Methodenartikel

Acclimatisatie voorafgaand aan een intraperitoneale insulinetolerantietest om door stress veroorzaakte hyperglykemie bij bewuste muizen te verminderen

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61179

⸱

22 mei 2020

 ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

Door stress veroorzaakte verhogingen van de glucosespiegels kunnen de interpretatie van gegevens die zijn afgeleid van een bewuste intraperitoneale insulinetolerantietest bij muizen verwarren. In dit artikel beschrijven we een methode om de muizen te laten wennen aan hantering, injecties en bloedafname voorafgaand aan het uitvoeren van de insulinetolerantietest om door stress veroorzaakte hyperglykemie te beperken.

Samenvatting

De insulinetolerantietest wordt vaak gebruikt in metabole onderzoeken om de insulinegevoeligheid van het hele lichaam bij knaagdieren te beoordelen. Het is een relatief eenvoudige test waarbij de bloedglucosespiegel in de loop van de tijd wordt gemeten na een enkele intraperitoneale injectie van insuline. Aangezien het in bewuste toestand wordt uitgevoerd en bloed vaak wordt verzameld via een staartknip, heeft het de potentie om een stressreactie bij dieren op te wekken als gevolg van angst in verband met hantering en bloedafname. Als zodanig kan een door stress veroorzaakte stijging van de bloedglucose optreden, waardoor het moeilijk wordt om de primaire eindpuntmeting, namelijk een insulinegemedieerde verlaging van de bloedglucose, te detecteren en te interpreteren. Dit is gezien bij veel muizenstammen en komt vrij vaak voor bij diabetische db/db-muizen, waar de glucosespiegels na insulinetoediening kunnen stijgen in plaats van dalen. Hier beschrijven we een methode om muizen te laten wennen aan hantering, injecties en bloedafname voorafgaand aan het uitvoeren van de insulinetolerantietest. We vinden dat dit door stress veroorzaakte hyperglykemie verlaagt en resulteert in gegevens die de insulinegevoeligheid van het hele lichaam nauwkeuriger weerspiegelen.

Inleiding

Metabole tests bij knaagdieren worden routinematig uitgevoerd om verschillende parameters te beoordelen die de glucosehomeostase regelen1. De gouden standaard voor het beoordelen van de insulinewerking van het hele lichaam in vivo is de hyperinsulinemische-euglycemische klem2. Deze test omvat toediening van insuline om de circulerende insulinespiegels te verhogen, terwijl glucose wordt toegediend om euglykemie op peil te houden. De glucose-infusiesnelheid die nodig is om euglykemie te behouden, is een indicatie van de insulinewerking. Hoewel het een krachtig hulpmiddel is in metabool onderzoek, is de klemtechniek bij muizen technisch uitdagend en arbeidsintensief, en daarom niet goed geschikt als eerste screeningsinstrument bij het karakteriseren van een metabool fenotype. Om deze redenen wordt vaak gekozen voor de eenvoudigere intraperitoneale insulinetolerantietest (ITT).

De ITT wordt uitgevoerd in de bewuste toestand na een vastenperiode (meestal 4-6 uur). Een bolus insuline wordt intraperitoneaal toegediend, waarna de bloedglucose wordt gecontroleerd gedurende een tijdsbestek dat gewoonlijk 60 minuten duurt. Verwacht wordt dat de bloedglucosespiegels zullen dalen als gevolg van het vermogen van insuline om de opname van glucose in insulinegevoelige weefsels te vergemakkelijken; De mate waarin dit gebeurt, is een indicatie van de insulinewerking van het hele lichaam. In sommige gevallen is aangetoond dat de glucosespiegels paradoxaal genoeg stijgen in plaats van dalen na toediening van insuline. Dit fenomeen wordt waarschijnlijk toegeschreven aan een stressreactie. Hanteren, injecties en bloedafname kunnen allemaal stress veroorzaken 3,4,5, wat resulteert in activering van de hypothalamus-hypofyse-bijnieras (HPA) en het autonome zenuwstelsel (ANS)6,7,8. Het is algemeen bekend dat zowel de HPA als het ANS bijdragen aan verhogingen van de circulerende glucosespiegels 9,10,11. De aanwezigheid van door stress geïnduceerde hyperglykemie aan het begin van een ITT is problematisch, omdat het de snelheid en omvang van de glucosedaling bij toediening van insuline verstoort12. Dit kan leiden tot verkeerde conclusies over de aanwezigheid van insulineresistentie. Om de verstorende invloed van stress op de glucosespiegels tijdens een ITT te verminderen, hebben we een methode ontwikkeld om muizen te laten wennen aan hantering, injecties en bloedafname voorafgaand aan het uitvoeren van de ITT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het VA Puget Sound Health Care System.

OPMERKING: Lokale vereisten voor monitoring en/of interventie van dieren die hypoglykemie ervaren, kunnen verschillen van de hier beschreven vereisten.

