Totaal cellulair CENP-A eiwit wordt vervangen door dit EYFP-CENP-A na de verstoring van het CENP-A-/F allel door Cre recombinase zoals in RPE-1 CENP-A-/- cellen6.

  1. Bereiding van het supernatant dat retrovirus bevat met behulp van 293T verpakkingscellen.
    1. Dag 0: Spread 293T verpakkingscellen op de 6-well kweekplaat (1,0 x 106 cellen/put). Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
    2. Dag 1: Bereid de transfectiereactie rond 23 uur na verspreiding (24 uur punt is 0 h punt van de transfectie). Transfect expression plasmid van elke pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) en pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (zie tabel 1).
    3. Kies een combinatie van helper/verpakkingsplasmids vermeld in tabel 2 en voeg ze toe aan buizen met een van de hierboven genoemde plasmiden. Er zijn meestal deze 3 combinaties voor helper /verpakking plasmiden (Tabel 2). Elke combinatie werkte in deze experimenten en toonde een vergelijkbare transfectie efficiëntie.
    4. Bereid 50 μL verlaagd serummedium en meng 2,0 μg van elke pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B316 1), en pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (zie tabel 1) waarbij één combinatie van helper/verpakkingsplasmids wordt toegevoegd die in tabel 2 is vermeld (zie hieronder). Broed dit mengsel 5 min op kamertemperatuur. Dit mengsel is oplossing A.
    5. Bereid nog eens 50 μL verlaagd serummedium en meng respectievelijk 1,5 μL transfectiereagentia I en II (Tabel van materialen). Broed dit mengsel 5 min op kamertemperatuur. Dit mengsel is oplossing B.
      OPMERKING: Voeg eventueel slechts 6,0 μL transfection reagens III (polyethyleenimine [PEI]; 1,0 mg/mL) toe in oplossing B of voeg 6,0 μL transfection reagens III toe naast transfection reagentia I en II in oplossing B (Tabel van materialen).
    6. Mix oplossingen A en B samen en broed 15 minuten op kamertemperatuur.
    7. Na het wassen van de gekweekte cellen eenmaal met PBS, voeg het mengsel van oplossingen A en B (d.w.z., DNA-lipide complex) direct aan elke put van de 6-well kweekplaat toe die 500 μL verminderd serummiddel heeft. De uiteindelijke concentratie van het plasmide is 3,3 μg/mL.
    8. Na het uitbroeden van de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 4,5 uur, verander je de medium tot high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Zet 2 mL/goed van cultuurmiddel na de middelgrote verandering in de 6-goed cultuurplaat.
    9. Kweek de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 48 uur na transfectie. Voer retrovirus infectie uit op dag 3 met behulp van de supernatant met retrovirus.
  2. Retrovirusinfectie van CENP-A-/F RPE-1 doelcellen.
    1. Dag 2: Een dag voor infectie, verspreid CENP-A-/F RPE-1 doelcellen te transfecteren in de 6-well cultuur goed (2,25 x 105 cellen / goed). Kweekcellen in DMEM: F12 medium (Tabel van materialen) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
      OPMERKING: Spread cellen voor kolonie uitgroei testen, immunofluorescentie, en westerse vlek analyse als controle. Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
    2. Dag 3 (infectiedag van het virus): Bij 48 uur na transfectie van 293T verpakkingscellen verzamel je het supernatant met virus en filter door 0,45 μm filter (gebruik geen 0,2 μm filter dat virusenvelop zal afschuinen). Het wordt aanbevolen om polyethersulfone (PES) filters te gebruiken.
    3. Infecteer CENP-A-/F RPE-1 cellen met het virus. Voor een put van de 6-well kweekplaat, voeg 1 mL verse media, 1 mL virus supernatant en polybrene aan een uiteindelijke concentratie van 8 μg/mL. Incubeer CENP-A-/F RPE-1 cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 4 dagen tot dag 7 na transfectie.
      OPMERKING: De incubatietijd voor CENP-A-/F RPE-1 celgroei moet empirisch worden bepaald door analyses te volgen voor optimale resultaten.

