Methodenartikel

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

DOI:

10.3791/61140

⸱

7 juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Correcte vouwing en assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen zijn essentieel voor de cellulaire functie. Cellen maken gebruik van kwaliteitscontroleroutes die beschadigde eiwitten corrigeren, sequesteren of elimineren om een gezond proteoom te behouden, waardoor cellulaire proteostase wordt gewaarborgd en verdere eiwitschade wordt voorkomen. Vanwege redundante functies binnen het proteostasenetwerk resulteert screening op detecteerbare fenotypes met behulp van knockdown of mutaties in chaperonne-coderende genen in het meercellige organisme Caenorhabditis elegans in de meeste gevallen in de detectie van kleine of geen fenotypen. We hebben een gerichte screeningsstrategie ontwikkeld om chaperones te identificeren die nodig zijn voor een specifieke functie en zo de kloof tussen fenotype en functie te overbruggen. In het bijzonder monitoren we nieuwe chaperonne-interacties met behulp van synthetische interactieschermen van RNAi, knock-down chaperone-expressie, één chaperone tegelijk, bij dieren die een mutatie dragen in een chaperonne-coderend gen of een chaperonne van belang overexpressie. Door twee chaperones te verstoren die individueel geen grof fenotype vertonen, kunnen we chaperones identificeren die een specifiek fenotype verergeren of blootleggen wanneer beide verstoord zijn. We tonen aan dat deze benadering specifieke sets chaperones kan identificeren die samen functioneren om de vouwing van een eiwit of eiwitcomplexen geassocieerd met een bepaald fenotype te moduleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen gaan om met eiwitschade door gebruik te maken van kwaliteitscontrolemachines die beschadigde eiwitten repareren, opsnijven of verwijderen1,2. Vouwen en assembleren van eiwitcomplexen worden ondersteund door moleculaire chaperonnes, een diverse groep van sterk geconserveerde eiwitten die beschadigde eiwitten kunnen herstellen of afslinden3,4,5,6,7. De verwijdering van beschadigde eiwitten wordt gemedieerd door het ubiquitine-proteasoomsysteem (UPS)8 of door de autofagiemachines9 in samenwerking met chaperones10,11,12. Eiwithomeostase (proteostase) wordt daarom in stand gehouden door kwaliteitscontrolenetwerken die bestaan uit vouw- en afbraakmachines3,13. Het begrijpen van de interacties tussen de verschillende componenten van het proteostasenetwerk in vivo is echter een grote uitdaging. Hoewel eiwit-eiwitinteractieschermen belangrijke informatie bijdragen over fysieke interacties en chaperonnecomplexen14,15, ontbreekt het aan inzicht in de organisatie en compensatiemechanismen binnen weefselspecifieke chaperonnenetwerken in vivo.

Genetische interacties worden vaak gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de relatie te onderzoeken tussen paren van genen die betrokken zijn bij gemeenschappelijke of compenserende biologische routes16,17,18. Dergelijke relaties kunnen worden gemeten door paren van mutaties te combineren en de impact van een mutatie in één gen op de fenotypische ernst veroorzaakt door een mutatie in het tweede gen te kwantificeren16. Hoewel de meeste van dergelijke combinaties geen effect hebben in termen van fenotype, kunnen sommige genetische interacties de ernst van het gemeten fenotype verergeren of verlichten. Verergerende mutaties worden waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant ernstiger is dan het verwachte fenotype dat wordt gezien bij het combineren van de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen in parallelle routes functioneren, samen een bepaalde functie beïnvloeden. Daarentegen worden verlichtende mutaties waargenomen wanneer het fenotype van de dubbele deletiemutant minder ernstig is dan het fenotype dat wordt gezien met de mutanten met enkele deletie, wat impliceert dat de twee genen samen als een complex werken of deelnemen aan dezelfde route16,18. Dienovereenkomstig zijn diverse fenotypen die kunnen worden gekwantificeerd, waaronder brede fenotypen, zoals letaliteit, groeisnelheden en broedgrootte, evenals specifieke fenotypen, zoals transcriptionele verslaggevers, gebruikt om genetische interacties te identificeren. Jonikas et al. vertrouwden bijvoorbeeld op een ER-stressverslaggever om interacties van het Saccharomyces cerevisiae ER ontvouwde eiwitresponsproteostase-netwerk te onderzoeken met behulp van paarsgewijze gendeletieanalyses19.

