Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten

5.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61186

⸱

15 juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

Thermische grenzen kunnen voorspellen de omgevingen organismen tolereren, dat is waardevolle informatie in het gezicht van de snelle klimaatverandering. Hier beschreven zijn high-throughput protocollen om kritische thermische minima en warmte knockdown tijd bij insecten te beoordelen. Beide protocollen maximaliseren de doorvoer en minimaliseren de kosten van de tests.

Samenvatting

Hogere en lagere thermische grenzen van planten en dieren zijn belangrijke voorspellers van hun prestaties, overleving en geografische spreidingen, en zijn essentieel voor het voorspellen van reacties op klimaatverandering. Dit werk beschrijft twee high-throughput protocollen voor het meten van insecten thermische grenzen: een voor de beoordeling van kritische thermische minima (CTmin), en de andere voor de beoordeling van warmte knock down time (KDT) in reactie op een statische hittestressor. In de CTmin test, individuen worden geplaatst in een acryl-jas kolom, onderworpen aan een dalende temperatuur helling, en geteld als ze vallen uit hun zitstokken met behulp van een infrarood sensor. In de hitte KDT test, individuen zijn opgenomen in een 96 put plaat, geplaatst in een incubator ingesteld op een stressvolle, warme temperatuur, en video opgenomen om het tijdstip waarop ze niet meer rechtop kunnen blijven en bewegen te bepalen. Deze protocollen bieden voordelen ten opzichte van veelgebruikte technieken. Beide tests zijn lage kosten en kunnen relatief snel worden voltooid (~ 2 uur). De CTmin test vermindert experimenter fout en kan meten een groot aantal individuen tegelijk. De warmte KDT protocol genereert een video-record van elke test en dus verwijdert experimenter bias en de noodzaak om continu te controleren individuen in real time.

Inleiding

Thermische grenzen van insecten
Variatie in omgevingsomstandigheden, met inbegrip van temperatuur, is een belangrijke factor die van invloed is op de prestaties, geschiktheid, overleving en geografische verspreiding van organismen1,2. Boven- en onderwarmtegrenzen bepalen het theoretische bereik van omgevingen die een organisme kan verdragen, en daarom zijn deze grenswaarden belangrijke voorspellers van planten- en dierdistributies, vooral in het licht van de klimaatverandering3,4. Zo zijn protocollen om de thermische grenswaarden nauwkeurig te meten belangrijke instrumenten voor onder andere ecologen, fysiologen, evolutiebiologen en conservatiebiologen.

Als de meest voorkomende en diverse landdieren worden insecten vaak gebruikt voor metingen van thermische limieten. Kritische thermische maxima (CTmax)en kritische thermische minima (CTmin) worden vaak gebruikt om intra- en interspecifieke variatie in thermische tolerantie5,6,7te beoordelen . Terwijl CTmax en CTmin kunnen worden gemeten voor meerdere fenotypes, waaronder groei, reproductieve output en gedrag, worden ze meestal toegepast op motorische functie5,6,7. Zo worden CTmax (ook wel warmte knockdown temperatuur genoemd) en CTmin vaak gedefinieerd als de hoge en lage temperaturen waarbij insecten de motorische functie verliezen en niet rechtop kunnen blijven5,6,7,8,9,10,11. CTmin valt samen met het begin van chill coma, een omkeerbare verlamming veroorzaakt door koude temperaturen6. Terwijl verlamming aan de thermische grenzen vaak omkeerbaar is, leidt voortdurende blootstelling aan deze temperaturen tot ecologische dood5.

Gemeenschappelijke methoden voor het meten van thermische grenswaarden
Er zijn verschillende apparaten gebruikt om thermische limieten te meten (samengevat in Sinclair et al.) 6.Kortom, insecten worden verwarmd of gekoeld in couveuses12,13, containers ondergedompeld in vloeistofbaden11,,14,,15,,16, aluminiumblokken10,,17of gejaste containers18, en bewaakt tot de bewegingsvrijheid ophoudt. Om insecten tijdens de test te monitoren, is de meest voorkomende methode directe observatie, waarbij individuen continu in real time of retrospectief worden gecontroleerd met opgenomen video6,9,10,11,15,17. Hoewel directe observatiemethoden minimale apparatuurvereisten hebben, zijn ze arbeidsintensief en beperken ze de doorvoer. Als alternatief kunnen insecten indirect worden waargenomen door individuen te verzamelen op discrete tijdstippen als ze uit zitstokken6,19,20,,21 vallen of activiteitenmonitorengebruiken 13.

Indirecte methoden voor het meten van thermische grenswaarden zijn over het algemeen een hogere doorvoer en mogelijk minder foutgevoelig dan directe observatiemethoden. De meest voorkomende methode voor indirecte monitoring maakt gebruik van een gejackte temperatuurgecontroleerde kolom6,8,19,20,21. Insecten worden in een kolom met zitstokken geplaatst en de temperatuur van de binnenkamer wordt gecontroleerd door vloeistof uit een temperatuurgestuurd vochtbad door de bekleding van de kolom te pompen. Personen die hun thermische limiet bereiken, vallen van hun baars en worden verzameld bij discrete temperaturen of tijdsintervallen. Hoewel deze methode goed werkt voor CTmin,is het ongeschikt bevonden voor CTmax,omdat vliegen vrijwillig uit de bodem van de kolom lopen wanneer de temperatuur stijgt. De nieuwe methode die hier wordt beschreven omzeilt dit probleem door individueel vliegen te bevatten tijdens geautomatiseerde metingen.

Naast de observatiemethode worden twee soorten temperatuurregimes vaak gebruikt om de bovenste thermische grenswaarden te beoordelen. Dynamische testen bestaan uit het geleidelijk verhogen van de temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; die temperatuur is de dynamische CTmax7,8,9,13. In tegenstelling, statische testen bestaan uit een constante stressvolle temperatuur totdat de motorische functie verloren gaat; dat tijdspunt is de heat knockdown time (heat KDT), ook wel de statische CTmax (sCTmax)genoemd in een recent artikel van Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Hoewel CTmax en warmte knockdown tests (warmte KD-testen) statistieken produceren met verschillende eenheden, geeft wiskundige modellering van de twee eigenschappen aan dat ze vergelijkbare informatie geven over warmtetolerantie en beide ecologisch relevant zijn8,9. Dynamische tests leveren een temperatuur op die kan worden vergeleken met de omgevingsomstandigheden, en ze hebben de voorkeur wanneer er grote verschillen zijn in warmtetolerantie, zoals vergelijkingen tussen soorten met zeer verschillende thermische niches. Vanwege het hoge Q10 voor de accumulatie van hitteletsel kan een statische test echter de voorkeur hebben voor het detecteren van kleine effectgroottes, zoals intraspecifieke variatie in warmtetolerantie9. Ook, praktisch gesproken, een statische test vereist minder geavanceerde apparatuur dan een dynamische test.

Doelstelling
Het doel van dit document is om methoden te formaliseren voor CTmin en warmte KD testen die kunnen worden gebruikt in toekomstig onderzoek om de thermische grenzen van motile insecten te beoordelen. De protocollen zijn aangepast aan de eerder vastgestelde methodologieën en zijn ontworpen om een hoge doorvoer, geautomatiseerd en kosteneffectief te zijn. Beide tests kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur), wat betekent dat meerdere experimenten kunnen worden uitgevoerd in een enkele dag, het produceren van grote hoeveelheden gegevens zonder in te boeten herhaalbaarheid of nauwkeurigheid. Met deze opstelling kan de warmtetolerantie van 96 vliegen tegelijkertijd worden gemeten, terwijl de kolom voor CTmin meer dan 100 vliegen kan bevatten, mits er voldoende oppervlakte is om te onderkomen.

De hoge doorvoermethode voor het observeren van CTmin wijzigt de gemeenschappelijke jaskolommethodologie met de toevoeging van een infraroodsensor om vliegen automatisch te tellen. Het gebruik van een infraroodsensor voor het tellen werd voor het eerst voorgesteld door Shuman et al. in 199623, maar is niet op grote schaal aangenomen. De toevoeging van de infraroodsensor maakt het mogelijk om continue gegevens te genereren in plaats van met discrete intervallen gegevens te verzamelen. Dit protocol minimaliseert ook experimenterfout door handmatige gegevensinvoer te elimineren en de noodzaak om handmatig van verzamelingsbuis onder de gevijzelde kolom op discrete tijdstippen te schakelen.

De hoge doorvoermethode voor het registreren van warmte KDT is gewijzigd uit twee eerdere studies naar warmtetolerantie bij insecten10,12. Individuele vliegen worden opgeslagen in een 96 put plaat in een temperatuur-gecontroleerde incubator en video wordt opgenomen. Dit protocol minimaliseert de bias van de experimentator bij het bepalen van warmte KDT omdat experimenten kunnen worden beoordeeld en geverifieerd door de opname af te spelen. Dit protocol biedt ook een set aangepaste Python-scripts die kunnen worden gebruikt om video-analyse te versnellen. Het gebruik van individuele putten elimineert interferentie die kan optreden wanneer andere personen bewegen of omvallen, wat een probleem kan zijn wanneer groepen individuen worden waargenomen in dezelfde arena10,17. Bovendien zorgt de temperatuurgecontroleerde incubator voor een stabiele temperatuur in alle 96 putten, in tegenstelling tot de temperatuurgradiënt die soms wordt waargenomen in een temperatuurgestuurd aluminiumblok10. Merk ook op dat de 96 goed opname methode kan worden aangepast aan dynamische CTmax en potentieel CTmin (zie Discussie) te meten.

Om elk protocol aan te tonen, werden de thermische grenzen van volwassen Drosophila melanogaster vrouwtjes uit geselecteerde lijnen van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) vergeleken24. Deze lijnen werden geselecteerd omdat voorlopige experimenten significante verschillen in thermische tolerantie aangaven. Deze tests bleken robuuste methoden te zijn om verschillen in thermische tolerantie te discrimineren. De volgende twee protocollen, high-throughput CTmin assay (sectie 1) en high-throughput heat KD-test (sectie 2), beschrijven de noodzakelijke acties om CTmin en warmte KDT-gegevens voor elke motile insect levensfase geschikt voor montage in de apparaten, zoals volwassen Drosophila. Voor CTmin is het ook essentieel dat het insect kan baars. Hier wordt elke test aangetoond in volwassen Drosophila melanogaster. Voor andere taxa - of levensfasen6kunnen echter wijzigingen nodig zijn . Kleine veranderingen kunnen onder meer het gebruik van perching materiaal met grotere openingen om grotere exemplaren in de CTmin test of met behulp van een hogere kwaliteit camera om de subtiele KDT van een langzaam bewegende insect of levensfase in de warmte KD test te onderscheiden. Dit protocol beschrijft geen methoden voor het voorbereiden van vliegen, maar het is belangrijk om opfokprotocollen te standaardiseren om herhaalbaarheid te garanderen25 (zie Garcia en Teets26 en Teets en Hahn27). De verstrekte protocollen bevatten informatie over het bouwen en opzetten van de apparaten, het registreren van metingen en een korte beschrijving van de gegevensanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. High-throughput CTmin assay