2. Immunofluorescentieanalyse van cellen die pBabe-EYFP-CENP-A bevatten

  1. Dag 7: 4 dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs, verwijder de cultuur medium door aspiratie. Spoel cellen één keer met TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 125 mM NaCl). Breng tbs aan op de zijkant van de cultuurputten om te voorkomen dat het oppervlak van cellen wordt verstoord.
    LET OP: Het optimale tijdspunt voor celfixatie moet empirisch worden bepaald. Immunofluorescentie signalen van zowel EYFP-CENP-A WT en K124R zijn detecteerbaar op de centromere ten minste 4 dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructies zelfs zonder Cre infectie (gegevens niet getoond, Figuur 1C-E voor de gegevens met Cre infectie).
  2. Voer methanolcelfixatie en immunofluorescentievlekken uit zoals eerder beschreven13.
  3. Als primaire antilichamen gebruik maken van een anti-GFP-antilichaam (1:1,000 verdunning) en een anti-CENP-B-antilichaam (verdunningsverhouding van 1:200) voor een centromere locatiemarker in TBS met 4% geitenserum (zie Tabel van Materialen voor gebruikte antilichamen).
  4. Verwijder overtollig montagemedium met een papieren handdoek en sluit de randen van de coverslip af met nagellak bij de laatste stap.
  5. Raadpleeg de eerder beschreven methode13 voor immunofluorescentiebeeldobservatie, verwerving, kwantificering en analyse van resterende signalen van EYFP-CENP-A bij de centromere.
  6. Beeldacquisitie, verwerking uitvoeren, inclusief deconvolutie, kwantificering en analyse met behulp van Softwares A of Software B1 en B2 (zie Tabel met materialen). Gebruik optioneel Softwares C1-C3 (zie Tabel van Materialen)voor een confocale laserscanmicroscoop.
    OPMERKING: Zie 2.6.1 in aanvullende coderingsbestanden voor alle opdrachten die worden gebruikt in Software A. Zie 2.6.2 in aanvullende codeerbestanden voor alle opdrachten die worden gebruikt in software B1 en B2.

3. Kolonie uitgroei testen met behulp van pBabe-EYFP-CENP-A na retro-Cre virus infectie

OPMERKING: De reden voor het uitvoeren van deze test is het vergelijken van de cel levensvatbaarheid tussen EYFP-CENP-A WT en K124R mutant na de verstoring van de CENP-A-/F allel door Cre recombinase (na de vervanging van de totale cellulaire CENP-A eiwit).