1. Vasten (t= -210 min)

  1. Nadat de donkere cyclus is afgelopen, brengt u de muizen over naar een nieuwe kooi met niet-voedzaam strooisel zoals cellulose of papieren beddengoed (geen maïskolfstrooisel, dat de metabolische eindpunten beïnvloedt als het door muizen wordt geconsumeerd13). Geef muizen ad libitum toegang tot water tijdens de vastenperiode. Wees consistent met de vastentijd van de dag en de duur van groepen muizen. Voor de getoonde gegevens werd voedsel verwijderd tussen 0700 en 0800 uur, wat 1-2 uur was nadat de donkere cyclus was geëindigd.
  2. Verplaats de kooi(en) naar de locatie waar de ITT zal worden uitgevoerd. Dit moet een rustige ruimte zijn waar stressfactoren zoals temperatuur, geluid, licht of beweging worden geminimaliseerd.

2. Acclimatisatie (t= -150 tot -60 min)

BELANGRIJK: Ga zo voorzichtig mogelijk om met muizen. Vermijd indien mogelijk het gebruik van een beveiligingssysteem.

  1. Meet bij -150 min het lichaamsgewicht. Dit wordt gebruikt voor de berekening van het volume insuline dat zal worden toegediend voor de ITT.
  2. Pak de muis voorzichtig bij de staart op en rust op een plat tafelblad terwijl u de staart nog steeds voorzichtig vastpakt. Gebruik een naald van 20 G (of een chirurgische schaar) om een kleine incisie in het puntje van de staart te maken. Een druppel bloed zou zich op de plaats moeten beginnen te vormen.
  3. Plaats de muis op een gladde, harde ondergrond en houd de muis voorzichtig bij de staart in bedwang.
    1. Om op dit moment de bloedglucose te registreren, plaatst u een druppel bloed uit de staartpunt op de teststrip van een draagbare glucometer. Masseer indien nodig heel zachtjes de staart om een druppel bloed te verkrijgen.
  4. Zuig 100 μL steriele zoutoplossing op in een insulinespuit. Pak de muis op met een zacht schrammel en injecteer intraperitoneaal. Noteer het tijdstip van injectie met zoutoplossing.
    1. Als er meerdere muizen worden bestudeerd, injecteer de muizen dan met zoutoplossing met tussenpozen van 1 minuut om tijd te geven voor de volgende stappen hieronder.
  5. 15 minuten na injectie met zoutoplossing pakt u de muis voorzichtig bij de staart op. Gebruik gaasje om eventuele bloedstolsels op de staartpunt voorzichtig los te maken.
    1. Optioneel: Registreer de bloedglucose op dit moment opnieuw zoals beschreven in stap 2.3.
  6. 30 minuten na de injectie met zoutoplossing pak de muis voorzichtig bij de staart op. Laat desgewenst nog een bloedglucosemeting uitvoeren zoals beschreven in stap 2.3.
  7. Zet de muis terug in de kooi en herhaal indien nodig voor andere muizen. Laat muizen ongemoeid tot -90 min.
  8. Herhaal bij -90 minuten de stappen 2.3 tot en met 2.6, inclusief het meten van de bloedglucosewaarden indien gewenst.
  9. Breng de muis terug naar de kooi, herhaal indien nodig voor andere muizen. Laat muizen met rust tot de ITT (waarvoor de basislijn bloedglucosemeting wordt gedaan op -5 min).

