Methodenartikel

Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie

DOI:

10.3791/61154

⸱

12 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een nanosfeerlithografiemethode beschreven voor parallelle fabricage van zero-mode golfgeleiders, die arrays van nanoapertures zijn in een met metaal beklede glazen microscopie coverslip voor beeldvorming met één molecuul bij nano- tot micromolarconcentraties van fluoroforen. De methode maakt gebruik van colloïdale kristal zelfassemblage om een waveguide sjabloon te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In fluorescentie-enzymologie met één molecuul beperkt achtergrondfluorescentie van gelabelde substraten in oplossing vaak de fluorofoorconcentratie tot pico- tot nanomolar-bereiken, verschillende ordes van grootte minder dan veel fysiologische ligandconcentraties. Optische nanostructuren genaamd zero mode waveguides (ZMW's), die 100−200 nm in diameteropeningen zijn vervaardigd in een dun geleidend metaal zoals aluminium of goud, maken beeldvorming van individuele moleculen bij micromolarconcentraties van fluoroforen mogelijk door zichtbare licht excitatie te beperken tot zeptoliter effectieve volumes. De behoefte aan dure en gespecialiseerde nanofabrication-apparatuur heeft echter het wijdverbreide gebruik van ZMW's uitgesloten. Meestal worden nanostructuren zoals ZMW's verkregen door direct te schrijven met behulp van elektronenstraallithografie, die sequentieel en traag is. Hier, colloïdaal, of nanosfeer, wordt lithografie gebruikt als een alternatieve strategie om maskers op nanometerschaal te maken voor het fabriceren van golfgeleiders. Dit verslag beschrijft de aanpak in detail, met praktische overwegingen voor elke fase. De methode maakt het mogelijk om duizenden aluminium of gouden ZMW's parallel te maken, met uiteindelijke golfgeleiderdiameters en diepten van 100−200 nm. Alleen gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en een thermische verdamper voor metaaldepositie zijn vereist. Door ZMW's toegankelijker te maken voor de biochemische gemeenschap, kan deze methode de studie van moleculaire processen bij cellulaire concentraties en snelheden vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-molecule technieken zoals single molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) of single molecule fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) zijn krachtige tools voor moleculaire biofysica, waardoor de studie van dynamische bewegingen, conformaties en interacties van individuele biomoleculen in processen zoals transcriptie1,2,3, vertaling4,5,6, en vele anderen7. Voor smFRET is totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie een veel voorkomende methode omdat veel tethered moleculen in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd en de evanescente golf die door TIR wordt gegenereerd, beperkt is tot een gebied van 100−200 nm naast de coverslip8. Echter, zelfs met deze beperking op excitatie volume, fluoroforen van belang moeten nog steeds worden verdund tot pM of nM bereiken om enkele molecuul signalen boven achtergrond fluorecence9te detecteren . Aangezien de Michaelis-Menten-constanten van cellulaire enzymen zich meestal in het μM-mM-bereik10bevinden, zijn biochemische reacties in studies met één molecuul meestal veel langzamer dan die in de cel. Eiwitsynthese vindt bijvoorbeeld plaats bij 15−20 aminozuren per seconde in E. coli11,12, terwijl de meeste prokaryotische ribosomen in smFRET-experimenten zich vertalen bij 0,1−1 aminozuur per seconde13. In de eiwitsynthese toonden kristalstructuren en smFRET op vastgelopen ribosomen aan dat transfer-RNA 's (tRNAs) fluctueren tussen 'hybride' en 'klassieke' toestanden vóór de tRNA-mRNA translocatie stap14,15. Wanneer echter fysiologische concentraties van de translocatie GTPase-factor, EF-G, aanwezig waren, werd in smFRET6een andere conformatie waargenomen, intermediair tussen de hybride en klassieke toestanden. Het bestuderen van dynamische moleculaire processen met snelheden en concentraties vergelijkbaar met die in de cel is belangrijk, maar blijft een technische uitdaging.

Een strategie om de fluorescerende substraatconcentratie te verhogen is het gebruik van op metaal gebaseerde, sub-zichtbare golflengteopeningen, zero mode waveguides (ZMWs) genoemd, om beperkte excitatievelden te genereren die selectief biomoleculen genereren die zijn gelokaliseerd in de openingen16 (Figuur 1). De openingen hebben doorgaans een diameter van 100−200 nm en een diepte van 100−150 nm17. Boven een cutoff golflengte gerelateerd aan de grootte en vorm van de putten (λc ≈ 2,3 keer de diameter voor cirkelvormige golfgeleiders met water als het diëlektrische medium18), zijn geen voortplantingsmodi toegestaan in de golfgeleider, vandaar de term zero mode waveguides. Echter, een oscillerend elektromagnetisch veld, een evanescente golf genoemd, exponentieel rottend in intensiteit nog steeds tunnels een korte afstand in de golfgeleider18,19. Hoewel vergelijkbaar met TIR evanescente golven, ZMW evanescent golven hebben een kortere verval constante, wat resulteert in 10−30 nm effectieve excitatie regio binnen de waveguide. Bij micromolarconcentraties van fluorescerend gelabelde liganden zijn slechts één of enkele moleculen tegelijkertijd aanwezig in het excitatiegebied. Deze beperking van het excitatievolume en de daaruit voortvloeiende vermindering van achtergrondfluorescentie maakt fluorescentiebeeldvorming van afzonderlijke moleculen in biologisch relevante concentraties mogelijk. Dit is toegepast op vele systemen20, met inbegrip van FCS-metingen van enkelvoudige eiwitdiffusie21, fretmetingen met één molecuul van ligand-eiwit22 met lage affiniteit en eiwit-eiwitinteracties23, en spectro-elektrochemische metingen van enkelvoudige moleculaire omzetgebeurtenissen24.

ZMW's zijn geproduceerd door een metaallaag rechtstreeks te patroonen met behulp van ionenbundelfrezen25,26 of elektronenstraallithografie (EBL), gevolgd door plasma-etsen16,27. Deze maskerloze lithografiemethoden creëren golfgeleiders in serie en vereisen meestal toegang tot gespecialiseerde nanofabrication-faciliteiten, waardoor wijdverspreide acceptatie van ZMW-technologie wordt voorkomen. Een andere methode, ultraviolet nanoimprint lithografie lift-off28, gebruikt een kwarts diavorm om een omgekeerde ZMW-sjabloon op een resist-film te drukken als een stempel. Hoewel deze methode meer gestroomlijnd is, vereist het nog steeds EBL voor de vervaardiging van de kwartsvorm. Dit artikel presenteert het protocol voor een eenvoudige en goedkope gesjabloonde fabricagemethode die geen EBL- of ionenbundelfrezen vereist en is gebaseerd op het dicht verpakken van nanobolletjes om een lithografisch masker te vormen.

Nanosfeer of "natuurlijke" lithografie, die voor het eerst werd voorgesteld in 1982 door Deckman en Dunsmuir29,30, maakt gebruik van de zelfassemblage van monodisperse colloïdale deeltjes, variërend van tientallen nanometers tot tientallen micrometers31, om sjablonen te maken voor oppervlaktepatronen via etsen en / of afzetting van materialen. De tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) uitgebreide periodieke arrays van colloïdale deeltjes, aangeduid als colloïdale kristallen, worden gekenmerkt door een heldere iridescence van verstrooiing en diffractie32. Hoewel minder veel gebruikt dan elektronenbundel of fotolithografie, is deze maskeringsmethodologie eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk verkleind om functiegroottes onder 100 nm te creëren.

Het sturen van de zelfassemblage van colloïdale deeltjes bepaalt het succes van het gebruik van colloïdale kristallen als maskers voor oppervlaktepatronen. Als de grootte en vorm van deeltjes homogeen zijn, kunnen colloïdale deeltjes gemakkelijk zelf worden geassembleerd met zeshoekige verpakking, aangedreven door entropische uitputting33. Waterverdamping na druppelcoating is een effectieve route om de colloïdale deeltjes te sedimenteren, hoewel andere methoden dipcoating34, spincoating35, elektroforetische depositie36en consolidatie op een lucht-waterinterface37omvatten . Het onderstaande protocol is gebaseerd op de verdampingssedimentatiemethode, die het eenvoudigst te implementeren was. De driehoekige interstices tussen dicht opeengepakte polystyreenparels vormen openingen om een offermetaal te vergulden en palen te vormen (figuur 2 en aanvullende figuur 1). Kort gloeien van de kralen voor deze stap past de vorm en diameter van deze palen aan. De kralen worden verwijderd, een laatste metalen laag wordt rond de palen afgezet en vervolgens worden de palen verwijderd. Nadat de twee metaaldepositiestappen op het colloïdale nanomasker, verwijdering van de tussenliggende palen en oppervlaktechemiemodificatie voor passivering en tethering, zijn ZMW-arrays klaar voor gebruik voor beeldvorming met één molecuul. Uitgebreidere karakterisering van de optische eigenschappen van ZMW na fabricage is te vinden in een begeleidend artikel38. Naast een thermische verdamper voor dampafzetting van de metalen, zijn er geen gespecialiseerde gereedschappen nodig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle stappen kunnen worden voltooid in de algemene labruimte.