Genetische interactieschermen omvatten het systematisch kruisen van paarsgewijze deletiemutaties om een uitgebreide set dubbele mutanten te genereren20. In diermodellen, en specifiek in C. elegans, is deze grootschalige aanpak echter niet haalbaar. In plaats daarvan kunnen gemuteerde stammen worden getest op hun genetische interactiepatronen door genexpressie te downreguleren met behulp van RNA-interferentie (RNAi)21. C. elegans is een krachtig systeem voor schermen op basis van RNAi22,23. In C. eleganswordt dubbelstrengs RNA (dsRNA) levering bereikt door bacteriële voeding, wat leidt tot de verspreiding van dsRNA-moleculen naar talrijke weefsels. Op deze manier beïnvloeden de geïntroduceerde dsRNA-moleculen het dier via een snelle en eenvoudige procedure21. Een genetische interactiescreening met behulp van RNAi kan daarom de impact onthullen van het downreguleren van een set genen of de meeste C. elegans-coderende genen met behulp van RNAi-bibliotheken24. In zo'n scherm zijn hits die van invloed zijn op het gedrag van de mutant van belang, maar niet de wildtype stam potentiële modifiers van het fenotype die worden gecontroleerd25. Hier passen we een combinatie van mutaties en RNAi-screening toe om systematisch weefselspecifieke chaperonne-interacties in C. elegansin kaart te brengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van nematodengroeimediaplaten voor RNAi

  1. Voeg aan een fles van 1 L 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g agar en gedestilleerd water tot 1 L en autoclaaf toe.
  2. Koel fles tot 55 °C.
  3. Voeg 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 m CaCl2,1 ml 1 m MgSO4en 1 ml cholesteroloplossing(tabel 1)toe om nematodengroeimedia (NGM) te maken.
  4. Voeg 1 ml ampicilline (100 mg/ml) en 0,5 ml 1 m IPTG(tabel 1)toe om NGM-RNAi-oplossing te maken.
    OPMERKING: Veelgebruikte HT115 (DE3) E. coli-bacteriën bevatten een IPTG-induceerbare T7 DNA-polymerase dat wordt gebruikt voor het tot expressie brengen van de dsRNA-coderende plasmiden. Deze plasmiden coderen ook voor ampicillineresistentie.
  5. Meng de warme oplossing door de fles te draaien.
  6. Giet in de kap of met behulp van steriele procedures de NGM-oplossing in platen of gebruik een peristaltische pomp, dispenseer de oplossing in platen. Gebruik 6-well, 12-well, 40 mm of 60 mm platen voor dit scherm. Agar moet ongeveer 2/3 van de plaatdiepte vullen.
  7. Laat de borden een nacht drogen op de bank op kamertemperatuur, waarbij de borden bedekt blijven. NGM-platen voor RNAi kunnen maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.