3. Insulinetolerantietest (t= -5 tot +60 min)

  1. Bereid een werkoplossing van gewone insuline (VOORZICHTIG) in steriele zoutoplossing, zodat de gewenste dosis kan worden geïnjecteerd met een lichaamsgewicht van 4 μl/g.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van insuline, aangezien onbedoelde injectie kan leiden tot hypoglykemie.
  2. Bereid een dextrose-oplossing van 25% (v/v) in steriele zoutoplossing om bij de hand te hebben voor het geval muizen hypoglykemie ontwikkelen die interventie vereist.
  3. Pak de muis bij -5 minuten voorzichtig bij de staart op. Bepaal de basislijn van de bloedglucosespiegel op dit moment door een druppel bloed uit de staartpunt op de teststrip van een draagbare glucometer te plaatsen. Masseer indien nodig heel zachtjes de staart om een druppel bloed te verkrijgen.
  4. Zuig de insulinewerkoplossing op in een insulinespuit (4 μl/g lichaamsgewicht, voor een typisch dosisbereik van 0,5-2,0 E/kg). Pak de muis op met een zacht schrammel en injecteer intraperitoneaal. Registreertijd van insuline-injectie.
    1. Als er meerdere muizen worden bestudeerd, injecteer de muizen dan met insuline met tussenpozen van 1 minuut om tijd te geven voor de daaropvolgende bloedafname en gegevensregistratie hieronder.
  5. 15 minuten na insuline-injectie pakt u de muis voorzichtig bij de staart op. Gebruik gaasje om eventuele bloedstolsels op de staartpunt voorzichtig los te maken. Bepaal de bloedglucose op dit moment opnieuw zoals beschreven in stap 3.3.
  6. Breng de muis terug naar de kooi en controleer op tekenen van hypoglykemie (bijv. overmatige lethargie). Als muizen symptomen van hypoglykemie ontwikkelen, meet dan de bloedglucose zoals beschreven in stap 5 en dien indien nodig dextrose toe. Een muis die een dextrose-interventie ondergaat, zou op dit moment uit het ITT-protocol worden verwijderd.
  7. Herhaal stap 3.5 en 3.6 30 minuten na insuline-injectie.
  8. Herhaal stap 3.5 en 3.6 45 minuten na insuline-injectie.
  9. Herhaal stap 3.5 en 3.6 60 minuten na insuline-injectie.
  10. Breng de muizen terug naar hun thuiskooi, met een paar voedselpellets op de bodem van de kooi om te helpen bij het herstel van de ITT. Blijf gedurende 30 minuten controleren en als de muizen hun normale activiteit/gedrag niet hebben herwonnen, volg dan de procedure beschreven in stap 3.6.
    OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van de bovenstaande acclimatiserings- en ITT-procedure.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2A en Figuur 3A zijn representatieve gegevens (respectievelijk individuele en gemiddelde gegevens) die een paradoxale stijging van de bloedglucosespiegels laten zien bij diabetische db/db-muizen in de 15 minuten na toediening van insuline, consistent met door stress geïnduceerde hyperglykemie. Let op, er was geen stijging van de bloedglucose zichtbaar bij de controle niet-diabetische nestgenoten (db/+ of +/+) die dezelfde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hyperinsulinemische-euglycemische klem wordt beschouwd als de gouden standaard voor het beoordelen van de insulinewerking in vivo. Wijzigingen in de methodologie voor het uitvoeren van de klem hebben ertoe geleid dat de techniek wordt uitgevoerd bij bewuste, ongeremde muizen2 die eerder zijn gekatheteriseerd met behulp van een systeem met twee katheters14 om bloedafname via de halsslagader en infusies via de halsader mogelijk te maken. D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie P30 DK-017047 (University of Washington Diabetes Research Center, Cell Function Analysis Core) en het Amerikaanse Department of Veterans Affairs, VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). De inhoud van dit manuscript vertegenwoordigt niet de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Veteranenzaken of de regering van de Verenigde Staten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dextrose-50Pfizer Injectables00409-6648-16Te gebruiken als de muis hypoglykemie ervaart.
Gaas kussentjesFisher Scientific22037907Om een bloedstolsel op de staartpunt te verwijderen.
GlucometerAccu-ChekM001_usOm bloedglucose te meten.
Gram schaalOm lichaamsgewicht te meten.
Insulin (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11Voor injectie.
Insuline spuitenVWRBD-329461Voor injecties.
Minuut timer
Steriel 20 G naaldVWRBD-305175Voor staartsnede.
Steriele zoutoplossingLifeshield1261699Voor injecties.
Chirurgische schaarFine Science Tools14088-10Voor staartsnede.
Test stripsAccu-Chek06908217001_usOm bloedglucose te meten.

Referenties

  1. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  2. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
  3. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
  4. Tabata, H., Kitamura, T., Nagamatsu, N. Comparison of effects of restraint, cage transportation, anaesthesia and repeated bleeding on plasma glucose levels between mice and rats. Lab Animal. 32 (2), 143-148 (1998).
  5. Olfe, J., Domanska, G., Schuett, C., Kiank, C. Different stress-related phenotypes of BALB/c mice from in-house or vendor: alterations of the sympathetic and HPA axis responsiveness. BMC Physiology. 10, 2(2010).
  6. Ghalami, J., Zardooz, H., Rostamkhani, F., Farrokhi, B., Hedayati, M. Glucose-stimulated insulin secretion: Effects of high-fat diet and acute stress. Journal of Endocrinological Investigation. 36 (10), 835-842 (2013).
  7. Thorens, B. Brain glucose sensing and neural regulation of insulin and glucagon secretion. Diabetes, Obesity and Metabolism. 13, Suppl 1 82-88 (2011).
  8. Pekow, C. Defining, measuring, and interpreting stress in laboratory animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 41-45 (2005).
  9. Chan, O., Inouye, K., Riddell, M. C., Vranic, M., Matthews, S. G. Diabetes and the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis. Minerva Endocrinol. 28 (2), 87-102 (2003).
  10. Rosmond, R. Role of stress in the pathogenesis of the metabolic syndrome. Psychoneuroendocrinology. 30 (1), 1-10 (2005).
  11. Nonogaki, K. New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia. 43 (5), 533-549 (2000).
  12. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
  13. Zahorsky-Reeves, J., LW, C. Housing mice on corncob bedding versus hardwood chip may confound research models. American Association for Laboratory Animal Science. , AALAS Scientific Session (10 October) (2010).
  14. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. Journal of Biological Chemistry. 272 (36), 22570-22575 (1997).
  15. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  16. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  17. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  18. Barrett, A. M., Stockham, M. A. The effect of housing conditions and simple experimental procedures upon the corticosterone level in the plasma of rats. Journal of Endocrinology. 26, 97-105 (1963).
  19. Heinrichs, S. C. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 34 (5), 808-815 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

acclimatisatie van muizenintraperitoneale injectiebloedglucosemetingstaartknipmonsteringtesten van bewuste muizeninsulinegevoeligheid van het gehele lichaamaanpassing aan hanteringdb db muismodel
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen