Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61180

⸱

18 juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In dit artikel

Samenvatting

Extracellulair DNA (ecDNA) dat vrijkomt bij de celdood is pro-inflammatorium en draagt bij aan ontsteking. Meting van ecDNA op de plaats van letsel kan de werkzaamheid van therapeutische behandeling in het doelorgaan bepalen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een machine learning tool om de meting van ecDNA in nierweefsel te automatiseren.

Samenvatting

Glomerulaire celdood is een pathologisch kenmerk van myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV). Extracellulair deoxyribonucleïnezuur (ecDNA) komt vrij tijdens verschillende vormen van celdood, waaronder apoptose, necrose, necroptose, neutrofiele extracellulaire vallen (NETs' s) en pyroptose. Meting van deze celdood is tijdrovend met verschillende biomarkers die nodig zijn om de verschillende biochemische vormen van celdood te identificeren. Meting van ecDNA wordt over het algemeen uitgevoerd in serum en urine als surrogaat voor nierschade, niet in het eigenlijke doelorgaan waar de pathologische schade optreedt. De huidige moeilijkheid bij het onderzoeken van ecDNA in de nier is het gebrek aan methoden voor formaline vast paraffine embedded weefsel (FFPE) zowel experimenteel als in gearchiveerde menselijke nierbiopten. Dit protocol biedt een samenvatting van de stappen die nodig zijn om te vlekken voor ecDNA in FFPE weefsel (zowel menselijke als murine), blus autofluorescentie en meet de ecDNA in de resulterende beelden met behulp van een machine learning tool van de openbaar beschikbare open source ImageJ plugin trainable Weka segmentatie. Trainable Weka segmentatie wordt toegepast op ecDNA binnen de glomeruli waar het programma leert om ecDNA te classificeren. Deze classificatie wordt toegepast op latere verworven nierbeelden, waardoor de noodzaak van handmatige annotaties van elke afzonderlijke afbeelding wordt verminderd. Het aanpassingsvermogen van de trainbare Weka-segmentatie wordt verder aangetoond in nierweefsel van experimentele murineanti-MPO glomerulonephritis (GN), om NET's en ecMPO, gemeenschappelijke pathologische bijdragen aan anti-MPO GN te identificeren. Deze methode biedt objectieve analyse van ecDNA in nierweefsel dat duidelijk de werkzaamheid aantoont waarin het trainbare Weka-segmentatieprogramma ecDNA kan onderscheiden tussen gezond normaal nierweefsel en ziek nierweefsel. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om ecDNA, NETs en ecMPO in andere organen te identificeren.

Inleiding

Myeloperoxidase anti neutrofiele cytoplasmatische antilichaam geassocieerd vasculitis (MPO-AAV) is een auto-immuunziekte die resulteert in nierfalen van pathologische glomerulaire letsel met aanzienlijke celdood en het vrijkomen van deoxyribonucleic zuur (DNA)1,2. DNA kan het immuunsysteem activeren door op te treden als een gevaarssignaal. Onder normale gezonde omstandigheden biedt de nucleaire locatie van DNA bescherming tegen blootstelling aan het immuunsysteem. Zelf-DNA dat extracellulair vrijkomt tijdens pathogene processen of auto-immuniteit wordt door het immuunsysteem gezien als een krachtige proinflammatoire schade geassocieerd moleculaire zelf-eiwit (DAMP)3. Extra cellulair DNA (ecDNA) wordt vrijgegeven uit stervende cellen door middel van verschillende mechanismen die worden beheerst door verschillende biochemische trajecten, zoals apoptose, necroptosis neutrofiele extracellulaire valvorming (NETs), necrose of pyroptose4,5,6,7,8.

We beschrijven hierin methoden om ecDNA vrij te geven uit stervende cellen in secties van formaline vaste paraffine embedded (FFPE) nieren van experimentele anti-MPO GN en nierbiopten van patiënten met MPO-AAV9,10. Er bestaan meerdere methoden voor de detectie van circulerend dubbelstrengs DNA (dsDNA) en DNA-complexen uit zowel serum als urine en van in vitro tests11,12. Deze methoden, hoewel nauwkeurig bij het bepalen van de hoeveelheid ecDNA, bepalen niet waar de ecDNA anatomisch wordt vrijgegeven. Er zijn methoden die specifieke meting van ecDNA beschrijven, zoals tunel voor apoptose en meting van celpuin13,14. Er is geen methode die beschrijft het meten ecDNA culmineerde uit alle vormen van celdood in FFPE nieren waar de pathologische schade optreedt. Dit is belangrijk om te bepalen of experimentele therapeutische behandelingen de ecDNA wissen van de sites van pathologische schade in het eigenlijke doelorgaan.

De verwerving van meerdere afbeeldingen van niermonsters creëert een hoog volume aan gegevens die vaak door één enkele gebruiker worden geanalyseerd. Dit is arbeidsintensief, tijdrovend en kan worden onderworpen aan onbetrouwbare reproduceerbaarheid door andere gebruikers, als gevolg van vooringenomenheid van de gebruiker. Trainable Weka-segmentatie is een open-source softwareplug-in voor imagej die geavanceerde bioinformatische tools gebruikt om pixels te classificeren met behulp van machine learning-algoritmen15,16. Deze methode is "trainable" waarbij het leert van de classificatie van segmenten pixels van de gebruiker en de nieuwe geleerde classificatie toepast op andere afbeeldingen. Deze methode is gebaseerd op algemene analysetools binnen het ImageJ-programma die worden gebruikt om elke pixel in een segment te "classificeren" als behorend tot een specifieke "klasse". Zodra het programma leert de "classificaties", kunnen ze worden gebruikt om andere soortgelijke geclassificeerde segmenten te identificeren binnen dezelfde afbeelding. Dit model wordt vervolgens opgeslagen en toegepast op andere sets afbeeldingen binnen hetzelfde experiment.

Huidige obstakels voor het bepalen van ecDNA in situ in niersecties is de endogene autofluorescentie van fixatie in formaline en de arbeidsintensieve analyse van de beelden. We beschrijven hier hoe je deze autofluorescentie doven, ecDNA detecteren en gecontroleerde machine learning gebruiken voor een hoge doorvoermeting van ecDNA. We hebben eerder de meting van NETs en extracellulaire MPO (ecMPO) gepubliceerd met behulp van een macro in ImageJ, we demonstreren nu semi-automatisering van deze methoden met behulp van supervised machine learning1. We tonen het aanpassingsvermogen van de machine learning tool, om een alternatieve vlek voor NETs en ecMPO te classificeren binnen hetzelfde beeld. Deze kleuringsmethoden die hier worden beschreven voor het opsporen van ecDNA, NETs en ecMPO kunnen worden vertaald naar andere vaste organen en ziekten waar ecDNA, NETS en ecMPO een rol spelen bij het bestendigen van ziekten zoals reumatoïde artritis en lupus17,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze methode maakt detectie van pan ecDNA van alle vormen van celdood mogelijk. Dezelfde methode en antilichamen worden gebruikt voor menselijke nierbiopsieweefsel (vanaf stap 4). Alle dierlijke en menselijke onderwerpen hadden de goedkeuring van de Ethiek van De Universiteit van Monash, en De Gezondheid van Monash, Clayton, Victoria, Australië.

1. Kleuring voor ecDNA met DAPI en β-Actin

  1. Induceer een 20-daags model van anti-myeloperoxidase glomerulonephritis (anti-MPO-GN) in 8-10 weken oude C57/Bl6 muizen, met controles9.
    1. Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van een CO2-kamer.
    2. Verwijder nieren door het maken van een voorste middellijn incisie door de huid met een schaar, en snijd vervolgens zorgvuldig snijd het buikvlies en pin terug op een dissectie bord. Met behulp van tangen opzij duwen de voorste nierfasator en pariëtale peritoneum en snijd de nier vrij door het verbreken van de urineleider en bloedvaten (nierslagader en ader) op de nierbekken. Verwijder met tangen en snijd nieren in de helft (sagittale vlak) met een maat 22 scalpel.
    3. Plaats nier in fixatief (4% gebufferd formaline) gedurende 16 uur bij kamertemperatuur (RT). Verwijder en week vaste nier in 30% ethanol gedurende 24 uur voorafgaand aan de verwerking.
  2. Verwerk nieren met behulp van een standaard cyclus van 6 uur:
    70% ethanol voor 15 min
    90% ethanol voor 15 min
    100% ethanol gedurende 15 min
    100% ethanol voor 20 min
    100% ethanol voor 25 min
    100% ethanol voor 30 min
    Xyleen voor 20 min
    Xyleen voor 30 min
    Xyleen voor 40 min
    Wax voor 30 min
    Wax voor 35 min
    Wax voor 40 min
    OPMERKING: Dit is belangrijk omdat nieren niet mogen worden blootgesteld aan langdurige blootstelling aan warmte in de was, omdat het antigenen van belang kan vernietigen.
  3. Snijd 3 μm secties op een microtome en monteer op commercieel verkrijgbare glazen microscoop dia's bedekt met een positieve lading. Laat 's nachts drogen.
  4. Doe glazen glijbanen in een schuifrek in een oven van 60 °C gedurende 60 minuten.
    LET OP: Stappen 1.3 en 1.4 zijn cruciaal om ervoor te zorgen dat secties niet wegdrijven tijdens de antigeenophaalstap.
  5. Dompel dia's onder in twee veranderingen van oplosmiddel (xyleen of substituut) gedurende 40 minuten per stuk, in een rookkap.
  6. Rehydraatglijbanen in 100% ethanol, 100% ethanol, 70% ethanol voor 5 min per stuk. Was 5 minuten in leidingwater.
  7. Plaats een kookplaat in een rookkap en preboil antigeen retrieval oplossing (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) in een snelkookpan. Zodra de antigeneraal ophaaloplossing begint te koken, plaatst u de dia's horizontaal in de pot met behulp van een tang en vergrendelt u het deksel. Kook op hoog (gelijk aan 15 psi of 103 kPa) gedurende 10 min.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang omdat het het antigeen van belang ophaalt door het antigeen epitoop (kruis gekoppeld via formaline fixatie) te ontmaskeren om epitoopantilichaam specifieke binding van de daaropvolgende kleuring zal niet werken zonder.
  8. Haal de snelkookpan van het vuur en verwijder het deksel onmiddellijk door koude tik op het deksel in een gootsteen te laten lopen. Laat dia's 20 minuten in evenwicht in de antigeen retrieval-oplossing.
  9. Was glijbanen twee maal gedurende 5 minuten in 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4) op een orbitale shaker.
  10. Gebruik een hydrofobe pen om cirkels te trekken rond het nierweefsel wordt voorzichtig niet te laten geen weefsel uitdrogen in deze tijd.
  11. Blokkeer weefsel in 10% kipsera in 5% runderserum albumine (BSA)/PBS (pH 7.4, 0.01 M) gedurende 30 min, 60 μL per sectie. Was na deze stap niet maar verwijder de blokkeringsoplossing voorzichtig met een pipet van 60 μL, laat de secties niet uitdrogen.
  12. Breng primaire antilichaamcocktail aan voor β-actine verdund 1/1000 in 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0,01 M), 60 μL per sectie en incubbate 's nachts in een vochtigheidskamer bij 4 °C.
  13. Was twee maal gedurende 5 minuten in PBS (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  14. Breng secundair antilichaam aan, kipantikonijn 488 (1/200), 60 μL per sectie verdund in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) gedurende 40 min bij RT.
  15. Was de glijbanen twee maal gedurende 5 minuten in PBS (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  16. Dompel de dia's in 0,3% Sudan Black in 70% ethanol gedurende 30 minuten in een Coplin pot.
    OPMERKING: Deze stap is belangrijk omdat het de autofluorescentie veroorzaakt door formaline fixatie dooft.
  17. Was de glijbanen in leidingwater om neerslag te verwijderen en dompel vervolgens onder in PBS (pH 7.4, 0,01 M) gedurende 10 min om verdere Soedanse zwarte neerslag te voorkomen.
  18. Monteer dia's op confocale glazen coverslips met behulp van drie 60 μL druppels montageoplossing met DAPI en verzegel de coverslips met nagellak door het aanbrengen rond de omtrek van de coverslip.
  19. Laat dia's 24 uur op RT genezen (om DAPI door te laten dringen) en sla vervolgens op bij 4 °C beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Belangrijk om in het donker te blijven om vervaging van fluorescerende sondes te voorkomen.
  20. Beelddia's met behulp van een confocale laser scanning hoofd bevestigd aan een microscoop. Excite glijdt met de 405 laser voor DAPI en de 488 Laser for Beta Actin. Leg beelden met één vlak van 1024 x 1024 pixels vast met behulp van line-sequentiële opname en 4-line gemiddelde, wat essentieel is voor het detecteren van ecDNA. 40x 1.0 NA oliedoelstelling wordt gebruikt.
    1. Afbeelding van minimaal 20 glomeruli per monster. Sla afbeeldingen op als ND2-bestanden.