2. RNAi-bacteriën kweken en de platen zaaien

  1. Voeg in de kap of met behulp van steriele procedures 1 ml ampicilline (100 mg / ml) en 2,5 ml tetracycline (5 mg / ml) (tabel 1) toe aan een gepreclaveerde 1 l LB-oplossing en mix.
    OPMERKING: Veelgebruikte HT115 (DE3) E. coli-bacteriën zijn tetracycline-resistent.
  2. Voeg in de kap of met behulp van steriele procedures 600 μL LB-oplossing toe aan elke put in 2 ml diepe steriele platen met 96 putten. Het is het beste om een meerkanaals pipet te gebruiken voor het doseren van de media.
  3. Met behulp van steriele procedures, ent putten met HT115 (DE3) E. coli bacteriën getransformeerd met een dsRNA-coderend plasmide gericht op een gen van belang of een leeg plasmide, als een controle. Dek de platen af en incubeer een nacht bij 37 °C. Bibliotheken die bestaan uit bacteriële klonen die dsRNA tot expressie brengen, overeenkomend met ~ 94% van de voorspelde C. elegans-genen, werden eerder geconstrueerd22,23 en zijn commercieel beschikbaar. De chaperonnebibliotheek die hier wordt gebruikt, is gebouwd door dr. Richard Morimoto laboratorium26.
  4. Met behulp van steriele procedures zaait u 75, 150 of 250 μL bacteriën op respectievelijk de 12-well, 40 mm en 6-well of 60 mm NGM RNAi-platen. Markeer duidelijk de naam van het doelgen op de plaat. Bacteriën moeten 30-50% van het agaroppervlak bedekken en mogen de randen van de plaat niet raken.
  5. Laat de borden minstens 2 dagen drogen op de bank bij kamertemperatuur, waarbij de platen bedekt blijven.
    OPMERKING: Platen kunnen 's nachts bij 37 °C worden geïncubeerd. Zorg ervoor dat de binnenputten droog zijn voordat u de platen gebruikt of opbergt. Voor alle doeleinden op lange termijn (d.w.z. drogen of opslaan) houdt u de platen in het donker. Gedroogde, gezaaide platen kunnen maximaal een maand bij 4 °C worden bewaard.

3. Niet-stressvolle synchronisatie van embryo's

  1. Gebruik een wormenpluk om ongeveer 100 eieren van een niet-gesynchroniseerde wormplaat naar een nieuw gezaaide NGM-plaat te verplaatsen.
  2. Kweek dieren gedurende 5 dagen bij 15 °C, 3,5 dagen bij 20 °C of 2,5 dagen bij 25 °C. Dieren moeten de eerste dag van het leggen van eieren bereiken.
    OPMERKING: Wormen worden gewoonlijk gekweekt bij 20 °C. Verschillende chaperonnemutante stammen kunnen echter specifieke teelttemperaturen vereisen. Veel temperatuurgevoelige soorten worden bijvoorbeeld gekweekt bij 15 °C, maar verschoven naar 25 °C om hun fenotype bloot te leggen.
  3. Voeg 1 ml M9-buffer(tabel 1)langzaam en uit de buurt van het bacteriële gazon toe. Draai de plaat zo dat de buffer de plaat volledig bedekt. Kantel het vervolgens naar één kant en verwijder de vloeistof van het bord en was de dieren van het bord.
    OPMERKING: Bij het gebruik van temperatuurgevoelige dieren of chaperonnemutanten is het het beste om de buffers die in het protocol worden gebruikt op de kweektemperatuur van de dieren te houden.
  4. Herhaal stap 3.3 drie keer of totdat alle dieren van het bord zijn gewassen.
  5. Snijd met behulp van een standaard plastic punt een vierkant agar uit de gewassen plaat waar eieren worden geconcentreerd en plaats het stuk agar op een nieuw gezaaide NGM-plaat.
    OPMERKING: ~ 200 eieren zijn nodig om voldoende eierleggende dieren te produceren; te veel dieren consumeren de bacterie te snel. Lage voedselniveaus kunnen van invloed zijn op de proteostase27.
  6. Kweek de dieren gedurende 5 dagen bij 15 °C, 3,5 dagen bij 20 °C of 2,5 dagen bij 25 °C. Op dit punt moeten de platen worden bedekt met gesynchroniseerde eieren.
    OPMERKING: Dieren kunnen voor een korte duur naar een nieuwe plaat worden verplaatst voor een strengere synchronisatie. Het is echter belangrijk om alleen volwassenen te gebruiken in de vroege stadia van het leggen van eieren, omdat dieren eieren in hun baarmoeder kunnen behouden, wat de synchronisatie beïnvloedt.
  7. Voeg langzaam 1 ml M9-buffer toe en uit de buurt van het bacteriële gazon.
  8. Draai de plaat zo dat de buffer de plaat volledig bedekt. Kantel het vervolgens naar één kant en verwijder de vloeistof van het bord en was de dieren van het bord.
  9. Herhaal stap 3.7 drie keer of totdat alle dieren van het bord zijn gewassen.
  10. Voeg 1 ml M9-buffer toe en gebruik een celschraper om de eieren van de plaat los te maken.
  11. Verzamel de M9-buffer met de eieren van de platen.
  12. Centrifugeer de M9-buffer met de eieren gedurende 2 minuten bij 3.000 x g.
  13. Verwijder het supernatant en voeg M9-buffer toe om een volume van 1 ml te bereiken.
  14. Resuspend de eieren om eventuele brokken eieren en bacteriën te verstoren.
  15. Herhaal de wasprocedure die wordt beschreven in stappen 3.11-3.13 vijf keer. De eikorrel moet er wit uit zien. Als het nog steeds geel/bruin is, herhaal dan de was totdat een witte pellet is bereikt.
    OPMERKING: Bacteriën die op de eieren achterblijven, kunnen de dsRNA-tot expressie brengende bacteriën besmetten.
  16. Verwijder het grootste deel van het supernatant en laat ongeveer 200 μL over. Gesynchroniseerde eieren kunnen worden gebruikt voor RNAi-schermen.