  1. Retrovirus transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs.
    1. Uitvoeren retrovirus transfectie van CENP-A-/F RPE-1 cellen zoals beschreven in sectie 1. Kweekcellen in DMEM: F12 medium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine voor 72 uur na de virusinfectie.
    2. Drie dagen na retrovirus infectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructs (op dag 6), voeg blasticidin S (10 μg/mL) in putten met transfected cellen worden gebruikt voor kolonie uitgroei test en controle-experimenten. Cellen worden ten minste 14 dagen na virusinfectie gekweekt in aanwezigheid van blasticidin S. Verander het medium dat blasticidin S elke 5 dagen bevat.
      OPMERKING: Als cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken voordat ze voor de kolonietest zaaien (3.2.7. en 3.2.8), doorsnee de cellen op 1:2 en 1:5 verhouding door trypsinisatie en beplating in een 6 goed kweekplaat.
    3. Verzamel cellen voor westerse vlek op dag 7 om de eiwitexpressie van pBabe-EYFP-CENP-A constructen zonder Cre-infectie te bevestigen. Voer westerse vlekanalyse uit zoals beschreven in sectie 4. De resultaten zijn te zien in figuur 1B (rijstroken 1-4).
    4. Voor kolonie uitgroei test met Cre virus infectie, houden de cellen groeien gedurende 14 dagen na de virusinfectie in aanwezigheid van blasticidin S (dat wil zeggen, groeien cellen in blasticidin S met medium tot dag 17 voor de resultaten hier gepresenteerd).
  2. Retro-Cre virusinfectie van pBabe-puro-Cre
    LET OP: Dag 0 in stap 3.2.1 komt overeen met dag 13 van punt 3.1.
    1. Dag 0 tot en met dag 3: Voer retrovirustransfectie uit van CENP-A-/F RPE-1 cellen met pBabe-puro-Cre (B3027) als expressieplasmid (zie sectie 1 voor meer informatie). Zorg ervoor dat blasticidin S (10 μg/mL) wordt toegevoegd in het kweekmedium.
    2. Dag 4: Probeer cellen te scheiden van de plaat. Plaat 500 of 5.000 cellen in drievoud in de 6-put kweekplaat. Kweekcellen in DMEM: F12 medium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
    3. Dag 5: Voeg blasticidin S (10 μg/mL) toe aan het kweekmedium. Voor de beplating van 5.000 of 500 cellen, selecteer cellen met blasticidin S (10 μg/ml) 3-24 dagen (tot dag 14 in [3.2.7]) of 3-28 dagen (tot dag 18 in [3.2.8]) na virusinfectie van constructies (pBabe-EYFP-CENP-A constructen).
      OPMERKING: In deze kolonie uitgroeitest wordt de transfectie van pBabe-puro-Cre toegevoegd, samen met de transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A. De transfectie van pBabe-EYFP-CENP-A wordt uitgevoerd in 3.1. De transfectie van pBabe-puro-Cre wordt uitgevoerd in 3.2.1.
