Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het bestrijden van menselijke neurodegeneratieve pathologieën en het beheren van hun alomtegenwoordige sociaal-economische impact wordt een wereldwijde prioriteit. Ondanks hun schadelijke effecten op de kwaliteit van het menselijk leven en de gezondheidszorg, de meerderheid van de menselijke neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds ongeneeslijk en niet te voorkomen. Daarom wordt de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies tegen dergelijke kwalen een dringende urgentie. Leeftijd-geassocieerde verslechtering van neuronale circuits en functie is evolutionair bewaard in organismen zo divers als de nederige worm Caenorhabditis elegans en mensen, wat gelijkenissen in de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen. C. elegans is een zeer kneedbaar genetisch model, dat een goed gekarakteriseerd zenuwstelsel, lichaamstransparantie en een divers repertoire van genetische en beeldvormingstechnieken biedt om neuronale activiteit en kwaliteitscontrole tijdens veroudering te beoordelen. Hier introduceren en beschrijven we methodologieën met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose (bijvoorbeeld deg-3(d) en mec-4(d)) en eiwitaggregaat (bijvoorbeeld α-syuncleine en poly-glutamaat)-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neuronale afbraak te monitoren en te ontleden. Een combinatie van deze dierlijke neurodegeneratiemodellen, samen met genetische en farmacologische schermen voor celdoodmodulators zal leiden tot een ongekend begrip van leeftijdsgebonden afbraak van neuronale functie en zal kritische inzichten opleveren die een brede relevantie hebben voor de menselijke gezondheid en kwaliteit van leven.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia is C. elegans op grote schaal gebruikt als een modelorganisme om de moleculaire mechanismen van necrotische celdood te onderzoeken. C. elegans biedt een uitzonderlijk goed gekarakteriseerd en in kaart gebracht zenuwstelsel, transparante lichaamsstructuur en een divers repertoire van genetische en beeldvormingsmethoden om in vivo cellulaire functie en overleving tijdens veroudering te monitoren. Zo zijn verschillende C. elegans genetische modellen van neurodegeneratie al ontwikkeld om de levensvatbaarheid van neuronalen te beoordelen. In het bijzonder omvatten goed beschreven en gebruikte nematodemodellen de hyperactieve ionenkanaalgeïnduceerde necrose1,,2,3 en celdood veroorzaakt door verhoogde eiwitaggregatatie4,,5,,6,7,,8,,9,10 en hitteberoerte11,12,onder anderen.
Blootstelling op korte termijn aan onder dodelijke temperaturen verleende weerstand tegen necrotische celdood, veroorzaakt door een daaropvolgende hittestress, zowel bij aaltjes als zoogdierneuronen11. Interessant is dat de dagelijkse conditionering van aaltjes bij een milde verhoogde temperatuur beschermt tegen neurodegeneratie, die wordt toegebracht door diverse stimuli, zoals ionische onbalans (bijvoorbeeld mec-4(u231) en/of deg-3(u662)) en eiwitaggregatie (bijvoorbeeld α-synuclein en polyQ40)11,13.
Hier beschrijven we veelzijdige methodologieën met behulp van C. elegans om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie te monitoren en te evalueren in gevestigde modellen van menselijke ziekten, zoals excitotoxiciteit-geactiveerde celdood, Parkinson en de ZvH. Bovendien onderstrepen we de neuroprotectieve rol van warmteconditionering in verschillende modellen van neurodegeneratie. Een combinatie van deze technieken in combinatie met genetische en/of farmacologische schermen zal resulteren in de identificatie en karakterisering van nieuwe celdoodmodulatoren, met potentieel therapeutisch belang.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Necrotische cel dood veroorzaakt door hyperactieve ionkanalen
OPMERKING: Gain-of-function mutaties in de genfamilie van degenerins, waaronder mec-4 en deg-3 onder andere, resulteert in de generatie van hyperactieve ionkanalen die necrotische celdood veroorzaken van zes aanraakreceptorneuronen die nodig zijn voor mechanosensatie in wormen3. Necrose veroorzaakt door de afwijkende stimulatie van degenerins vertoont verschillende mechanistische en morfologische gelijkenissen met excitotoxiciteit bij zoogdieren. Het behoud van energiemetabolisme en calciumhomeostase heeft een cruciale rol op neuronale overleving tijdens necrose11. De volgende stammen kunnen worden gebruikt om necrotische celdood te controleren die wordt veroorzaakt door hyperactieve ionenkanalen, mec-4(u231)X en deg-3(u662)V.
- Onderhoud, synchronisatie en bereiding van gemuteerde wormen voor onderzoek van necrotische celdood
- Dag 1: Pluk L4 larven van mec-4(u231) of deg-3(u662) mutantaaltjes op Nematode Growth Media (NGM; Tabel 1) platen gezaaid met Escherichia coli (OP50) met behulp van een ontleden stereomicroscoop.
- Plaats 10 L4-aaltjes per ingezaaide NGM-plaat en laat ze groeien bij de standaardtemperatuur van 20 °C.
- Dag 5: Was de platen met 1 mL M9 buffer (Tabel 1) en verzamel de dieren in een 1,5 mL buis.
- Centrifuge op 10.000 x g voor 30 s en verwijder de supernatant.
- Voeg 0,5 mL bleekoplossing toe (7 mL van H2O, 1 mL van 5 N NaOH en 2 mL bleekmiddel).
OPMERKING: Bleekoplossing verliest geleidelijk zijn efficiëntie; daarom moet het dagelijks worden voorbereid. - Vortex en periodiek controleren totdat de wormen zijn opgelost.
OPMERKING: Vermijd bleken voor perioden langer dan 5 minuten, omdat de levensvatbaarheid van de embryo's zal worden beïnvloed. - Centrifuge op 10.000 x g voor 30 s en verwijder de supernatant.
- Was twee maal de pellet (eieren) met 1 mL M9 buffer.
- Na het wassen de eieren opnieuw opsuspen in een buffer van 200 μL M9 en ze gedurende 25 minuten bij 34 °C in een waterbad uitbroeden.
- Houd een afzonderlijke groep controlemonster (eieren) op 20 °C.
- Pipette 100 μL controle of warmteschok behandelde eieren en leg ze op ongeplaatste NGM-platen. Elke plaat bevat ten minste 100-200 eieren.
- De eieren tot het uitkomen geïncubeerd bij 20 °C.
- Montage van L1 larven voor onderzoek met behulp van differentiële interferentie contrast (DIC; Nomarsky) microscopie
- Bereid 2% agarose pads.
- Gebruik 1 mL M9 buffer om de platen te wassen en L1 larven aaltjes te verzamelen in 1,5 mL buizen.
- Centrifuge op 10.000 x g voor 30 s.
- Verwijder de supernatant en houd de pellet (aaltjes).
- Voeg 100 μL van 20 mM M9/levamisole buffer toe om de aaltjes te verdoven.
LET OP: Vermijd natriumazijn als verdoving. Natrium azide triggers mitochondriale schade en oxidatieve stress leidt uiteindelijk tot cel dood inductie - Pipette 10 μL M9/levamisole buffer met L1 wormen en monteer ze op 2% agarose pads (Tabel 1).
- Plaats voorzichtig een coverlip op de bovenkant van het monster.
LET OP: Verzegel de coverslip met nagellak om de vochtigheid tijdens het beeldvormingsproces te behouden. - Observeer wormen met behulp van differentiële interferentie contrast (DIC; Nomarsky) microscopie.
- Score neurodegeneratie van de zes touch receptor neuronen door het tellen van cellen met de karakteristieke vacuolated verschijning per nematode.
2. Eiwitaggregaat-geïnduceerde neurodegeneratie
OPMERKING: De volgende stammen kunnen worden gebruikt om eiwitaggregaten-geïnduceerde neurotoxiciteit te onderzoeken: (A) overexpressie van menselijke α-synuclein in dopaminerge neuronen, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] en (B) overexpressie van menselijk polyglutamine eiwit (PolyQ) pan-neuronaal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Onderhoud, synchronisatie en bereiding van transgene aaltjes voor neurodegeneratietest
- Gebruik een ontleden stereomicroscoop om C. elegans ontwikkeling en groei te controleren.
- Dag 1: Synchroniseer de populatie transgene nematoden door 15-20 L4 larven van elke stam op vers OP50-gezaaide NGM-platen te plukken en over te brengen.
LET OP: Gebruik ten minste drie platen van elke stam per voorwaarde. - Uitbroeden en laat de aaltjes groeien bij de standaardtemperatuur van 20 °C.
- Dag 2: Voer de dagelijkse conditionering gedurende 30 minuten uit door de platen over te brengen in een couveuseset op 34 °C. Breng vervolgens de geconditioneerde aaltjes terug bij de standaardtemperatuur van 20 °C.
OPMERKING: Verschillende genetische achtergronden kunnen gevoelig zijn voor hoge temperaturen voor langdurige blootstelling. - (A) Bij het onderzoeken van overexpressie van menselijke α-synuclein in dopaminerge neuronen, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: op dag 9, monitor 7-dagen-oude transgene nematoden voor dopaminerge neuronale celdood.
- (B) Bij het onderzoeken van overexpressie van menselijk polyglutamine-eiwit (PolyQ) pan-neuronaal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: meet op dag 5 neuronale PolyQ-aggregaten in het hoofdgebied van 4 dagen oude transgene dieren die Q40::YFP uitdrukken.
- Montage van de monsters voor microscopisch onderzoek
- Bereid 2% agarose pads(tabel 1).
- Voeg 10 μL van 20 mM M9/levamisole buffer drop toe in het midden van het agarose pad.
- Kies de respectievelijke transgene aaltjes en breng ze over in een M9/levamisoledrop.
LET OP: Plaats 20-30 aaltjes per druppel. - Plaats voorzichtig een coverslip op de bovenkant van het monster.
LET OP: Verzegel de coverslip met nagellak om de vochtigheid tijdens het beeldvormingsproces te behouden. - Ga over tot microscopisch onderzoek van de respectieve monsters.