4. Gemeenschappelijke fenotypische assays

  1. Teelt van dieren tijdens experimenten
    1. Plaats een druppel van ~ 30 eieren dicht bij het bacteriële gazon in elke RNAi-gezaaide plaat. Plaats ter referentie ook ~ 30 eieren op platen gezaaid met lege vectorbevattende (L4440) bacteriën.
    2. Cultiveer leeftijdsgesynchroniseerde dieren op NGM RNAi-gezaaide platen. De duur van het experiment hangt af van het stadium waarin de dieren moeten worden gecontroleerd en de temperatuur van de teelt. Pas de teelttemperatuur aan bij gebruik van temperatuurgevoelige mutante dieren. Pas de teeltduur aan bij gebruik van ontwikkelingsverachterstand gemuteerde dieren.
      OPMERKING: Hoewel de timing kan variëren, zodra dieren de volwassenheid bereiken, kan het leggen van eieren (en de resulterende snelle voedselconsumptie), evenals leeftijdsafhankelijke proteostsis-ineenstorting28,de resultaten beïnvloeden. Het wordt daarom aanbevolen om dieren te scoren voor het begin van het leggen van eieren (dag 1 van volwassenheid). Wilde dieren bereiken dit stadium na 4,5 dagen bij 15 °C, 3 dagen bij 20 °C of 2 dagen bij 25 °C.
    3. Het aantal gebruikte herhalingen is afhankelijk van de grootte van de onderzochte genenset. Herhaal voor de chaperonnebibliotheek (97 genen) experimenten minstens vier keer. De grootte van de populatie hangt af van de gebruikte test. In de gedragstests die hier worden besproken, score >15 dieren per experimentele toestand in elke herhaling. Gegevens en statistische analyses zijn ook sterk afhankelijk van het type test dat wordt gebruikt. Gegevens in de hier besproken assays kunnen worden gepresenteerd als middel ± SEM.
    4. Vergelijk de met RNAi en lege vectorcontrole behandelde dieren als onafhankelijke populaties. P-waarden kunnen worden berekend met behulp van eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA, afhankelijk van de onderzochte veranderingen, namelijk alleen verergeren of verlichten of beide. Bij het onderzoeken van een enkele RNAi-behandeling versus controle, kunnen P-waarden worden berekend met behulp van eenrichtings- of tweerichtings Mann-Whitney-rangsomtest. Anders dan statistische significantie, overweeg een drempel voor hits op basis van de mate van impact op het fenotype.
  2. Ontwikkelingsstilstand/-vertraging
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorbevattende controlebacteriën volwassen zijn, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Monitor dieren met behulp van een stereomicroscoop en tel het aantal larven en volwassenen om het percentage dieren met ontwikkelingsachterstand te scoren. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vectorbevattende controlebacteriën. hsp-1 of hsp-90 RNAi behandeling resulteert in ontwikkelingsstilstand van wilde dieren en kan worden gebruikt als een positieve controle.
    3. Om het percentage ontwikkelingsver vertraagde dieren in de loop van de tijd te scoren, herhaalt u stap 4.2.2.