  1. De kolom met gejackte kolom monteren (figuur 1A, figuur 2)
    1. Snijd de breedste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) en smalste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) acrylbuizen op gelijke lengte (31,5 cm) met een ijzerzaag (figuur 2A). Deze twee buizen zullen de buitenste en binnenste muren van de jasige kolom.
    2. Snijd twee ringen (2 cm breed) uit de middelgrote (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) acrylbuis met een ijzerzaag (figuur 2A). Deze twee ringen zullen de afstandhouders tussen de binnenste en buitenste buizen, het creëren van een ruimte tussen de twee lange acryl buizen voor vloeistof te stromen.
    3. Boor voorzichtig twee gaten in de buitenste (breedste) acrylbuis, een gat aan de bovenkant en een aan de onderkant. Zorg ervoor dat elk gat zich op 3,5 cm van het einde van de buis bevindt. Boor de gaten aan weerszijden van de buis(figuur 2B).
    4. Om scheuren te verminderen, plaats tape op de buis over de plek van het toekomstige gat en boor heel langzaam op de laagste koppelinstelling van de boor.
    5. Met behulp van de schroefdraad kraan, draad beide gaten, zodat de slang adapters kunnen worden geschroefd in de twee gaten van de buitenste buis. Om scheuren te verminderen, gebruik smeermiddel, en draad langzaam met de hand.
    6. Schuif de twee afstandhouders op de binnenjas, een aan elk uiteinde (onder en boven). Laat een kleine ruimte (0,5 cm) tussen de afstand en het uiteinde van de binnenjas(figuur 2B).
    7. Las de afstandhouders op hun plaats met acrylcement.
    8. Nadat het cement op de binnenband en spacers sets, schuif deze constructie in de grotere buitenste buis met de gaten. Zorg ervoor dat de buiten- en binnenbanden aan beide uiteinden doorspoelen. De afstandhouders begen zich op 0,5 cm van het einde en vormen kleine loopgraven aan beide uiteinden van de kolom(figuur 2C).
    9. Las de buitenbuis aan de afstandhouders met behulp van acrylcement, met behulp van verstelbare stalen klemmen om het apparaat bij elkaar te houden. Wacht tot het cement klaar is.
    10. Rijg de slangadapters in de gaten van de buitenbuis die nu aan de afstandhouders en de binnenband zijn bevestigd.
      OPMERKING: De adapters mogen alleen in de buitenste buis rijgen en niet in de open ruimte tussen de binnen- en buitenste buizen. Als de slangadapters te ver naar binnen rijgen, verkort ze dan met een ijzerzaag tot de juiste lengte.
    11. Sluit de slangadapters in hun draden op de buitenbuis af met siliconenkit.
    12. Vul de twee loopgraven tussen de binnenste en buitenste buizen aan beide uiteinden van de gejackte kolom met siliconen kit.
    13. Als u de kolom wilt testen, bevestigt u buizen met een diameter van 0,6 cm aan de slangadapters. Sluit de adapter aan de onderkant van de kolom aan op een waterbron met slang en de adapter boven aan de kolom op een afvoer met een ander stuk slang.
    14. Voer water door het apparaat van de bodem naar de top en controleer op lekken. Als er lekken zijn, identificeren waar ze vandaan komen en verzegelen met siliconen.
  2. Het instellen van de jaskolom en Drosophila Funnel Monitor (DFM)
    1. Zet de gejackte kolom vast aan een retortstandaard met een drieledige retortklem. Lijn de kolom verticaal uit met het ene uiteinde open naar het plafond en het andere open naar de labbank(figuur 1B).
    2. Sluit de vloeistofinvoer en -output van een temperatuurgestuurd gekoeld bad aan op de adaptersproeiers van de kolom met plastic buizen met een diameter van 0,6 cm (figuur 1B). Sluit de vloeistofinvoer aan op het mondstuk onder aan de kolom en de vloeistofuitvoer met het mondstuk boven aan de kolom.
    3. Snijd twee 3 cm dikke ronde schuim isolerende pluggen (dezelfde omtrek als de opening van het binnenste compartiment van de kolom). Zorg ervoor dat de stekkers goed passen en sluit de binnenste kolom wanneer deze aan beide uiteinden wordt geplaatst(figuur 1B).
    4. Doorboor een gat door het midden van een van de pluggen en rijg het kale uiteinde van een thermokoppel door het gat ongeveer 5 cm en veilig met tape. Sluit het andere uiteinde van het thermokoppel aan op een thermokoppel datalogger.
    5. Sluit de thermokoppeldatalogger aan op de computer.
    6. Wig twee stukken plastic goot bewaker (5 cm x 7 cm, met ~ 0,5 cm diameter openingen) in de kolom om te functioneren als zitmateriaal. Plaats een stuk beschermkap 2/3rds vanaf de bovenkant van de kolom en het andere 1/3rd vanaf de bovenkant van de kolom (Figuur 1B).
    7. Zet de onderste stekker (zonder thermokoppel) en de bovenste stekker (met een thermokoppel) vast. Wanneer de stekker boven aan de kolom wordt geplaatst, moet u ervoor zorgen dat het thermokoppel de zijkanten van de kolom niet raakt.
    8. Pas de hoogte van de kolom op de retort stand, zodat er een 25 cm afstand tussen de onderkant van de kolom en de bank boven.
    9. Zet een retortring (5 cm diameter) vast aan de retortstandaard 5 cm onder de onderkant van de kolom en draai de ring naar de zijkant van de kolom.
    10. Stel de DFM direct op de retortring(figuur 1B). Sluit alle elektronische componenten aan: de voeding, de stroomvoorzieningsinterface en de computer volgens het protocol van de fabrikant.
    11. Zodra de componenten zijn aangesloten, volg het protocol van de fabrikant om de installatie van de DFM- en DFM-software af te ronden.
  3. CtMin Test
    1. Draai de ingangs- en uitgangskleppen van het vloeistofbad naar de open posities.
    2. Druk op de aan/uit-knop om het temperatuurgestuurde vloeistofbad in te schakelen en druk vervolgens op de afspeelknop om een programma uit te voeren dat de temperatuur van het bad verhoogt en handhaaft tot 25 °C. Geef het vochtbad en de kolom 5-10 min om 25 °C te bereiken en te onderhouden.
    3. Verwijder de stekker aan de bovenkant van de kolom en vervang deze door een trechter (5,08 cm diameter; zie figuur 1C).
    4. Tik vliegen van hun voedsel flacon in de kolom.
    5. Verwijder de trechter en vervang deze snel door de bovenste stekker, let op dat vliegen niet ontsnappen. Geef de vliegen 5 min te vestigen, af en toe tikken op de onderste stekker aan te moedigen de vliegen te klimmen.
    6. Druk op de startknop op het vloeistofbad en begin met het CTmin ramping programma (25 °C gedurende 5 min; 25 °C tot 10 °C bij 0,5 °C/min; 10 °C gedurende 2 min; vervolgens 10 °C tot -10 °C bij 0,25 °C/min).
      OPMERKING: Andere varianten van dit CTmin ramping protocol kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvraag (bijvoorbeeld vergelijkingen van de effecten van verschillende hellingspercentages op CTmin28).
    7. Klik op open de thermocouple opnamesoftware op de computer en klik vervolgens op het pictogram Opnemen om te beginnen met het opnemen van de temperatuur in de kolom elke seconde voor de duur van de test. Zorg ervoor dat elke temperatuurregistratie een tijdstempel bevat die specifiek is voor de tweede, zodat temperatuurgegevens later kunnen worden samengevoegd met gegevens van de DFM.
    8. Voeg 5 mL ethanol toe aan een kegelvormige centrifugebuis van 15 mL en plaats deze in een rek onder de kolom.
    9. Af en toe tik je op de onderste stekker van de kolom om vliegen op de bodem te verleiden om te klimmen. De meeste vliegen zullen op een baars of in de buurt van de bovenkant van de kolom door 15 °C.
    10. Bij 15 °C, verwijder de onderste stekker en verzamel alle vliegen nog op de onderste stekker in de ethanol. Tellen en er rekening mee dat deze vliegen werden verzameld op 15 °C, maar hun CTmin is onbekend.
      OPMERKING: De temperatuur waarbij de onderste stekker wordt verwijderd, moet vóór de test worden bepaald en op basis van de voorspeldeCT-min van de testsoort of behandeling. Voor deze test werd 15 °C gekozen op basis van de CTmin van deze specifieke DGRP-lijnen die in voorlopige tests werden aangetroffen.
    11. Plaats een glazen trechter met een buitendiameter met een buitendiameter in de DFM. Pas de retortring, DFM en trechter zo aan dat ze zich onder de kolom bevinden. Zorg ervoor dat de lip van de trechter de onderkant van de kolom volledig afdicht(figuur 1D).
    12. Plaats de onderkant van de trechter in de 15 mL-opvangbuis(figuur 1D).
    13. Open de DFM-software op de computer door op het pictogram Software te klikken. De software zal onmiddellijk beginnen met het opnemen van de tijd / datum waarop vliegen hun CTminbereiken. Vliegen die hun CTmin te bereiken verliezen neuromusculaire functie en vallen uit hun zitstokken, en daarna via de DFM.
    14. Controleer of alle vliegen hun CTmin hebben bereikt als de temperatuur daalt door het controleren van de bovenste stekker en zitstokken om te zien of er nog vliegen zijn nog steeds neergestreken (dat wil zeggen, nog steeds behoud van neuromusculaire functie). De proef eindigt wanneer alle vliegen hebben hun CTminbereikt .
    15. Pas aan het einde van de proef de DFM aan en trechter weg van de kolomopening. Sommige vliegen kunnen hun CTmin bereiken, maar blijven vastzitten in de kolom (d.w.z. ingeklemd in een baars of bungelend aan een enkele tarsale haak). Open de bovenste stekker en verwijder deze vliegen. De CTmin van deze vliegen is onbekend.
    16. Combineer de .txt-uitvoerbestanden van de thermokoppelopnamesoftware (d.w.z. temperatuur, datum en tijd) en de DFM-software (d.w.z. het aantal vliegen door de trechter, datum en tijd) met behulp van de opdracht Samenvoegen in RStudio. Voeg de twee bestanden samen op basis van de variabele gedeelde datum/tijd.

