Method Article

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

DOI:

10.3791/61140

⸱

June 7th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Correcte vouwing en assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen zijn essentieel voor de cellulaire functie. Cellen maken gebruik van kwaliteitscontroleroutes die beschadigde eiwitten corrigeren, sequesteren of elimineren om een gezond proteoom te behouden, waardoor cellulaire proteostase wordt gewaarborgd en verdere eiwitschade wordt voorkomen. Vanwege redundante functies binnen het proteostasenetwerk resulteert screening op detecteerbare fenotypes met behulp van knockdown of mutaties in chaperonne-coderende genen in het meercellige organisme Caenorhabditis elegans in de meeste gevallen in de detectie van kleine of geen fenotypen. We hebben een gerichte screeningsstrategie ontwikkeld om chaperones te identificeren die nodig zijn voor een specifieke functie en zo de kloof tussen fenotype en functie te overbruggen. In het bijzonder monitoren we nieuwe chaperonne-interacties met behulp van synthetische interactieschermen van RNAi, knock-down chaperone-expressie, één chaperone tegelijk, bij dieren die een mutatie dragen in een chaperonne-coderend gen of een chaperonne van belang overexpressie. Door twee chaperones te verstoren die individueel geen grof fenotype vertonen, kunnen we chaperones identificeren die een specifiek fenotype verergeren of blootleggen wanneer beide verstoord zijn. We tonen aan dat deze benadering specifieke sets chaperones kan identificeren die samen functioneren om de vouwing van een eiwit of eiwitcomplexen geassocieerd met een bepaald fenotype te moduleren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen gaan om met eiwitschade door gebruik te maken van kwaliteitscontrolemachines die beschadigde eiwitten repareren, opsnijven of verwijderen1,2. Vouwen en assembleren van eiwitcomplexen worden ondersteund door moleculaire chaperonnes, een diverse groep van sterk geconserveerde eiwitten die beschadigde eiwitten kunnen herstellen of afslinden3,4,5,6,7. De verwijdering van beschadigde eiwitten wordt gemedieerd door het ubiquitine-proteasoomsysteem ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van nematodengroeimediaplaten voor RNAi

  1. Voeg aan een fles van 1 L 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g agar en gedestilleerd water tot 1 L en autoclaaf toe.
  2. Koel fles tot 55 °C.
  3. Voeg 25 ml 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 ml 1 m CaCl2,1 ml 1 m MgSO4en 1 ml cholesteroloplossing(tabel 1)toe om nematodengroeimedia (NGM) te maken.
  4. Voeg 1 ml ampicilline (100 mg/ml) en 0,5 ml 1 m IPTG(tabel 1)toe om NGM-RNAi-oplossing te maken.
    OPMERKING: Veelgebruikte HT115 (DE3) E. coli-bacteriën bevatten een IPTG-induceerbare T7 DNA-polymerase dat wordt gebruik....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gebruik van temperatuurgevoelige mutaties in UNC-45 om te screenen op verergerende of verlichtende interacties onder respectievelijk tolerante of beperkende omstandigheden
Spierassemblage en -onderhoud bieden een effectief systeem om weefselspecifieke chaperonne-interacties te bestuderen. De functionele eenheid van contractiele spieren, het sarcomeer, presenteert een kristallijne opstelling van structurele en regulerende eiwitten. De stabiliteit van het motoreiwit myosine en de opname ervan in de dikk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geïntegreerd beeld van het proteostasenetwerk dat weerspiegelt hoe het is georganiseerd en functioneert in verschillende metazoïsche cellen en weefsels ontbreekt nog steeds. Om deze tekortkoming aan te pakken, is specifieke informatie nodig over de interacties van verschillende componenten van dit netwerk, zoals moleculaire chaperones, in specifieke weefsels in de loop van ontwikkeling en veroudering. Hier lieten we zien hoe het gebruik van weefselspecifieke verstoringen ons in staat stelde om het chaperonnenetwerk i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Caenorhabditis Genetics Center, gefinancierd door het NIH National Center for Research Resources (NCRR), voor enkele van de nematodenstammen. Monoklonale antilichamen ontwikkeld door H.F. Epstein werden verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de afdeling Biologie, Universiteit van Iowa. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Israel Science Foundation (subsidie nr. 278/18) en door een subsidie van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie, en het ministerie van Buitenlandse Zaken en Internationale Samenwerking, directoraat-generaal voor landenbevorder....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12-well-platesSPLBA3D16B
40 mm platesGreiner Bio-one627160
60 mm platesGreiner Bio-one628102
6-well platesThermo Scientific140675
96 well 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
AgarFormediumAGA03
AmpicillinFormedium69-52-3
bromophenol blueSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
CameraQimagingq30548
CholesterolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filter (0.22 µm)SigmaSCGPUO2RE
Fluorescent stereomicroscopeLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Gift from the Morimoto laboratory
Myosin MHC A (MYO-3) antibodyHybridoma Bank5-6
Na2HPO4·7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Plate pouring pumpIntegradoes it p920
RNAi Chaperone libraryNANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß-mercaptoethanolBio world41300000-1
stereomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (1), 4-19 (2018).
  2. Dubnikov, T., Ben-Gedalya, T., Cohen, E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caenorhabditis elegansChaperone InteractionsRNAi Synthetic ScreenTissue SpecificEmbryonic LethalityParalysis AssayWestern Blot AnalysisProtein Knockdown ValidationGenetic Interaction ScreenHSP6 Gene

Related Articles