      OPMERKING: Als er eierleggende volwassenen op de plaat zijn, breng dan de ontwikkelingsver vertraagde dieren over naar een nieuwe NGM-RNAi-plaat die is gelabeld voor hetzelfde doelgen om verwarring met het nageslacht te voorkomen.
  3. Steriliteit of eierleggingsdefecten
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën eieren beginnen te leggen.
    2. Monitor dieren met behulp van een stereomicroscoop en scoor het percentage dieren zonder zichtbare eieren in hun baarmoeder. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën.
    3. Als alternatief, controleer dieren met behulp van een stereomicroscoop en scoor het percentage dieren met een baarmoeder vol eieren, gedefinieerd als EGg Laying defect (Egl-d) fenotype29.
  4. Embryonale letaliteit
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat de dieren eieren beginnen te leggen.
    2. Breng ~100 eieren over op een lege plaat. Verdeel de eieren in rijen om het tellen te vereenvoudigen.
    3. Scoor het percentage niet-gehate eieren op het bord na 24-48 uur. Ter referentie, vergelijk met eieren van dieren behandeld met lege vector-controle bacteriën.
  5. Verlammingstest
    1. Kweek voor volwassenen van dag 1 leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën de volwassenheid bereiken, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Teken een lijn op de achterkant van een gewone NGM-agarplaat met behulp van een fijne marker.
    3. Plaats 5-10 dieren op de gemarkeerde lijn.
    4. Stel een timer in en wacht 10 minuten.
    5. Scoor het percentage dieren dat aan de lijn blijft als verlamde wormen. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën. Wilde dieren behandeld met unc-45 RNAi vertonen een ernstig verlammingsfenotype en kunnen worden gebruikt als een positieve controle.
      OPMERKING: Deze test benadrukt dieren die gemiddelde tot ernstige verlamming vertonen. Dergelijke dieren liggen meestal recht op de plaat, in plaats van de gemeenschappelijke gebogen vorm te presenteren. Bovendien is een van bacteriën ontruimde plek zichtbaar rond de hoofden van verlamde wormen.
  6. Thrashing assay
    1. Kweek leeftijdsgesynchroniseerde dieren zoals in stap 4.1 totdat dieren die zijn gekweekt op lege vectorcontrolebacteriën volwassen zijn, maar voordat het leggen van eieren begint.
    2. Pipetteer 100 μL M9-buffer bij de kweektemperatuur van de dieren in een plaat met 96 putten.
    3. Plaats ~15 wormen, één per put, in de M9-bufferbevattende putten.
    4. Laat de dieren zich 5 min aanpassen.
    5. Onderzoek elk dier onder de stereomicroscoop, start een timer die 15 s aftelt en tel het aantal lichaamsbuigingen dat elk dier in die tijdspanne uitvoert. De getelde waarden kunnen worden genormaliseerd naar lichaamsbochten per minuut. Ter referentie, vergelijk met gemuteerde dieren gekweekt op lege vector-controle bacteriën.
      OPMERKING: Deze motiliteitstest is zeer gevoelig en kan zeer milde verschillen tussen behandelingen detecteren. Motiliteit in vloeistof en motiliteit op agar kunnen echter verschillen.

5. Validatie van eiwit knockdown

  1. Plaats 250-300 gesynchroniseerde eieren op een 60 mm NGM-RNAi-plaat gezaaid met de relevante dsRNA-tot expressie brengende of lege vectorbevattende (L4440) bacteriën.
    OPMERKING: RNAi knockdown kan resulteren in afwijkende accumulatie van embryo's, in een gebrek aan embryo's of in ontwikkelingsstilstand die de genexpressie kan beïnvloeden. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de leeftijd van de te onderzoeken dieren.
  2. Voor volwassenen van dag 1, kweek dieren gedurende 4,5 dagen bij 15 °C, 3 dagen bij 20 °C of 2 dagen bij 25 °C.
  3. Pluk en breng in totaal 200 jongvolwassen dieren over in de dop van een buisvulling van 1,5 ml met 200 μL PBS-T.
    OPMERKING: Bij het gebruik van temperatuurgevoelige dieren of chaperonnemutanten is het het beste om de buffers die in het protocol worden gebruikt op de kweektemperatuur van de dieren te houden.
  4. Sluit de dop voorzichtig en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g.
  5. Voeg 800 μL PBS-T(tabel 1)toe en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.000 x g.
  6. Verwijder voorzichtig de bovenste 900 μL.
  7. Herhaal stap 5.4-5.6 drie keer.
  8. Verwijder 900 μL en laat 100 μL oplossing achter die de 200 wormen bevat.
  9. Voeg 25 μL 5x monsterbuffer toe(tabel 1).
  10. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 92°C terwijl u schudt bij 1000 tpm. Monsters kunnen vervolgens worden ingevroren en bij -20 °C worden bewaard.
  11. Laad 20 μL van elk monster en voer uit op een SDS-PAGE-gel.
  12. Voer western blot-analyse uit met behulp van geschikte antilichamen om de relatieve stabiliteit van het eiwit te bepalen.
  13. Bepaal de intensiteit van de banden met behulp van densitometrische software, zoals de vrij verkrijgbare ImageJ-gelmodule. Normaliseer alle waarden naar de waarden die in de controlesteekproef(en) zijn gemeten.
    OPMERKING: Het doel van RNAi knockdown in onze schermen is om het eiwitgehalte van een specifieke chaperonne / co-chaperonne te verlagen. De beste manier om de efficiëntie van de RNAi-knockdown te beoordelen, is dus door western blot-analyse. Hiervoor zijn specifieke antistoffen nodig. Als alternatief kan qPCR worden gebruikt om mRNA-niveaus te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gebruik van temperatuurgevoelige mutaties in UNC-45 om te screenen op verergerende of verlichtende interacties onder respectievelijk tolerante of beperkende omstandigheden
Spierassemblage en -onderhoud bieden een effectief systeem om weefselspecifieke chaperonne-interacties te bestuderen. De functionele eenheid van contractiele spieren, het sarcomeer, presenteert een kristallijne opstelling van structurele en regulerende eiwitten. De stabiliteit van het motoreiwit myosine en de opname ervan in de dikk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geïntegreerd beeld van het proteostasenetwerk dat weerspiegelt hoe het is georganiseerd en functioneert in verschillende metazoïsche cellen en weefsels ontbreekt nog steeds. Om deze tekortkoming aan te pakken, is specifieke informatie nodig over de interacties van verschillende componenten van dit netwerk, zoals moleculaire chaperones, in specifieke weefsels in de loop van ontwikkeling en veroudering. Hier lieten we zien hoe het gebruik van weefselspecifieke verstoringen ons in staat stelde om het chaperonnenetwerk i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Caenorhabditis Genetics Center, gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR), voor enkele van de nematodenstammen. Monoklonale antilichamen ontwikkeld door H.F. Epstein werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de afdeling Biologie, Universiteit van Iowa. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Israel Science Foundation (subsidie nr. 278/18) en door een subsidie van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie, en het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Samenwerking, directoraat-generaal voor landenbevordering, Italiaanse Republiek (subsidie nr. 3-14337). We bedanken leden van het Ben-Zvi laboratorium voor hulp bij het voorbereiden van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E. Protein quality control in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (3), (2017).
