Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het bestrijden van menselijke neurodegeneratieve pathologieën en het beheren van hun alomtegenwoordige sociaal-economische impact wordt een wereldwijde prioriteit. Ondanks hun schadelijke effecten op de kwaliteit van het menselijk leven en de gezondheidszorg, de meerderheid van de menselijke neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds ongeneeslijk en niet te voorkomen. Daarom wordt de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies tegen dergelijke kwalen een dringende urgentie. Leeftijd-geassocieerde verslechtering van neuronale circuits en functie is evolutionair bewaard in organismen zo divers als de nederige worm Caenorhabditis elegans en mensen, wat gelijkenissen in de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen. C. elegans is een zeer kneedbaar genetisch model, dat een goed gekarakteriseerd zenuwstelsel, lichaamstransparantie en een divers repertoire van genetische en beeldvormingstechnieken biedt om neuronale activiteit en kwaliteitscontrole tijdens veroudering te beoordelen. Hier introduceren en beschrijven we methodologieën met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose (bijvoorbeeld deg-3(d) en mec-4(d)) en eiwitaggregaat (bijvoorbeeld α-syuncleine en poly-glutamaat)-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neuronale afbraak te monitoren en te ontleden. Een combinatie van deze dierlijke neurodegeneratiemodellen, samen met genetische en farmacologische schermen voor celdoodmodulators zal leiden tot een ongekend begrip van leeftijdsgebonden afbraak van neuronale functie en zal kritische inzichten opleveren die een brede relevantie hebben voor de menselijke gezondheid en kwaliteit van leven.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia is C. elegans op grote schaal gebruikt als een modelorganisme om de moleculaire mechanismen van necrotische celdood te onderzoeken. C. elegans biedt een uitzonderlijk goed gekarakteriseerd en in kaart gebracht zenuwstelsel, transparante lichaamsstructuur en een divers repertoire van genetische en beeldvormingsmethoden om in vivo cellulaire functie en overleving tijdens veroudering te monitoren. Zo zijn verschillende C. elegans genetische modellen van neurodegeneratie al ontwikkeld om de levensvatbaarheid van neuronalen te beoordelen. In het bijzonder omvatten goed beschreven en gebruikte nematodemodellen de hype....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Necrotische cel dood veroorzaakt door hyperactieve ionkanalen
OPMERKING: Gain-of-function mutaties in de genfamilie van degenerins, waaronder mec-4 en deg-3 onder andere, resulteert in de generatie van hyperactieve ionkanalen die necrotische celdood veroorzaken van zes aanraakreceptorneuronen die nodig zijn voor mechanosensatie in wormen3. Necrose veroorzaakt door de afwijkende stimulatie van degenerins vertoont verschillende mechanistische en morfologische gelijkenissen met excitotoxiciteit bij zoogdieren. Het behoud van energiemetabolisme en calciumhomeostase heeft een cruciale rol op neuronale o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Necrotische cel dood-geïnduceerd door hyperactieve ionkanalen
Aan de hand van de hier gepresenteerde procedures werden de mec-4(u231) en deg-3u662) gemuteerde embryo's 25 minuten lang geïncubeerd bij 34 °C of bij de standaardtemperatuur van 20 °C gehouden. Bij het uitkomen werd het aantal neuronale cellijken bepaald in het larvale stadium van L1 van beide groepen. Necrotische celdood is verminderd in aaltjes die zijn ontstaan uit warmteschokvoorwaarde eieren(figu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden voor groei, synchronisatie en microscopisch onderzoek van enkele veelzijdige C. elegans-modellen die leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie onderzoeken. In het bijzonder beoordelen en ontleden we de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgebonden neuronale afbraak met behulp van hypergeactiveerde ionenkanaal-geïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit1,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video's. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma's van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Houd dieren op 20 °C | |
| DIC-microscoop (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissectie stereomicroscoop | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescentiemicroscoop | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50-stam | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner petrischalen (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Beeldanalysesoftware | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesiumsulfaat (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Houd dieren op 20 °C | |
| Microscoopglaasjes (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscoopglaasjes (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel-softwarepakket | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematodengroeimedium (NGM) agarplaten | |||
| Nystatine-voorraadoplossing | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Pepton | BD, Bacto | 211677 | |
| Fosfaatbuffer | |||
| Natriumchloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standaardapparatuur voor het bereiden van agarplaten (autoclaaf, petrischalen, etc.) | |||
| Standaardapparatuur voor het onderhouden van wormen (platinadraad pincet, incubators, etc.) | |||
| Statistische analysesoftware | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism softwarepakket | |
| Streptomycine | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisoolhydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Op aanvraag: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
Referenties
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