2. DAPI- en β-Actin-analyse

  1. ImageJ installeren: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Controleer of de trainbare Weka-segmentatie beschikbaar is onder Plugins | Segmentatie | Trainable Weka Segmentatie.
  3. Plaats de afbeelding op de gereedschapsbalk imagej. Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Een afbeelding met DAPI in blauwe kleuring alle kernen zal verschijnen en 1 beeld met β-actine in het groen zal verschijnen, die de glomeruli afbakent.
    1. Maak een samengevoegd bestand van de afzonderlijke afbeeldingen om een regio van belang (ROI) voor de glomerulus te trekken door te klikken op Kleur | Kanalen samenvoegen. Een pop-upvak vraagt om een kleur toe te wijzen aan elk kanaal. Nadat u elk kanaal een kleur hebt toegewezen, tikt u het vak Samengesteld maken en het vak Bronafbeeldingen behouden aan en klikt u op Ok. Er verschijnt een samengevoegde samengestelde afbeelding.
    2. Met behulp van de β-actin kleuring als een gids, trek een ROI rond de glomerular bos. Houd deze afbeelding opzij om de ROI aan het einde van dit protocol te gebruiken.
  4. Voer een Gaussische onscherpte uit op de enkele blauwe DAPI-afbeelding. Klik op Proces | Filters | Gaussian Blur, zet in 1-2.00. Het beeld ziet er nu een beetje wazig uit, maar kernen zijn nu glad en de achtergrond verzacht.
    OPMERKING: Deze stap is voorgevormd om ruis te verwijderen om de afbeelding op te schonen uit artefacten die kunnen voorkomen dat relevante detectie van beeldkenmerken moet worden geanalyseerd.
  5. Klik op Plug-ins | Segmentatie | Trainable Weka Segmentatie.
  6. Met behulp van het lijngereedschap op de gereedschapsbalk in ImageJ, eerst traceren rond intacte kernen met behulp van de vrije hand tools (er zijn lijn, cirkelvormige en vierkante tool opties beschikbaar om uit te kiezen) en voeg vervolgens toe aan Klasse 1 vak toevoegen.
  7. Met het gereedschap lijn op de gereedschapsbalk in ImageJ worden achtergrondgebieden afbakend naar het vak Klasse 2.
  8. Klik op het label Nieuwe klasse maken in het weka-segmentatievenster en label 'ecDNA'. Gebruik het lijngereedschap (vanaf de gereedschapsbalk van ImageJ) om extranucleair DNA af te bakenen dat door DAPI is gekleurd.
  9. Klik op de knop Train Classifier in het trainingsmenu in het trainable Weka-segmentatievenster.
    OPMERKING: De STOP-knop wordt weergegeven in plaats van de knop Trein classificatie en blijft totdat de training is voltooid. Klik niet op deze knop tijdens de training, want het proces wordt onderbroken.
  10. Klik op De knop Resultaat maken om een afbeelding te maken met alle geclassificeerde componenten, bestaande uit intacte kernen, de achtergrond en de geïdentificeerde ecDNA.
  11. Klik op de knop Kans op kans ophalen. Schakel de muis in om een zwart-witafbeelding van alle klassen te geven met het object selectie in het wit gemarkeerd.
  12. Dupliceer deze afbeelding door op Afbeelding te klikken | Dupliceren.
  13. Schakel naar het scherm met de muisknop die de ecDNA bevat. Pas een drempel toe om alleen te krijgen wat is geïdentificeerd als ecDNA. Klik op Toepassen wanneer de drempelwaarde voldoende is.
  14. Als er na drempels meer gebieden van DNA zijn die geen ecDNA zijn, keer dan terug naar de oorspronkelijke getrainde afbeelding, voeg meer classificaties toe en herhaal stappen 2.1-2.13.
  15. Klik op Afbeelding | Afbeelding aanpassen | Maak binair. Kopieer de glomerular ROI in stap 2.3 en klik op Ctrl+Shift+E. Het Weka-venster activeren door te bewerken | Selecties | Herstellen,waardoor de selectie wordt hersteld. Klik op Deeltjes analyseren,die alleen de ecDNA-deeltjes in de glomerulus meten.
    OPMERKING: Een resultaatblad wordt berekend met het aantal deeltjes, het gebied, de gemiddeldenpixels en het percentage van de glomerulus met ecDNA. Deze resultaten kunnen worden geëxporteerd naar een spreadsheet en opgeslagen, voor latere statistische analyse.
  16. Sla de classificatie op als ecDNA.classifier door in het optiemenu op Opslaan te klikken in de ImageJ-app op het bureaublad. Klik vervolgens op Gegevens opslaan in het optiemenu en sla als ecDNA.arff op in de map ImageJ. De ROI zal moeten handmatig worden toegevoegd elke keer als glomerulus grootte en vorm zal veranderen, maar het programma heeft geleerd wat ecDNA is.
  17. Als u het model opnieuw wilt aanpassen op volgende afbeeldingen, herhaalt u stap 2.1-2.5 met een nieuwe afbeelding. Klik op Classificatie laden in het optiemenu en vervolgens op ecDNAmodel.classifier in de map ImageJ vanaf stap 2.16. Het logboekmenu verschijnt en voert het model uit.
  18. Zodra het model is uitgevoerd, klikt u op Gegevens laden in het optiemenu en selecteert u het ecDNA.arff-bestand dat vanaf stap 2.16 is opgeslagen in de map ImageJ. Klik op Resultaat maken. Als de resulterende afbeelding niet alle kernen, achtergrond of ecDNA heeft opgehaald, klikt u op de classificatie opnieuw trainen en voegt u meer classificaties toe en slaat u het nieuwe model op. Voltooi het analyseproces door stap 2.9-2.16 te herhalen.
    OPMERKING: Verschillende afbeeldingen kunnen worden gebruikt om het uiteindelijke model te genereren dat wordt gebruikt om ecDNA te detecteren. Dit wordt bereikt door het model toe te passen op volgende afbeeldingen, meer classificaties toe te voegen en het nieuwe model en de gegevens op te slaan in de ImageJ-map. Dit kan vooral belangrijk zijn wanneer verschillende monsters een hogere achtergrond hebben. Het Weka-segmentatieprogramma is ook compatibel met de macrotaal van ImageJ, waardoor veel van de opdrachten macro-opneembaar zijn om enkele stappen te automatiseren.