  3. Bar-Lavan, Y., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Chaperone families and interactions in metazoa. Essays in Biochemistry. 60 (2), 237-253 (2016).
  4. Schopf, F. H., Biebl, M. M., Buchner, J. The HSP90 chaperone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 345-360 (2017).
  5. Carra, S., et al. The growing world of small heat shock proteins: from structure to functions. Cell Stress Chaperones. 22 (4), 601-611 (2017).
  6. Rosenzweig, R., Nillegoda, N. B., Mayer, M. P., Bukau, B. The Hsp70 chaperone network. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  7. Gestaut, D., Limatola, A., Joachimiak, L., Frydman, J. The ATP-powered gymnastics of TRiC/CCT: an asymmetric protein folding machine with a symmetric origin story. Current Opinion in Structural Biology. 55, 50-58 (2019).
  8. Bett, J. S. Proteostasis regulation by the ubiquitin system. Essays in Biochemistry. 60 (2), 143-151 (2016).
  9. Jackson, M. P., Hewitt, E. W. Cellular proteostasis: degradation of misfolded proteins by lysosomes. Essays in Biochemistry. 60 (2), 173-180 (2016).
  10. Kettern, N., Dreiseidler, M., Tawo, R., Hohfeld, J. Chaperone-assisted degradation: multiple paths to destruction. Biological Chemistry. 391 (5), 481-489 (2010).
  11. Cuervo, A. M., Wong, E. Chaperone-mediated autophagy: roles in disease and aging. Cell Research. 24 (1), 92-104 (2014).
  12. Kevei, E., Pokrzywa, W., Hoppe, T. Repair or destruction-an intimate liaison between ubiquitin ligases and molecular chaperones in proteostasis. FEBS Letters. 591 (17), 2616-2635 (2017).
  13. O'Brien, D., van Oosten-Hawle, P. Regulation of cell-non-autonomous proteostasis in metazoans. Essays in Biochemistry. 60 (2), 133-142 (2016).
  14. Taipale, M., et al. Quantitative analysis of HSP90-client interactions reveals principles of substrate recognition. Cell. 150 (5), 987-1001 (2012).
  15. Taipale, M., et al. A quantitative chaperone interaction network reveals the architecture of cellular protein homeostasis pathways. Cell. 158 (2), 434-448 (2014).
  16. Baryshnikova, A., Costanzo, M., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Genetic interaction networks: toward an understanding of heritability. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 14, 111-133 (2013).
  17. Costanzo, M., et al. Global Genetic Networks and the Genotype-to-Phenotype Relationship. Cell. 177 (1), 85-100 (2019).
  18. Domingo, J., Baeza-Centurion, P., Lehner, B. The Causes and Consequences of Genetic Interactions (Epistasis). Annual Review of Genomics and Human Genetics. 20, 433-460 (2019).
  19. Jonikas, M. C., et al. Comprehensive characterization of genes required for protein folding in the endoplasmic reticulum. Science. 323 (5922), 1693-1697 (2009).
  20. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123 (3), 507-519 (2005).
  21. Billi, A. C., Fischer, S. E., Kim, J. K. Endogenous RNAi pathways in C. elegans. WormBook. , 1-49 (2014).
  22. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  23. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  24. Lehner, B., Crombie, C., Tischler, J., Fortunato, A., Fraser, A. G. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nature Genetics. 38 (8), 896-903 (2006).
  25. Frumkin, A., et al. Challenging muscle homeostasis uncovers novel chaperone interactions in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 21(2014).
  26. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  27. Shpigel, N., Shemesh, N., Kishner, M., Ben-Zvi, A. Dietary restriction and gonadal signaling differentially regulate post-development quality control functions in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 18 (2), 12891(2019).
  28. Shai, N., Shemesh, N., Ben-Zvi, A. Remodeling of proteostasis upon transition to adulthood is linked to reproduction onset. Current Genomics. 15 (2), 122-129 (2014).