    4. Dag 10 (7 dagen na retro-Cre virusinfectie): Verzamel cellen voor westerse blotting-analyse om eiwituitputting van endogene CENP-A te bevestigen na retro-Cre-virusinfectie en/of eiwitexpressie van pBabe-EYFP-CENP-A construeert op dezelfde dag 10.
    5. Voer western blotting uit zoals beschreven in sectie 4 op dezelfde dag 10. De resultaten worden weergegeven in figuur 1B (rijstroken 5-7).
    6. Voer immunofluorescentieanalyse uit (punt 2 hierboven) om te bevestigen dat zowel EYFP-CENP-A WT als K124R 7 dagen na inactivatie van het resterende endogene CENP-A-allel zijn gelokaliseerd op de centromere. De resultaten worden weergegeven in figuur 1C-1E.
    7. Dag 14: Voer de kolonie uitgroei test met de plaat gezaaid met 5.000 cellen. Fix cellen voor 10 min in methanol en vlek gedurende 10 min in een kristal violet oplossing (2,3% kristal violet, 0,1% ammoniumoxalaat, 20% ethanol (zie figuur 2B). Tel het aantal kolonies met de OpenCFU-software (zie figuur 2C).
    8. Dag 18: Gebruik de plaat gezaaid met 500 cellen. Fix en vlekcellen zoals beschreven in stap 3.2.7 (zie figuur 2B). Tel het aantal kolonies (zie figuur 2C).

4. Westerse vlekanalyse met pBabe-EYFP-CENP-A

OPMERKING: Raadpleeg de eerder beschreven methode13 voor westerse vlekanalyse met behulp van antilichamen die zijn aangegeven in figuur 1B en figuur 2A en tabel van materialen voor EYFP-CENP-A-eiwitten.

  1. Isoleer eiwitten door de cellen te lyseren die met verschillende virusinfectie worden gekweekt. Gebruik vervolgens 20 μg eiwit in één put van SDS PAGE gel. Breng de eiwitten over op een PVDF-membraan zoals eerder beschreven13.
  2. Was het membraan 3x na incubaties met primaire secundaire antilichamen. Detecteer en analyseer de eiwitbanden op het membraan met het infraroodbeeldvormingssysteem en/of de chemiluminescentie imager voor immunoblot detectie. Deze resultaten worden weergegeven in figuur 1B en figuur 2A.
    1. Zie stap 4.2.1 in aanvullende coderingsbestandenvoor het infraroodbeeldsysteem om de eiwitbanden te detecteren en te analyseren.
    2. Gebruik de chemiluminescence imager om de eiwitbanden te detecteren en te analyseren, zie stap 4.2.2 in aanvullende coderingsbestanden. Gebruik voor dit systeem een ultragevoelig verbeterd chemiluminescent (ECL) substraat(Tabel van materialen).
    3. Optioneel, gebruik westerse vlek strippen buffer uit te strippen pre-geïncubeerde antilichamen uit de PVDF membraan en reblot het met verschillende antilichamen voor de volgende draai van de westerse analyse. Empirisch bepalen de geoptimaliseerde incubatietijd en temperatuur te gebruiken.