3. Meting van neutrofiele extracellulaire vallen en ecMPO

OPMERKING: Deze methode identificeert NETs door colocalisatie van extracellulair DNA, Citrullinated Histonen peptidyl arginase 4 (PAD4) en MPO.

  1. Induceer een 20-daags model van anti-myeloperoxidase glomerulonephritis (anti-MPO-GN) in 8-10 weken oude C57/Bl6 muizen, met controles9.
    1. Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van een CO2-kamer.
    2. Verwijder nieren door het maken van een voorste middellijn incisie door de huid met een schaar, en snijd vervolgens zorgvuldig snijd het buikvlies en pin terug op een dissectie bord. Met behulp van tangen opzij duwen de voorste nierfasator en pariëtale peritoneum en snijd de nier vrij door het verbreken van de urineleider en bloedvaten (nierslagader en ader) op de nierbekken. Verwijder met tangen en snijd nieren in de helft (sagittale vlak) met een maat 22 scalpel.
    3. Plaats nier in fixatief (4% gebufferd formaline) gedurende 16 uur bij kamertemperatuur (RT). Verwijder en week vaste nier in 30% ethanol gedurende 24 uur voorafgaand aan de verwerking.
  2. Verwerk nieren met behulp van een standaard cyclus van 6 uur:
    70% ethanol voor 15 min
    90% ethanol voor 15 min
    100% ethanol gedurende 15 min
    100% ethanol voor 20 min
    100% ethanol voor 25 min
    100% ethanol voor 30 min
    Xyleen voor 20 min
    Xyleen voor 30 min
    Xyleen voor 40 min
    Wax voor 30 min
    Wax voor 35 min
    Wax voor 40 min
    OPMERKING: Nieren mogen niet worden blootgesteld aan langdurige blootstelling aan warmte in de was, omdat het antigenen van belang kan vernietigen.
  3. Snijd 3 μm secties op een microtome en monteer op commercieel verkrijgbare glazen microscoop dia's bedekt met een positieve lading. Laat 's nachts drogen
  4. Doe glazen glijbanen in een schuifrek in een oven van 60 °C gedurende 60 minuten.
    LET OP: Stappen 3.3-3.4 zijn cruciaal om ervoor te zorgen dat secties niet wegdrijven tijdens de antigeenophaalstap.
  5. Dompel dia's onder in twee veranderingen van oplosmiddel (xyleen of substituut) gedurende 40 minuten per stuk, in een rookkap.
  6. Rehydraatglijbanen in 100% ethanol, 100% ethanol, 70% ethanol voor 5 min per stuk.
  7. Was 5 minuten in leidingwater.
  8. Plaats een kookplaat in een rookkap en preboil antigeen retrieval oplossing (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) in een snelkookpan. Zodra de antigen retrieval oplossing begint te koken plaats de dia's in de pot horizontaal met behulp van een tang en vergrendelen het deksel. Kook op hoog (gelijk aan 15 psi of 103 kPa) gedurende 10 min.
    OPMERKING: Deze stap haalt het antigeen van belang op door het antigeen epitoop te ontmaskeren (kruis gekoppeld via formaline fixatie) om epitoopantilichaam specifieke binding mogelijk te maken de daaropvolgende kleuring zal niet werken zonder deze stap.
  9. Haal de snelkookpan van het vuur en verwijder het deksel onmiddellijk door koude tik op de bovenkant van het deksel in een gootsteen te laten lopen. Laat dia's 20 minuten in evenwicht in de antigeen retrieval-oplossing.
  10. Was glijbanen twee maal gedurende 5 minuten in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  11. Gebruik een hydrofobe pen om cirkels te trekken rond het nierweefsel wordt voorzichtig niet te laten geen weefsel uitdrogen in deze tijd.
  12. Blokkeer weefsel in 10% kipsera in 5% runderserum albumine (BSA)/PBS (pH 7.4, 0.01 M) gedurende 30 min, 60 μL per sectie. Was na deze stap niet, maar verwijder de blokkeringsoplossing voorzichtig met een pipet van 60 μL. Laat de secties niet uitdrogen.
  13. Maak een cocktail van de primaire antilichamen verdund in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) in 1 buis. Breng 60 μL per niersecties aan. De concentratie van de primaire antilichamen is als volgt:
    Konijn anti mens/muis H3Cit 1/100
    Muis anti mens/muis PAD4 1/50
    Geit anti mens/muis MPO 1/200
  14. Incubeer 's nachts bij 4 °C in een vochtigheidskamer.
  15. Was twee maal gedurende 5 minuten in PBS (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  16. Maak een cocktail van de secundaire antilichamen in 1 tube. Secundaire antilichamen worden toegepast in 1% BSA/PBS, 60 μL per sectie als volgt:
    Kip anti konijn 488 1/200.
    Kip anti muis 647 1/200.
    Kip anti geit 594 1/200.
  17. Incubeer bij RT voor 40 min.
  18. Was twee maal gedurende 5 minuten in PBS (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  19. Breng secundair antilichaam 1:200 aan in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0,01 M) gedurende 40 min bij RT 60 μL per sectie.
  20. Was twee maal gedurende 5 minuten in PBS (pH 7,4, 0,01 M) op een orbitale shaker.
  21. Dompel dia's onder in 0,3% Sudan Black in 70% ethanol gedurende 30 min.
  22. Was glijbanen in leidingwater om neerslag te verwijderen en dompel vervolgens onder in PBS (pH 7.4, 0,01 M) gedurende 10 min om verdere Soedan black neerslag te voorkomen.
  23. Mount glijbanen op confocale glazen coverslips met behulp van drie 60 μL druppels montageoplossing met DAPI. Verzegel de covers met nagellak door de omtrek van de coverslip aan te brengen.
  24. Laat dia's 24 uur op RT genezen (om DAPI door te laten dringen) en sla vervolgens op bij 4 °C beschermd tegen licht. Houd in het donker om te voorkomen dat vervagen van fluorescerende sondes.
  25. Beelddia's met behulp van een confocale laser scanning hoofd bevestigd aan een microscoop. Prikkel dia's met de 405 laser voor DAPI en de 488 Laser voor H3Cit, 561 voor MPO en 647 voor PAD4. Leg beelden met één vlak van 1024x1024 pixels vast met behulp van line-sequentiële opname en 4-line gemiddelde, wat essentieel is voor het detecteren van ecDNA. Gebruik een 40x 1.0 NA oliedoelstelling. Afbeelding van minimaal 20 glomeruli per monster. Sla afbeeldingen op als ND2-bestanden.

4. Neutrofiele extracellulaire vallen en ecMPO-analyse

  1. ImageJ installeren: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Controleer of de trainbare Weka-segmentatie beschikbaar is onder Plugins | Segmentatie | Trainable Weka Segmentatie.
  3. Drop de afbeelding in ImageJ. Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen. Een afbeelding met DAPI in blauwe kleuring alle kernen zal verschijnen, een afbeelding met H3Cit in het groen, een afbeelding met MPO in het rood, en een afbeelding met PAD4 in het wit zal verschijnen.
    1. Maak een samengevoegd bestand van de afzonderlijke afbeeldingen om een ROI te tekenen voor de glomerulus door te klikken op Kleur | Kanalen samenvoegen. Een pop-upvak vraagt om een kleur toe te wijzen aan elk kanaal. Nadat u elk kanaal een kleur hebt toegewezen, tikt u het vak Samengesteld maken en het vak Bronafbeeldingen behouden aan en klikt u op Ok. Er verschijnt een samengevoegde afbeelding. In tegenstelling tot het protocol voor ecDNA eerder zullen we de samengestelde afbeelding gebruiken om de rest van de stappen uit te voeren.
  4. Voer een Gaussische onscherpte uit op de samengestelde afbeelding. Dit maakt het gladstrijken van de kernen. Klik op Proces | Filters | Gaussian Blur, zet in 1.00-2.00. Het beeld ziet er nu een beetje wazig, maar kernen zijn nu glad en achtergrond verzacht.
    OPMERKING: Deze stap is voorgevormd om ruis te verwijderen om de afbeelding op te schonen uit artefacten die kunnen voorkomen dat relevante detectie van beeldkenmerken moet worden geanalyseerd.
  5. Klik op Plug-ins | Segmentatie | Trainable Weka Segmentatie. Er verschijnt een geheel nieuw venster met de te analyseren afbeelding en weka-segmentatiespecifieke menugereedschappen.
  6. Met behulp van het lijngereedschap op de gereedschapsbalk (in ImageJ) traceert u eerst intacte kernen die niet positief zijn voor alle 4 NET-componenten (MPO, PAD4, DAPI en H3Cit) met behulp van het gereedschap Vrije hand en voeg vervolgens toe aan het vak Klasse 1 toevoegen.
  7. Met het gereedschap Lijn op de gereedschapsbalk ImageJ worden achtergrondgebieden afbakend naar het vak Klasse 2.
  8. Klik op het label Nieuwe klasse maken in het labelmenu en label "NETs". Gebruik het lijngereedschap om NETS af te bakenen dat is geïdentificeerd als colokalisatie DAPI (blauw), MPO (rood), PAD4 (wit) en citrullinated histonen (groen).
  9. Klik op het label Nieuwe klasse maken in het labelmenu en label "ecMPO". Gebruik het lijngereedschap om MPO (rood) dat celvrij is af te bakenen.
  10. Klik op de knop Train Classifier in het trainingsmenu in het venster Trainable Weka Segmentatie.
    OPMERKING: De STOP-knop wordt weergegeven in plaats van de knop Trein classificatie en blijft totdat de training is voltooid. Klik niet op deze knop tijdens de training en het proces wordt onderbroken.
  11. Klik op De knop Resultaat maken in het trainingsmenu en er wordt een afbeelding gemaakt met alle geclassificeerde componenten, bestaande uit intacte kernen, de achtergrond en wat als ecMPO is geïdentificeerd.
  12. Klik op de knop Waarschijnlijkheid ophalen in het trainingsmenu. Schakel de muis in om een zwart-witafbeelding van alle klassen te geven met het object selectie in het wit gemarkeerd.
  13. Dupliceer zowel de NET-waarschijnlijkheid als de ecMPO-waarschijnlijkheidsafbeelding door op Afbeelding te klikken | Dupliceren.
  14. Schakel naar het scherm met de muisknop die NETs bevat. Pas een drempelwaarde toe om ervoor te zorgen dat geïdentificeerde NET's alleen worden benadrukt. Klik op de menubalk van ImageJ op Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Verplaats de schuifschakelbalken totdat de NET-onderdelen zijn gemarkeerd. Klik op Toepassen wanneer u tevreden bent met de drempelwaarde. Herhaal dezelfde stappen voor ecMPO.
  15. Als er na drempels nog steeds gebieden van ecMPO of NETs worden gedetecteerd, gaat u terug naar de oorspronkelijke getrainde afbeelding en voegt u meer classificaties toe en voegt u stappen 4.1-4.14 opnieuw toe.
  16. Klik op Afbeelding | Afbeelding aanpassen | Maak binair. Kopieer de glomerular ROI in stap 4.3, klik op Ctrl+Shift+E. Weka-venster activeren door te bewerken | Selecties | Herstellen,waardoor de selectie wordt hersteld. Klik op Deeltjes analyseren om alleen de NET-deeltjes in de glomerulus te meten.
  17. Schakel naar het scherm met de muisknop die ecMPO bevat. Een drempel hanteren om ervoor te zorgen dat alleen geïdentificeerde ecMPO wordt verkregen. Klik op Toepassen wanneer u tevreden bent met de drempelwaarde. Herhaal stap 4.16 hierboven.
    OPMERKING: Een resultaatblad wordt berekend met de telling van deeltjes, het gebied, de gemiddeldenpixels en het percentage van de glomerulus met zowel NET's als ecMPO. Deze resultaten kunnen vervolgens in een spreadsheet worden geplaatst en worden opgeslagen, voor latere statistische analyse.
  18. Sla de classificatie op als NETs.classifier door in het optiemenu classificatie opslaan te klikken en bestand op te slaan in de ImageJ-app op het bureaublad (ImageJ-map). Klik vervolgens op Gegevens opslaan in het optiemenu en sla op als NETs.arff-bestand. De glomerular ROI zal moeten handmatig worden toegevoegd elke keer als glomerulus grootte en vorm zal veranderen, maar het programma heeft geleerd wat zowel NETs en ecMPO zijn.
  19. Als u het model opnieuw wilt aanpassen op volgende afbeeldingen, herhaalt u stap 4.1-4.5 met een nieuwe afbeelding. Klik in het optiemenu op Classifier laden. Klik op Nets.classifier in de map ImageJ. Het logboekmenu verschijnt en wordt model uitgevoerd, zodra het model op Gegevens laden in het optiemenu heeft uitgevoerd en het BESTAND NETs.arff selecteert.
    1. Klik op Resultaat maken. Als de resulterende afbeelding niet alle kernen, achtergrond of ecDNA heeft opgehaald, klikt u op de classificatie opnieuw trainen en voegt u meer classificaties toe en slaat u het nieuwe model op. Voltooi het analyseproces door stap 4.11-4.19 te herhalen.
      OPMERKING: Verschillende afbeeldingen kunnen worden gebruikt om het uiteindelijke model te genereren dat wordt gebruikt om ecDNA, ecMPO en NETs te detecteren. Dit wordt bereikt door het model toe te passen op volgende afbeeldingen, meer classificaties toe te voegen en het nieuwe model en de gegevens op te slaan in de ImageJ-map. Dit kan vooral belangrijk zijn wanneer verschillende monsters een hogere achtergrond hebben. Het Weka-segmentatieprogramma is compatibel met de macrotaal van ImageJ, waardoor veel van de opdrachten macro-opneembaar zijn om enkele stappen te automatiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze beelden vertegenwoordigen de meerdere stappen die nodig zijn om met succes gebruik te maken van trainbare Weka segmentatie om de arbeidsintensieve handmatige meting van ecDNA in fluorescerend gekleurd FFPE nierweefsel van een muis met geïnduceerde anti-MPO GN te minimaliseren. Deze stappen worden samengevat in figuur 1 en figuur 2 met beelden die rechtstreeks uit het Weka-segmentatieprogramma zijn genomen, waarin elke stap i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er bestaan meerdere protocollen die pro-inflammatoriummarkeringen meten in het serum en de urine van zowel patiënten als muismodellen van glomerulonephritis. Dit beschreven protocol maakt analyse van de producten van celdood (ecDNA, NETs en ecMPO) direct binnen de glomerulus mogelijk. De meest cruciale stappen in dit protocol is de weefselvoorbereiding en beeldvorming. Het belangrijkste beperkende element van het gebruik van een fluorescerende kleuring methode voor analyse is het weefsel autofluorescentie. Formaline vast...