2. Hoge doorvoer warmte KD test

  1. Montage en voorbereiding van apparaten
    1. Bevestig met een lijm het stalen geweven gaas (~1,5 mm diafragma) aan de onderkant van een 96 put no-bottom plaat.
    2. Bevestig magneten aan de tegenovergestelde zijden van de bodem van een 96 goed no-bottom plaat met een hete lijm pistool en hete lijm (Figuur 3).
    3. Om een aangepaste septum deksel met lijm film ontworpen voor 96 put platen ambachtelijke, plak twee films kleverige zijden samen om een geribbelde plastic vel te vormen.
    4. Plaats de plastic platen over de 96 put plaat en gebruik tape om het te hechten aan alle vier de zijden van de plaat. Snijd bij de opening van elke put op de plaat een 'x' in het plastic vel met een stanleymes (d.w.z. 96 totaal x's).
    5. Verdoven vliegen met CO2 en laad ze individueel in elke put van de gewijzigde 96 goed no-bottom plaat met een aspirator en septum deksel. Haal het septumdeksel van de 96 putplaat terwijl de vliegen verdoofd zijn met CO2 en vervang het door een strak passend duidelijk deksel.
    6. Plaats de 96 goed no-bottom plaat geladen met vliegen en met een duidelijke nauwsluitende deksel op voedsel. Zorg ervoor dat de vliegen ten minste2 48 uur hebben tussen CO 2-verdovendering en het begin van de test (stap 2.2.1-2.2.5).
      OPMERKING: De bodem van de gemodificeerde 96 put no-bottom platen is gemaakt van gaas, zodat vliegen verdoofd met CO2 kan worden geladen en links op voedsel voor ten minste 48 uur voordat een proef begint. Elke plastic container >8,5 cm breed x 13 cm lang die ten minste 2 cm diep is om een 1 cm diepe laag voedsel te huisvesten, kan worden gebruikt.
    7. Bevestig een webcam aan de onderkant van de binnenkant van een temperatuurgestuurde incubator met tape. Richt de camera direct omhoog (figuur 4). Zet een couveuseplank ongeveer 10 cm boven de camera vast.
      OPMERKING: De webcam wijst omhoog en registreert de 96 putplaat van onderaf om ervoor te zorgen dat zoveel mogelijk van het putoppervlak in beeld is (bijvoorbeeld niet uit het zicht worden geblokkeerd door de putwanden van de plaat). Wanneer de vliegen hun KDT bereiken, vallen ze naar de bodem van de put; in dit geval, de kant het dichtst bij de webcam, en zijn daarom in het zicht, ongeacht hoe ver hun goed is vanuit het centrum van het zicht.
    8. Sluit de webcam aan op een computer.
    9. Bevestig met tape een wit vel papier (8,5 cm x 13 cm; het exacte gebied van de bodem van de 96 putplaat) aan de onderkant van de plank(figuur 4). Zorg ervoor dat het papier het hele frame vult wanneer het wordt bekeken via de webcam.
    10. Plaats een lichtbron in de couveuse. Gebruik papier of andere materialen om de verlichting te dempen en verblinding te minimaliseren.
      OPMERKING Stap 2.1.10 is specifiek voor elke incubator omdat verlichting en reflecties verschillen tussen couveuses. Het doel is om voldoende verlichting in de couveuse te hebben om een goed contrast te bieden tussen de vliegen in elke put en het witte vel papier achter de plaat wanneer bekeken met de webcam.
  2. Het uitvoeren van de warmte KD test
    1. Zet de couveuse op 37,5 °C en wacht ongeveer 30 minuten om de couveuse de tijd te geven om de gewenste temperatuur te bereiken en te behouden. De exacte temperatuur zal afhangen van het insect dat wordt beoordeeld en eventuele andere tijdsoverwegingen.
    2. Plaats de 96 putplaat omgekeerd in de couveuse, zodat de onderkant van de plaat (mesh kant) tegen het wit papier op de bodem van de lade(figuur 4). Let op de oriëntatie van de putten (kolom- en rijnamen) op de lade en in het frame van de webcam. Gekleurde tape langs de zijkanten van de 96 put plaat en randen van het witte stuk papier kan de oriëntatie te verifiëren(figuur 4).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de temperatuur van de couveuse overeenkomt met de temperatuur in de 96 putplaat door de temperatuur in de plaat vast te leggen met een thermokoppel tijdens een testproef van de warmte KD-test. Het is ook verstandig om te controleren of er een verwaarloosbare variatie in temperatuur is tussen de putten van de 96 putplaat met meerdere thermokoppels voordat u de warmte KD-test uitvoert.
    3. Sluit de couveusedeur.
    4. Klik op Opnemen op de video-opnamesoftware.
    5. Na 2 uur, controleer de opname om te zien dat alle vliegen hun laatste rustplaats hebben bereikt en gestopt met bewegen. Zodra alle vliegen zijn gestopt met bewegen, klikt u op Stoppen op de video-opnamesoftware. Voor de hier geteste genotypen, gefokt bij 25 °C, bereiken de meeste vliegen hun KDT met 60 min bij 37,5 °C (zie ook Jørgensen et al.9).
    6. Gooi de vliegen weg.
    7. Gebruik de aangepaste Python-scripts(Aanvullende coderingsbestanden 1-3) om de tijd in de video te benaderen wanneer vliegen hun warmte KDT bereiken.
      LET OP: Stap 2.2.7 is optioneel. Om de video-analyse te versnellen, zijn een set aangepaste Python-scripts ontwikkeld om veranderingen in pixeldichtheid in de loop van de tijd in elke put te meten (zie Aanvullend coderingsbestand). Wanneer de vliegen stoppen met bewegen, is de pixeldichtheid constant en kan een plot van deze gegevens worden gebruikt om de geschatte tijd in de video te lokaliseren wanneer vliegen worden neergehaald. Hoewel het mogelijk is om dit script te gebruiken om gegevensanalyse te automatiseren, leiden momenteel kleine onvolkomenheden in de video tot kleine verschillen tussen veranderingen in pixeldichtheid en de echte KD-tijd.
    8. Klik op het videobestand openen en neem de KDT van elke vlieg in elke put. De meest consistente maatregel van warmte KDT tussen proeven en waarnemers is het opnemen van het tijdstip waarop een vlieg bereikt zijn laatste rustplaats.
    9. Volg de video in omgekeerde richting, gericht op een enkele put, en wijzend op het tijdstip waarop de vlieg eerst beweegt uit zijn laatste rustplaats. Herhaal dit proces voor elke put.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De thermische grenswaarden (d.w.z. CTmin en warmte KDT) van vrouwen van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) werden gemeten om de gegevens met hoge doorvoer aan te tonen die uit de twee beschreven protocollen werden gegenereerd. CTmin werd gessayd met behulp van de DGRP-lijnen 714 (n = 37) en 913 (n = 45). Heat KDT werd gessayd en vergeleken met de DGRP lijnen 189 (n = 42) en 461 (n = 42), en videobestanden werden handmatig geanalyseerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie


De twee hierboven beschreven methoden genereren gegevens met een hoge doorvoer van ecologisch relevante statistieken voor hogere en lagere thermische limieten. Deze protocollen bouwen voort op eerder vastgestelde methoden die gemeenschappelijk zijn voor onderzoek naar insectenthermische grenswaarden (samengevat in Sinclair et al.) 6. Beide protocollen kunnen worden voltooid in een korte tijd (~ 2 uur per stuk), produceren gegevenssets met grote steekproefgroottes, niet opofferen herhaalbaarhei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Ellie McCabe voor hulp bij het grootbrengen. Dit werk wordt ondersteund door het United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 en National Science Foundation subsidie OIA-1826689 aan N.M.T.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)Thermo Scientific; Waltham, MA153-5401
C922 Pro Stream WebcamLogitech; Newark, CA960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cmAnyAny
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cmUnited States Plastic Corp., OH44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cmUnited States Plastic Corp., OH440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cmUnited States Plastic Corp., OH44041
Clear silicone sealantAnyAny
Collection tube (15 ml)AnyAny
Cordless DrillAnyAny
Drosophila Funnel Monitor (DFM)TriKinetics; Waltham, MADFMWordt gebruikt om het aantal vliegen te tellen dat op een bepaald tijdstip door de trechter valt
DAM data collection softwareTriKinetics; Waltham, MAHoudt gegevens van de DFM bij
Fly Storage LidFlySorter; Seatle, WAFS-96LID-5PKWordt gebruikt om vliegen in de opslagplaat voor de sCTmax-test te laden
Fly Storage PlateFlySorter; Seatle, WAFS-96PLATE-5PKWordt gebruikt om vliegen vast te houden tijdens de sCTmax-test
Fly Food TrayFlySorter; Seatle, WAFS-TRAY-5PKWordt gebruikt om vliegen op voedsel te houden na het laden in de 96-wellplaat tot de sCTmax-test
Glass funnelKimax28950-7575mm
Gutter guardAnyAny~0.5 cm diameter openingen
HacksawAnyAny
Heratherm Thermo Scientific incubatorThermo Scientific; Waltham, MAOMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8United States Plastic Corp., OH61135
Hot glue gun and glueAnyAny
Light SourceAnyAny
MagnetsAnyAny
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player SoftwareOMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T)OMEGA; Norwalk, CT5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnelAnyAny2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameterUnited States Plastic Corp., OH62852
Retort ringAnyAny2" diameter
Retort standAnyAny
Retort three-prong clampAnyAny
Rstudio
Serial port connector (PSIU9)TriKinetics; Waltham, MAPSIU9Tussenliggende verbinding tussen de DFM en de computer, maakt meerdere DFM-verbindingen mogelijk
Styrofoam (2" thick)AnyAny
TapeAnyAny
Uninterrupted Power Supply (PS9-1)TriKinetics; Waltham, MAPS9-1Voeding voor de DFM en PSIU9
Weld-on #4 Acrylic CementUnited States Plastic Corp., OH45737

Referenties

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593(2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946(2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Kritiek thermisch minimumhitte-knockdown-tijdthermische tolerantie van insectenDrosophila-trechtermonitor96-wells plaatassaytemperatuurrampprotocolanalyse van videoplaatjesmeting van de thermische limietrespons op klimaatverandering
Hoge doorvoertesten van kritieke thermische grenzen bij insecten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.