- Acquisitieproces en data-analyse van transgene aaltjes co-uitdrukken α-synuclein en cytosolische GFP in dopaminerge neuronen
- Gebruik een epifluorescentiemicroscoop in combinatie met een camera (bijvoorbeeld EVOS FL Auto 2).
- Detecteren en vastleggen z-stack beelden van het hoofdgebied op 20x vergroting.
- Sla de maximale intensiteitsprojectiebeelden op en verzamel deze.
- Ga naar de analyse van de verkregen beelden.
- Onderzoek de transgene wormen op neurodegeneratie door het scoren van de volgende cellulaire kenmerken, i) verlies van fluorescentie van neuronen uitdrukken GFP onder de promotor van dat-1, (ii) neuronen tonen soma en / of axale blebbing, uitwassen of dendritisch verlies.
- Importeer en analyseer de gegevens met behulp van een softwarepakket (bijvoorbeeld Excel).
3. Acquisitieproces en data-analyse van transgene aaltjes die pan-neuronaal PolyQ40 uitdrukken, gefuseerd met YFP
- Gebruik een epifluorescentiemicroscoop in combinatie met een camera (bijvoorbeeld EVOS FL Auto 2).
- Detecteren en vastleggen z-stack beelden van het hoofdgebied op 20x vergroting.
- Sla de maximale intensiteitsprojectiebeelden op en verzamel deze.
- Ga naar de analyse van de verworven beelden met behulp van Fiji-software.
- Open beelden met Fiji-programma14.
- Selecteer De opdracht Kanalen splitsen via het vervolgkeuzemenu Afbeelding en Kleur.
OPMERKING: Houd de afbeelding van het groene kanaal. - Gebruik het gereedschap uit de vrije hand om handmatig het fluorescerende interessegebied in te stellen (ROI; bijvoorbeeld kop).
- Voeg de bijbehorende ROI toe in ROI Manager via het vervolgkeuzemenu Analyseren en Extra's.
- Trek de achtergrond af op 50% door Proces en Achtergrond af te trekken.
- Drempelwaarden instellen en toepassen via de menuopdrachtAfbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Bewaar en stel dezelfde drempelwaarden in tijdens de beeldanalyse van het hele experiment.
- Selecteer de respectievelijke ROI in de ROI Manager.
- Analyseer het aantal eiwitaggregaten met behulp van de menuopdracht Deeltjes analyseren en analyseren.
- Herhaal stap 3.5-3.12 voor elke verkregen afbeelding.
- Kopieer de weergavewaarden uit het venster Afzonderlijke resultaten.
- Plak/importeer en analyseer de resultaten met behulp van een softwarepakket.
4. Statistische analyse van het rapport
- Gebruik ten minste 30 aaltjes voor elke experimentele aandoening. Voer drie biologische replica's uit.
- Gebruik statistische analysesoftware om de student t-test(vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) uit te voeren voor statistische analyse met p < 0,05 als significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Necrotische cel dood-geïnduceerd door hyperactieve ionkanalen
Aan de hand van de hier gepresenteerde procedures werden de mec-4(u231) en deg-3u662) gemuteerde embryo's 25 minuten lang geïncubeerd bij 34 °C of bij de standaardtemperatuur van 20 °C gehouden. Bij het uitkomen werd het aantal neuronale cellijken bepaald in het larvale stadium van L1 van beide groepen. Necrotische celdood is verminderd in aaltjes die zijn ontstaan uit warmteschokvoorwaarde eieren(figu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden voor groei, synchronisatie en microscopisch onderzoek van enkele veelzijdige C. elegans-modellen die leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie onderzoeken. In het bijzonder beoordelen en ontleden we de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgebonden neuronale afbraak met behulp van hypergeactiveerde ionenkanaal-geïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit1,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken Chaniotakis M. en Kounakis K. voor het opnemen en bewerken van video's. K.P. wordt gefinancierd met een subsidie van de Helleense Stichting voor Onderzoek en Innovatie (HFRI) en het Secretariaat-generaal voor Onderzoek en Technologie (GSRT). N.T. wordt gefinancierd door subsidies van de Europese Onderzoeksraad (ERC – GA695190 – MANNA), de kaderprogramma's van de Europese Commissie en het Griekse ministerie van Onderwijs.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Houd dieren op 20 °C | |
| DIC-microscoop (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissectie stereomicroscoop | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescentiemicroscoop | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50-stam | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner petrischalen (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Beeldanalysesoftware | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesiumsulfaat (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Houd dieren op 20 °C | |
| Microscoopglaasjes (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscoopglaasjes (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel-softwarepakket | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematodengroeimedium (NGM) agarplaten | |||
| Nystatine-voorraadoplossing | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Pepton | BD, Bacto | 211677 | |
| Fosfaatbuffer | |||
| Natriumchloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standaardapparatuur voor het bereiden van agarplaten (autoclaaf, petrischalen, etc.) | |||
| Standaardapparatuur voor het onderhouden van wormen (platinadraad pincet, incubators, etc.) | |||
| Statistische analysesoftware | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism softwarepakket | |
| Streptomycine | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisoolhydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Op aanvraag: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
Referenties
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