  29. Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104 (4), 619-647 (1983).
  30. Pokrzywa, W., Hoppe, T. Chaperoning myosin assembly in muscle formation and aging. Worm. 2 (3), 25644(2013).
  31. Barral, J. M., Bauer, C. C., Ortiz, I., Epstein, H. F. Unc-45 mutations in Caenorhabditis elegans implicate a CRO1/She4p-like domain in myosin assembly. Journal of Cell Biology. 143 (5), 1215-1225 (1998).
  32. Venolia, L., Ao, W., Kim, S., Kim, C., Pilgrim, D. unc-45 gene of Caenorhabditis elegans encodes a muscle-specific tetratricopeptide repeat-containing protein. Cell Motility and the Cytoskeleton. 42 (3), 163-177 (1999).
  33. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  34. Etard, C., et al. The UCS factor Steif/Unc-45b interacts with the heat shock protein Hsp90a during myofibrillogenesis. Developmental Biology. 308 (1), 133-143 (2007).
  35. Wohlgemuth, S. L., Crawford, B. D., Pilgrim, D. B. The myosin co-chaperone UNC-45 is required for skeletal and cardiac muscle function in zebrafish. Developmental Biology. 303 (2), 483-492 (2007).
  36. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295 (5555), 669-671 (2002).
  37. Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
  38. Gaiser, A. M., Kaiser, C. J., Haslbeck, V., Richter, K. Downregulation of the Hsp90 system causes defects in muscle cells of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6 (9), 25485(2011).
  39. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  40. Bar-Lavan, Y., et al. A Differentiation Transcription Factor Establishes Muscle-Specific Proteostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 12 (12), 1006531(2016).
  41. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400 (1-2), 166-173 (2007).
  42. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS Genet. 9 (11), 1003921(2013).
  43. Fisher, A. L. Of worms and women: sarcopenia and its role in disability and mortality. Journal of the American Geriatrics Society. 52 (7), 1185-1190 (2004).
  44. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  45. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  46. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  47. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  48. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489 (7415), 263-268 (2012).
  49. Liu, G., Rogers, J., Murphy, C. T., Rongo, C. EGF signalling activates the ubiquitin proteasome system to modulate C. elegans lifespan. EMBO Journal. 30 (15), 2990-3003 (2011).
  50. Asikainen, S., Vartiainen, S., Lakso, M., Nass, R., Wong, G. Selective sensitivity of Caenorhabditis elegans neurons to RNA interference. Neuroreport. 16 (18), 1995-1999 (2005).
  51. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  52. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. 8 (3), 58218(2013).
  53. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  54. Yu, A., et al. Tau protein aggregates inhibit the protein-folding and vesicular trafficking arms of the cellular proteostasis network. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  55. Yu, A., et al. Protein aggregation can inhibit clathrin-mediated endocytosis by chaperone competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1481-1490 (2014).
  56. Parker-Thornburg, J., Bonner, J. J. Mutations that induce the heat shock response of Drosophila. Cell. 51 (5), 763-772 (1987).
  57. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nature Reviews Genetics. 9 (7), 554-566 (2008).
  58. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  59. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  60. Rohl, A., Rohrberg, J., Buchner, J. The chaperone Hsp90: changing partners for demanding clients. Trends in Biochemical Sciences. 38 (5), 253-262 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Synthetische RNAi screenembryonale letaliteitverlammingsassayWestern blot analysevalidatie van prote ne knockdowngenetische interactiescreenHSP6 gen

Gerelateerde artikelen