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen Monash Micro Imaging voor het gebruik van Nikon C1 rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop en het Monash Histology Platform voor de verwerking van nierweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine Serum AlbuminSIGMAA21535% en 1% oplossingen worden gemaakt in PBS, kunnen in bulk worden gemaakt en bevroren- weggooien na ontdooien.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Spin in mini centrifuge gedurende 1 minuut voor gebruik om elke vrije conjugate in uw antilichaamcocktail te vermijden
Chicken seraSIGMAC5405Gemaakt in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 Dit is niet standaard dikte- ontworpen voor gebruik in confocale microscopie
EDTA 10mMSIGMAE6758Voeg TRIS en EDTA samen toe in gedestilleerd water en pH tot 9, voor antigeenretrieval, kan worden gemaakt in een 10x oplossing
Ethanol 30%, 70% en 100%Chem SupplyUN1170Wordt geleverd als 100% ontnatuurd ethanol- verdun tot 30% en 70% met behulp van gedestilleerd water
Formaldehyde, 4% (10% Neutraal gebufferd Formalin)TRAJANNBF-500Nier wordt gedurende 16 uur bij RT in een 5ml buisje met 3ml formaline geplaatst, formaline moet in een afzuiging worden gebruikt
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mmTRAJANJ3800AM4Het gebruik van positief geladen gecoate slides is essentieel. We raden het gebruik van poly-L-lysine voor het coaten van slides niet aan, aangezien weefsel loskomt van de slides tijdens de antigeenretrieval stap
Goat anti human/mouse MPO antibodyR&DAF3667Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Wordt direct gebruikt, in 200ml kleurvaten, gebruik in een afzuiging
Hydrophobic penVECTOR LabsH-400Gebruiken om een cirkel rond nierweefsel te tekenen
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)ABCAMab128086Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted MicroscopeCoherent ScientificPortioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst
Phosphate Buffered SalineSIGMAP381350.01M PB/0.09% NaCl Maak 5L per keer
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainlessTefalGSA-P2530738Gekocht in lokale huishoudwinkel
Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Breng druppels rechtstreeks op de dekglas
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibodyABCAMab8227Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibodyABCAMab5103Portioneren en bevriezen bij min 80 graden bij aankomst
Staining rack 24 slidesProScitechH4465Kleurvat dat wordt gekozen moet in staat zijn om koken onder druk en incubatie in een 60 graden oven te weerstaan
Sudan Black BSIGMA1996640.3% Voeg 3g toe aan een 1L fles in 70% Ethanol, filter en bescherm tegen licht- stabiel gedurende 6 maanden bij kamertemperatuur
Tris 10mMSIGMAT4661Voeg TRIS en EDTA samen toe in gedestilleerd water en pH tot 9, voor antigeenretrieval, kan worden gemaakt in een 10x oplossing
XyleneTrajanXL005/20Moet worden gebruikt in een afzuiging
```

Referenties

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Trainbare Weka-segmentatieFFPE-weefselkleuringconfocale microscopiebeeldanalysedoven van autofluorescentieneutrofiel extracellulaire trapsextracellulaire myeloperoxidaseclassificatie via machine learning
Begeleide machine learning voor semi-kwantificering van extracellulair DNA in Glomerulonephritis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.