1. Glasafdekkingenlipreiniging

  1. Om een schoon oppervlak voor verdampingsdepositie van colloïdale deeltjes te bieden, plaatst u 24 x 30 mm optische borosilicaatglasafdekkingslips (0,16−0,19 mm dikte) in de gegroefde inzetstukken van een koplinglas vlekpot voor reiniging.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de afdeklips rechtop staan en goed gescheiden zijn, zodat alle oppervlakken duidelijk zichtbaar zijn tijdens het reinigingsproces.
  2. Giet voldoende aceton in de kleurpot om de afdeklipjes te bedekken, plaats de hoes erop en soniceer gedurende 10 minuten bij 40 °C.
  3. Giet de aceton uit en spoel de afdeklipjes af door de kleurpot te vullen met gedestilleerd H2O en het water eruit te gieten. Herhaal dit nog 2 keer.
  4. Herhaal de aceton sonicatie (stap 1.2 en 1.3) nogmaals.
  5. Giet voldoende KOH van 200 mM in de pot om de afdeklips te bedekken en soniceer, afgedekt, gedurende 20 minuten bij 40 °C.
    OPMERKING: De KOH etst het glas lichtjes.
  6. Spoel de afdeklips 6 keer af met gedestilleerde H2O.
  7. Voeg ethanol toe om de deksels te bedekken, voeg het deksel toe en soniceer gedurende 10 minuten bij 40 °C.
  8. Spoel de afdeklips 3 keer af met gedestilleerde H2O.
  9. Pak elke afdeklip aan de rand op met een zachte tang en droog de afdeklips met N2-gas. Raak alleen de randen van de afdeklip aan. Plaats elk van de gedroogde, gereinigde afdeklipjes in een individuele schone petrischaal.

2. Verdampingsdepositie van polystyreenparels

  1. Om het colloïdale kristalmasker voor de ZMW-array te maken, centrifugeert u 50 μL met een diameter van 1 μm, niet-gefunctionaliseerde polystyreenparels (2,5% w/v in water) bij 15.000 x g, 25 °C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Voordat u de kralen pijpt, moet de voorraadoplossing kort worden gekroond voor het geval de kralen zich op de bodem van de fles hebben gevestigd.
  2. Gooi het supernatant weg en laat zo min mogelijk water over.
    OPMERKING: Restwater kan de verdampingseigenschappen van de ethanolresuspensieveranderen 39, dus het verwijderen van een kleine hoeveelheid kralen om al het water te verwijderen is acceptabel.
  3. Resuspend de kralen van stap 2.2 in 50 μL van 1:400 TritonX-100:ethanol oplosmiddel. Pipetteer meerdere keren op en neer om de kralen grondig te mengen met het oplosmiddel.
    OPMERKING: TritonX-100:ethanol oplosmiddel moet na gebruik worden verzegeld met paraffinefolie en eenmaal per maand vers worden bereid. De kralen hebben de neiging om zich te hechten aan de zijkanten van een plastic vat, zoals een microcentrifugebuis, dus pipet langs de zijkanten om ervoor te zorgen dat alle kralen worden geresuspendeerd.
  4. Om een vochtigheidskamer voor afzetting op te zetten, plaatst u 6 Petrischalen, elk met één afdeklip, op een bank in een lijn met deksels die iets op een kier staan. Verplaats in elke schaal de afdeklip naar het open gebied, zodat de afdeklips worden blootgesteld aan de omgeving wanneer de luchtvochtigheid in de volgende stap wordt verhoogd.
  5. Plaats een hygrometer en een kleine elektrische ventilator gecentreerd achter de Petrischalen.
  6. Noteer de relatieve aanvangsvochtigheid (RH) in het lab. Vul een bekerglas van 200 ml met 150−200 ml ~75 °C water en plaats het achter de ventilator.
  7. Zet de ventilator aan en bedek de Petrischalen, ventilator, beker en hygrometer met een omgedraaide, transparante plastic opslagcontainer (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Laat de RV in de kamer stijgen tot 70−75%, wat meestal 5−10 min duurt.
    OPMERKING: Als de rv van het omgevingslaboratorium laag is (minder dan ~ 50%), laat de kamer dan een hogere RV bereiken, maar niet hoger dan 80%, om vochtverlies tijdens depositie te compenseren (zie hieronder).
  9. Wanneer de RH 70−75% bereikt, registreert u de RH en tilt u de plastic opslagcontainer iets op om snel deksels op de Petrischalen te plaatsen, wat over bevochtiging van de afdeklips voorkomt.
    OPMERKING: De temperatuur in de kamer zal iets warmer zijn dan de kamertemperatuur, meestal 25−26 °C, als gevolg van bevochtiging. Als er vocht zichtbaar is op de afdeklips, dan zijn de glasoppervlakken te nat. Een commercieel handschoenenkastje kan dit deel van het protocol vereenvoudigen.
  10. Laat de RV in de kamer blijven stijgen tot 85%. Noteer op dat moment de RV in de vochtigheidskamer en pipet 5 μL van de kraalsuspensie in het midden van elke afdeklip.
  11. Sluit de kamer en Petrischalen na elke afzetting om vochtverlies te minimaliseren. Streef ernaar om alle 6 deposities binnen 2 minuten af te ronden.
  12. Noteer de RV in de kamer na de verklaring.
    OPMERKING: De RV na depositie zal helpen meten hoe snel de vochtigheid verloren is gegaan tijdens de depositie, wat afhankelijk is van de omstandigheden in het omgevingslaboratorium. Voor een typische succesvolle run begint de kamer bij 85% RV voorafgaand aan de depositie en eindigt bij 70−75% RV na de depositie.
  13. Laat de kraaldruppels zich verspreiden en droog gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Als de colloïdale kristallen veel gaten of meerlagige gebieden hebben, was de kamer waarschijnlijk te vochtig of droog, respectievelijk. Pas de relatieve vochtigheid aan om de Petrischalen te sluiten en de afzettingen te starten (zie de resultatensectie voor verdere bespreking van optimalisatie).

3. Kraalgloeien voor het verminderen van de poriegrootte in het colloïdale kristalsjabloon

  1. Om een uniform temperatuuroppervlak te bieden voor het gloeien van de polystyreenparels, die de interparelinterstices versmaadt en de hoeken van de interstices rondt, plaatst u een vlakke, gefreesde aluminium plaat bovenop een standaard keramische kookplaat.
  2. Stel de temperatuur van de kookplaat in op 107 °C, de glasovergangstemperatuur van polystyreen40.
    OPMERKING: Om een stabiele en nauwkeurige temperatuur te verkrijgen, werd een thermokoppelsonde vastgehouden in een gat van 2−3 mm breed en 4−5 mm diep in de aluminium plaat.
  3. Plaats een afdeklip met de kraalsjabloon op de hete aluminium plaat en gloei gedurende 20 s (zie het discussiegedeelte voor uitleg over de smelttijd).
  4. Verwijder na het verwarmen de afdeklip van de aluminium plaat en plaats deze onmiddellijk op een ander aluminium oppervlak op kamertemperatuur om het te koelen.
    OPMERKING: Het is handig om de afdeklips iets over de rand van de plaat te laten hangen of ondiepe kanalen (zie de bijbehorende video) in de plaat te laten frezen om het ophalen van de afdeklips te vergemakkelijken.

4. Nanofabrication van aluminium nul wijze waveguides gebruikend het colloïdale kristalmalplaatje

  1. Met behulp van thermische of elektronenstraal verdampingsdepositie, deponeer 300 nm koper bij 2 Å/s over de colloïdale kristal sjabloon om palen te genereren in de interstices tussen de kralen.
  2. Verwijder overtollig metaal bovenop de kralen door het oppervlak voorzichtig met tape in te drukken. Schil de tape langzaam om het metaal eraf te trekken.
    OPMERKING: Na het trekken van de tape kunnen enkele kleine stukjes reflecterend overtollig metaal achterblijven en deze kunnen vaak worden verwijderd door een stroom N2-gas. Als er na het trekken van de tape aanzienlijke stukken reflecterend overtollig metaal achterblijven, probeer dan de sjablonen 2 uur in tolueen te weken om de polystyreenparels gedeeltelijk op te lossen. Was de afdeklips met gedestilleerd water, droog met N2en herhaal de tapetrek. De extra soak mag de kralen niet volledig oplossen, omdat de kralen de palen helpen beschermen tegen beschadiging tijdens het trekken van de tape.
  3. Om de polystyreen kralen op te lossen, plaatst u de kraal sjablonen in tolueen en weekt u 's nachts.
    LET OP: Tolueendampen kunnen giftig zijn. Werk met tolueen onder een goed geventileerde capuchon en draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, veiligheidsbrillen en een laboratoriumjas. Tolueen moet worden bewaard in geventileerde kasten die zijn aangewezen voor ontvlambare vloeistoffen.
  4. Spoel de sjablonen na de tolueenincubering eenmaal met chloroform en twee keer met ethanol. Hanteer op dit punt de afdeklips zorgvuldig, omdat de delicate metalen palen van 200−300 nm nu worden blootgesteld. Droog de sjablonen met N2 en verwijder restpolymeer en verontreinigingen in een zuurstofplasmareiniger gedurende 30 minuten.
    LET OP: Chloroform dampen kunnen giftig zijn. Werk met chloroform onder een goed geventileerde capuchon en draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, veiligheidsbrillen en een laboratoriumjas. Chloroform moet worden bewaard in geventileerde kasten uit de buurt van andere ontvlambare oplosmiddelen.
  5. Met behulp van thermische of elektronenstraalverdampingsdepositie 3 nm van een titanium adhesielaag bij 1 Å/s, gevolgd door 100−150 nm aluminium bij 4 Å/s rond en bovenop de koperen palen.
    OPMERKING: Men kan dikkere bekleding gebruiken om diepere geleiders en een betere demping van achtergrondfluorescentie te verkrijgen, maar dit vermindert ook de opbrengst na het blootstellen en oplossen van de palen in de volgende stap (zie het discussiegedeelte).
  6. Om de metalen palen op te lossen, weekt u de afdeklips in koperen etchant (op basis van citroenzuur; Tabel met materialen) gedurende 2 uur.
    LET OP: Metaal etchant kan brandwonden veroorzaken. Werk met etsers onder een goed geventileerde kap en draag beschermende uitrusting. Was de handen grondig na het hanteren. Metaal etchant moet worden opgeslagen in geventileerde kasten die zijn aangewezen voor corrosieve vloeistoffen.
  7. Spoel de afdekplaten af met gedestilleerd water, droog met N2en polijst het oppervlak van de metalen bekleding voorzichtig met lenspapier om eventuele palen bloot te leggen die nog bedekt zijn met bekleding. Plaats de afdeklips nog 2 uur terug in koperen ets, spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water en droog ze af met N2.
    OPMERKING: ZMW-dia's moeten worden bewaard in overdekte, schone petrischalen om ze vrij van verontreinigingen te houden.

5. Nanofabrication van gouden nul wijze waveguides gebruikend het colloïdale kristalmalplaatje

OPMERKING: De methode voor het fabriceren van gouden ZMW's (Aanvullende figuur 1), die het protocol voor het fabriceren van aluminium ZMW's weerspiegelt, wordt in deze sectie gegeven.

  1. Met behulp van thermische of elektronenstraalverdampingsdepositie 3 nm van een titanium adhesielaag bij 1 Å/s, gevolgd door 300 nm aluminium bij 4 Å/s.
  2. Verwijder overtollig metaal bovenop de kralen door het oppervlak voorzichtig met tape in te drukken. Schil de tape langzaam om het metaal eraf te trekken.
  3. Om de polystyreen kralen op te lossen, plaatst u de kraal sjablonen in tolueen en weekt u 's nachts.
  4. Spoel de sjablonen na de tolueenincubering eenmaal met chloroform en twee keer met ethanol. Droog de sjablonen met N2 en verwijder resterende polymeerverontreinigingen in een zuurstofplasmareiniger gedurende 30 minuten.
  5. Met behulp van thermische of elektronenstraal verdampingsdepositie, afzetting 100−150 nm goud bij 5 Å/s rond en bovenop de aluminium palen.
  6. Om de metalen palen op te lossen, weekt u de afdeklips in aluminium etchant (op basis van fosforzuur; Tabel met materialen) gedurende 1 uur.
  7. Spoel de afdekplaten af met gedestilleerd water, droog met N2en polijst het oppervlak van de metalen bekleding voorzichtig met lenspapier om eventuele palen bloot te leggen die nog bedekt zijn met bekleding. Plaats de afdeklips 1 uur terug in aluminium etchant, spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water en droog ze af met N2.
    OPMERKING: ZMW-dia's moeten worden bewaard in overdekte, schone petrischalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zelfassemblage van de colloïdale deeltjes van polystyreen via verdampingssedimentatie (stappen 2.1−2.13) kan een reeks resultaten opleveren, omdat het controle van de verdampingssnelheid van oplosmiddelen vereist. Omdat de afzettingen echter snel zijn (10−15 min per ronde), kan de procedure snel worden geoptimaliseerd voor verschillende omgevingslabomstandigheden. Figuur 3A toont een goed gevormd colloïdaal sjabloon na afzetting en verdamping. Macroscopisch is het gebied van kralen cirkel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor de colloïdale zelfassemblage (protocolsectie 2) versnelt het gebruik van ethanol in plaats van water als suspensie-oplosmiddel het verdampingsproces, zodat sjablonen in 2−3 min na depositie klaar zijn in plaats van 1−2 uur zoals in eerdere methoden48,49. Het hier gepresenteerde verdampingssedimentatieprotocol is ook eenvoudiger dan eerdere sedimentatieprotocollen die het regelen van de oppervlaktekanteling, temperatuur en luchtvolume boven de suspensie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01GM080376, R35GM118139 en NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 aan Y.E.G., en door een NIAID predoctorale NRSA fellowship F30AI114187 aan R.M.J.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1. Glass Coverslip Cleaning
AcetonSigma322011 L
Coplin-glas kleurvatFisher Scientific08-817Kleurvat met 8 groeven en gegoten glazen deksel
CoverslipsVWR48404-46724 mm x 30 mm (No.1½, Rechthoekig)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603Kaliumhydroxide
PetrischalenFisher ScientificR80115TS100 mm diameter, 15 mm diep
SonicatorBransonZ245143Ultrasoon tafelbladreiniger, 5510
2. Evaporatieve depositie van polystyreenkralen
Duidelijk opbergcontainerFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 inch
BureauventilatorO2CoolFD05001AElke kleine bureauventilator (~5 inch) zal werken
GlasbekerFisher Scientific02-555-25B250 ml
LuchtvochtigheidsmeterFisher Scientific11-661-19
MicrocentrifugebuizenFisher Scientific21-402-9031,5 ml
Polystyreen microsferenPolysciences18602-151,00 µm diameter, niet-gefunctionaliseerd
Triton X-100 detergensSigmaX100100 ml
3. Kralenuitharding voor het verminderen van poriegrootte in het colloïdale kristalmal
Aluminium plaatFisher ScientificAA11062RYOp maat gemaakt in-house tot 14 cm x 14 cm
Keramische hotplateFisher ScientificHP8885710013 x 8,2 x 3,8 inch
TemperatuurregelaarMcMaster-Carr38615K71Lees temperatuur met thermokoppelsonde
Thermokoppel sondeMcMaster-Carr9251T93Type K, oppervlakte sonde
4/5. Nanofabricatie van Zero Mode Waveguides met behulp van het colloïdale kristalmal
Aluminium etserTranseneType A
Aluminium pelletsKurt J. LeskerEVMAL40QXHBVoor elektronenbundel verdamping
ChloorformSigma2883061 L
Koper etserTransene49-1
Koper pelletsKurt J. LeskerEVMCU40QXQAVoor elektronenbundel verdamping
Goud pelletsKurt J. LeskerEVMAUXX40GVoor elektronenbundel verdamping
Lens papierThorlabsMC-5
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Scotch tapeStaplesMMM119
DünnschichtabscheidungssystemKurt J. LeskerPVD-75Tabelblad thermische verdampingssysteem zal ook werken
Titanium pelletsKurt J. LeskerEVMTI45QXQAVoor elektronenbundel verdamping
TolueenSigma2445111 L
Representatieve Resultaten
COMSOL Multiphysics-modelleersoftwareCOMSOL, Inc.
Dual View spectraal splitterPhotometrics, Inc.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001(2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797(2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401(2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301(2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06(2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011(2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229(2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888(2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964(2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800(2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418(2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Trefwoorden

Nanosphere lithografieCollo dale lithografieThermische verdampingsdepositieAluminium golfgeleidersKoperen pilarenAtoomkrachtmicroscopieSingle molecule FRETVochtkamer

Gerelateerde artikelen