5. Celcultuur, transfectie en in vivo alomtegenwoordigheidstesten met pQCXIP-EYFP-CENP-A

OPMERKING: Het eiwitniveau van EYFP-CENP-A uitgedrukt uit pQCXIP-vector is ~ 10x hoger dan het endogene CENP-A eiwitniveau. Het gebruik van deze vector vergemakkelijkt immunoprecipitatie van een hogere hoeveelheid van de EYFP-CENP-A eiwitten, observatie van de alomtegenwoordige banden van EYFP-CENP-A, en identificatie van de alomtegenwoordigelrilling van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit door middel van massaspectrometrie analyse.

  1. Transfectie voor in vivo alomtegenwoordigheidstesten met behulp van pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Zaad 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 cellen in een 10 cm weefselkweekschotel. Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te worden gebruikt bij het zaaien. Bereid ten minste 2 gerechten voor een immunoprecipitatie (IP) monster om een minimum van 1 mg totale eiwit te verkrijgen.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 18 uur.
    3. Om 17 uur na het zaaien, bereid de transfectie reagentia.
    4. Maak oplossing A door 6,7 μg plasmide van elke pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256)(Tabel 1)in 335 μL van gereduceerd serummedium, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 6,7 μg plasmide pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) toe aan alle monsters.
      OPMERKING: Alle vectoren staan vermeld in tabel 1.
    5. Maak oplossing B door 10,1 μL transfectiereagentia I en II te mengen, respectievelijk in 335 μL verlaagd serummedium, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
      OPMERKING: Een optionele stap is om slechts 40,2 μL transfection reagens III (polyethyleenimine [PEI]; 1,0 mg/mL) toe te voegen aan oplossing B of 40,2 μL-transfectiereagens III toe te voegen naast transfectiereagentia I en II in oplossing B (Tabel van materialen).
    6. Mix oplossingen A en B samen en broed 15 minuten op kamertemperatuur.
    7. Na het wassen van de gekweekte cellen eenmaal met PBS, voeg het mengsel van oplossingen A en B (d.w.z. DNA-lipide complex) rechtstreeks aan elk van de individuele 10 cm weefselkweek schotel die 3.35 mL μL verminderd serummedium heeft.
      LET OP: De uiteindelijke concentratie is 1,67 μg/mL plasmide.
    8. Incubeer de cellen bij 37 °C incubator met 5% CO2 voor 4,5 uur. Na 4,5 uur wijzigt u de medium tot high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
    9. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur na transfectie. Verzamel cellen voor de voorbereiding van cellenlysates.
  2. Bereiding van eiwit Een kralen gebonden met anti-GFP antilichaam.
    1. Neem 25 μL (50% v/v) eiwit Een kralen voor één reactie van immunoprecipitatie (IP). Wassen met buffer A1(Tabel van materialen) ten minste 3x om EtOH te verwijderen, en maak 50% oplossing met buffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholaat; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-vrije proteas inhibitor reageage).
    2. Voeg 2,0 μL anti-GFP-antilichaam (Anti#76: Homemade antilichaam) toe aan de parels die hierboven zijn bereid en voeg 10x volume buffer A1 toe in vergelijking met het netto kralenvolume.
    3. Voer end-to-end rotatie uit bij 4 °C voor 4-18 uur. De optimale tijdsduur voor end-to-end rotatie moet empirisch worden bepaald op basis van de efficiëntie van de immunoprecipitatie.
    4. Centrifuge de kralen op 100 x g gedurende 1 min en verwijder de ongebonden supernatant. Voeg buffer A1 toe om opnieuw een 50% (v/v) oplossing van de kralen te maken. Gebruik 25 μL (50% v/v) van deze oplossing voor één reactie van IP.
  3. Immunoprecipitatie (IP) met eiwit Een sepharose kralen gebonden met anti-GFP antilichaam.
    1. Lyse cellen verkregen in stap 5.1.9 in buffer A1 door sonicatie en vries-dooi proces.
    2. Meet eiwitconcentraties en normaliseer eiwithoeveelheden tussen verschillende IP-monsters. Verwijder 5% van het monster uit elke buis om te worden uitgevoerd als 5% invoermonster in SDS-PAGE.
      OPMERKING: Het 5% inputmonster kan worden ingevroren in vloeibare stikstof en bij -80 °C worden opgeslagen, als het niet binnen een dag wordt geladen.
    3. Meng de rest van 95% lysaat met 25 μL (50% v/v) eiwit Een kralen gebonden aan anti-GFP-antilichaam dat in stap 5.2 werd bereid. Voer end-to-end rotatie uit bij 4 °C voor 4-18 uur.
      LET OP: De optimale tijdsduur voor end-to-end rotatie moet empirisch worden bepaald.
    4. Centrifuge-eiwit Een kralen met het eiwit eraan gebonden (d.w.z. immunoprecipitaten) met 100 x g gedurende 1 min, en verwijder de supernatant. Was de immunoprecipitaten met buffer A1 door 100 x g gedurende 1 min te centrifugeren. Voer deze stap 4x uit.
    5. Meng de 5% Input en de rest van 95% immunoprecipitaten met respectievelijk 2x en 4x SDS-PAGE laadbuffer14. Kook deze twee monsters gedurende 5 minuten en laad ze vervolgens op een 10,0% denaturerende SDS-polyacrylamide gel voor elektroforese in verschillende rijstroken. Gebruik grotere SDS-PAGE gel (bijvoorbeeld 17 cm x 15 cm) voor elektroforese. Als monsters worden uitgevoerd in kleinere gel, is het mogelijk niet mogelijk om duidelijke / scherpe alomtegenwoordigheid banden te observeren.
    6. Voer westerse vlekanalyse uit zoals beschreven in punt 4 met behulp van de antilichamen die in het vorige rapport zijn vermeld8. Het resultaat wordt weergegeven in figuur 2A.
    7. Gebruik de westelijke vlek strippen buffer te strippen uit de pre-geïncubeerde antilichamen uit de PVDF membraan en reblot het met verschillende antilichamen voor de volgende ronde van de westelijke vlek analyse.

6. Massaspectrometrie om de alomtegenwoordigheidsplaats van de EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren

  1. Transfectie voor massaspectrometrieanalyse met pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Zaad CENP-A-/F RPE-1 cellen in een 10 cm weefselkweekschotel. Controleer of de celdichtheid 36,2 x 105 cellen per schaal is. Kweekcellen in high-glucose DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Bereid ten minste 20 gerechten voor één immunoprecipitatiemonster (IP), om ten minste 10 mg totaal eiwit te verkrijgen (zie 5.3).
      OPMERKING: Voor optimale resultaten, empirisch bepalen van de celdichtheid te gebruiken in het zaaien.
    2. Broed de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 voor 18 uur. Bereid de transfectiereagentia ~ 23 uur na verspreiding voor (24 uur punt is 0 h punt van de transfectie).
    3. Bereid om 17 uur na het zaaien de transfectiereagentia en transfecte cellen voor als (4.1.3). Transfected cellen hebben pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) en pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Incubeer de cellen bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 48 uur na transfectie. Verzamel cellen voor cellysates.
    5. Lysecellen in buffer A1 en voeren immunoprecipitatie uit als (5.2) en (5.3). Voer deze twee immunoprecipitatie lysates uit als volgt (6.1.6) en (6.1.7).
      OPMERKING: Voer het monster in (6.1.6) uit in standaard Tris-glycinegels. Voer in (6.1.7) het monster uit in de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels. Zie ook Discussie.
    6. Keep one sample for 10% of total immunoprecipitants to confirm EYFP-CENP-A ubiquitylation and to precisely determine the position of ubiquitinated EYFP-CENP-A as described in section 5. Voer dit monster uit in standaard Tris-glycine gels. SDS-PAGE en western vlek werden uitgevoerd als (5.3).
    7. Bewaar nog een monster voor 90% van de totale immunoprecipitanten voor massaspectrometrieanalyse. Voer dit monster uit in twee putten van de commercieel beschikbare 4%-12% Bis-Tris eiwitgels. Voer Coomassie blauwe vlekken uit met behulp van Coomassie blauwe oplossing. Accijnzen en uitsnijden van de gel regio van 50-70 kDa (putative mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R regio). Gebruik deze gel regio voor massaspectrometrie analyse.
  2. Massaspectrometrie analyse met behulp van in-gel spijsvertering.
    1. Snijd elk gelschijfje van belang in kleine stukjes (1 mm2)en plaats het in 0,5 mL eiwitarme bindingsbuizen.
    2. Was met 100 μL 50% (v/v) acetonitril in 25 mM NH4HCO3, vortex 10-15 min, spin down, gooi de supernatant weg, herhaal 3x.
    3. Concentreer het monster met behulp van benchtop vacuüm concentrator gedurende 30 min om de gel stukken te drogen.
    4. Voeg 10 μL van 10 ng/μL sequencing grade trypsine toe en laat de gelstukken 5 minuten hydrateren.
    5. Voeg 25 mM NH4HCO3 net genoeg toe om de gelstukken te bedekken, verteerbaar bij 37 °C 's nachts.
    6. Breng de verteerde supernatant over in een schone siliconen buis van 0,65 mL. Voeg 50% (v/v) acetonitrile/5% (v/v) mierenzuur (30 μL of genoeg om te dekken), vortex 10 min, spin en breng over in dezelfde extractiebuis. Herhaal 3x.
    7. Voeg 10 μL acetonitril toe aan de gelstukken, vortex 5 min en draai naar beneden. Breng de supernatant naar dezelfde buis.
    8. Concentreer de monsters met benchtop vacuüm concentrator op 2 μL, voeg 8 μL 3% (v/v) acetonitril /2% (v/v) mierenzuur toe aan het monster, vortex gedurende 15 minuten en spin neer bij 16.000 x g gedurende 30 min. Monsters zijn klaar voor massaspectrometrieanalyse.
    9. Ms-gegevensverwerving met LC-MS/MS uitvoeren met behulp van een vloeibaar chromatografiesysteem(Tabel van materialen)in combinatie met een massaspectrometrie-instrument(Tabel van materialen).
    10. Injecteer 8 μL gereconstitueerd monster op een kolom met vloeistofchromatografie (RPLC) in omgekeerde fase.
    11. Scheid de peptiden met een 2-80% gradiënt van oplosmiddel B in 60 min. Zorg ervoor dat het verloop bestaat uit een toenemend percentage oplosmiddel B van 2% tot 22% in 40 min, 22% tot 35% oplosmiddel B in 12 minuten, dan klimmen tot 80% oplosmiddel B in 4 min, en ten slotte bedrijf op 80% oplosmiddel B voor de laatste 4 min. Stel de stroomsnelheid constant op 300 nL/min.
      OPMERKING: Oplosmiddel A bevat 0,1% mierenzuur en 2% acetonitril, oplosmiddel B bevat 0,1% mierenzuur en 98% acetonitril. Alle concentraties worden weergegeven als volume/volume.
    12. Verzamel massaspectrometriegegevens met behulp van gegevensafhankelijke acquisitiemodus. Kortom, verzamel MS spectra in 350-1500 m/z voor 250 ms. Selecteer de Top 50 intense voorlopers met lading 2-5 voor verdere fragmentatie. Verzamel MS/MS spectra in 100-2000 m/z voor 100 ms, Sluit precursorionen uit herselectie voor 15 s.
    13. Open voor het zoeken in databases de commerciële software (zie Tabel van materialen)om massaspectrometriegegevens op het bureaublad te analyseren.
    14. Klik op de knop' LC' in het bovenste menu om een nieuwe zoekopdracht uit te voeren. Klik vervolgens op de knopToevoegenom de originele MS-onbewerkte gegevensbestanden te uploaden.
    15. Selecteer "Human Protein ID" in de "Paragon Methode" als de database zoekmethode. Doorzoek de originele MS raw data bestanden in de UniProt Homo Sapiens database (met 160.566 sequenties, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Stel zoekparameters als volgt in: selecteer trypsine als spijsverteringsenzym, laat maximaal 3 ontbrekende decolletés, 4 modificaties en 2-5 ladingen per peptide toe. Stel massafout in tot 20 ppm voor de eerste zoekopdracht en 0,02 Da voor gefragmenteerde ionen. Geef foutdetectiedrempels (FDR) op voor eiwit-, peptide- en modificatiesites van minder dan 1%. Stel alle andere parameters in de software in op standaardwaarden (zie figuur 3 voor massaspectrometrieanalyse).
    17. Klik op de knopOpslaan alsrechts van het bovenste menu, selecteer een map voor het opslaan van de zoekresultaten, voer de zoeknaam in en klik op de knopOpslaan.
    18. Klik op de knopProcesrechts van het bovenste menu om het zoeken te starten. Nadat de zoekopdracht is beëindigd, worden gegevens met de ingevoerde zoeknaam automatisch opgeslagen in de geselecteerde map. De gegevens kunnen eenvoudig worden geopend door Software F.
    19. Als u MS/MS-spectra van een specifiek peptide wilt verkrijgen, dubbelklikt u op de zoekresultaten om deze te openen door Software F. Klik eerst op het eiwit in de eiwitlijst bovenaan het menu en klik vervolgens op het peptide in het midden van het menu. De MS/MS van dit peptide staat onderaan het menu.
    20. Als u MS/MS-spectra wilt exporteren en opslaan, klikt u met de rechtermuisknop op de MS/MS-spectra onder in het menu, selecteert u kopiëren en plakken op een geschikt bestand zoals PPT- of doc-indeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

EYFP-CENP-A K124 mutant toont alomtegenwoordigheid, interactie met HJURP, en geen gebreken in centromere lokalisatie noch cel letaliteit. Hier werd het door Fachinetti et al. (2017)6 gemelde systeem opnieuw gevormd: in diploïde menselijke (RPE-1) cellen die er een droegen verstoord en één ''floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), werd EYFP-CENP-A uitgedrukt uit de pBabe-EYFP retrovirusvector. In dit systeem kan de expressie van endogene CENP-A uit het C...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschreven we methoden van massaspectrometrie analyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren suggereert dat de EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit8. In onze resultaten hebben we met succes alomtegenwoordigheid geïdentificeerd op lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, die overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrieanalyse. De hier beschreven massaspectrometrieanalyse i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Chao-Jun Li van het Model Animal Research Center, Nanjing University voor de analyse van massaspectrometrie. Wij danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, en de huidige onderzoekers van het Model Animal Research Center, Nanjing University en Greehey Children's Cancer Research Institute voor hun nuttige discussie, experimentele begeleiding en reagentia. Wij danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago en Dawn S. Chandler voor hun gulle giften van reagentia. Y.N. werd ondersteund door de provincie Jiangsu ''Double-First-Class'' Bouwfonds, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) en National Natural Science Foundation in China (31970665). Deze studie werd mede ondersteund door NCI grant R21 CA205659.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equpiments/Tools
0.5 ml protein low binding tubesEppendorf022431064Voor massaspectrometrie analyse
10cm cell culture dishBIOFIL/JET, China70022410 cm weefselkweekschaal (Yohei lab, PN63)
6 Well Cell Culture ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-well kweekplaat
CentriVapLABCONCO-Benchtop vacuüm concentrator voor vaccum droog peptiden voor massaspectrometrie analyse
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μmEksigent Technologies805-00120Liquid chromatography (RPLC) kolom voor massaspectrometrie analyse
HCX PL APO 100x oil immersion lensLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Olie immersie lens
HCX PL APO 63x oil immersion lensLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Olie immersie lens
Immobilon-FL PVDF Transfer MembraneEMD MilliporeIPVH00010Voor western blot
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscopeLeica-gemotoriseerde fluorescentiemicroscoop
Leica EL6000 compact light sourceLeicaExterne lichtbron voor fluorescente excitatie
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)Surgipath105Dekglas (22 mm x 22 mm)
Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatusApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010Gel elektroforese apparaat I om grotere SDS-PAGE gel toe te passen
nanoLC.2DEksigent Technologies-Liquid chromatography systeem voor massaspectrometrie analyse
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein GelsThermo FisherNP0335BOXDe commercieel verkrijgbare 4%-12% Bis-Tris eiwit gels voor massaspectrometrie analyse
Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscopeOlympus-Confocale laser scanning microscoop (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degital CCD cameraHamamatsuC10600-10BCCD camera
PAP PenBinding SiteAD100.1Voor een waterafstotende barrière bij immunofluorescente kleuring
TISSUE CULTURE DISHES 10CMVWR25382-16610 cm weefselkweekschaal
Vertical electrophoresis for gel running (big size)Junyi, ChinaJY-SCZ6+Gel elektroforese apparaat II om grotere SDS-PAGE gel toe te passen (Yohei lab, PE23)
VWR Micro Slides, FrostedVWR International48312-013Micro slides
Primary antibodies
Anti-CENP-A antibodyStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Muis monoklonaal antilichaam
Anti-CENP-B antibodyNovus BiologicalsH00001059-B01PMuis monoklonaal antilichaam
anti-GAPDHABCAMab37168Konijn polyklonaal antilichaam
anti-GAPDHInvitrogenPA1987Konijn polyklonaal antilichaam
anti-GFP antibodyANTI #76 (Homemade antibody)Konijn polyklonaal antilichaam
anti-HA (3F10)Roche11815016001Ratten monoklonaal antilichaam
anti-HJURPProteintech Group15283–1-APKonijn polyklonaal antilichaam
anti-UbiquitinBethyl LaboratoriesA300-317A-1Konijn polyklonaal antilichaam
Reagents
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Commercieel proteïne assay reagens I voor meting van proteïneconcentratie (compatibel met 0,1% SDS)
Branson SONIFIER 450Sonicator
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Disruptor hoorn voor sonicatie
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Microtip voor sonicatie
Buffer A1--20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% deoxycholaat; 0,5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-vrije protease inhibitor reagens
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11-873-580-001Complete EDTA-vrije protease inhibitor reagens voor buffer A1
Coomassie brilliant blue R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2Coomassie blauw oplossing voor massaspectrometrie analyse
Crystal violet solution (2,3% crystal violet, 0,1% ammonium oxylate, 20% ethanol)SigmaI-AldrichHT90132-1LVoor koloniekleuring
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Voor nucleaire kleuring
DMEM: F12 MediumATCC30-2006DMEM: F12 Medium
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US originLife Technologies/Gibco10082FBS (fetaal bovien serum)
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604High-glucose DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Transfectiereagens I voor chemische transfectie
Lipofectamin 3000, P3000 solutionLife Technologies/InvitrogenL3000Transfectiereagens II voor chemische transfectie
MethanolFisherA412-4Fixatie reagens
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)Fisher ScientificNC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)

Referenties

  1. Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
  3. Bernad, R., et al. Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly. J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).
  4. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  5. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions. Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).
  6. Fachinetti, D., et al. CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres. Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).
  7. Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).
  8. Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability. Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).
  9. Srivastava, S., Foltz, D. R. Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction. Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).
  10. Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly. Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).
  11. Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80. Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).
  12. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).
  13. Niikura, Y., Kitagawa, K. Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins. Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).
  14. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR. Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).
  15. Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling. Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).
  16. Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Identificatie van ubiquitinylleringimmunoprecipitatieprotocolLC-MS/MS-analysegel-excisiemethodetrypsineverteringProteïne A-beadsanti-GFP-antilichaamcentromeeridentiteit
Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.