Methodenartikel

In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

DOI:

10.3791/61196

⸱

13 juni 2020

 , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitten worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken in een cel om homeostase te behouden. In staat zijn om de afbraak van een eiwit van belang te controleren is de sleutel tot het begrijpen van niet alleen de levenscyclus, maar ook om onevenwichtigheden in het proteostasenetwerk aan het licht te brengen. Deze methode laat zien hoe de afbraak van het ziekteverwekkende eiwit huntingtine kan worden gevolgd. Twee versies van huntingtine gefuseerd tot Dendra2 worden uitgedrukt in het C. elegans zenuwstelsel: een fysiologische versie of een met een uitgebreide en pathogene strook glutamines. Dendra2 is een fotoconverteerbaar fluorescerend eiwit; op een korte ultraviolette (UV) bestraling puls, Dendra2 schakelt zijn excitatie / emissie spectra van groen naar rood. Net als bij een pulse-chase experiment, kan de omzet van de omgebouwde red-Dendra2 worden gecontroleerd en gekwantificeerd, ongeacht de interferentie van nieuw gesynthetiseerd groen-Dendra2. Met behulp van confocale microscopie en door de optische transparantie van C. elegansis het mogelijk om de afbraak van huntingtine-Dendra2 in een levend, ouder wordend organisme te monitoren en te kwantificeren. Neuronale huntingtine-Dendra2 wordt kort na de conversie gedeeltelijk afgebroken en in de loop van de tijd verder gewist. De systemen die de afbraak beheersen zijn ontoereikend in aanwezigheid van mutant huntingtine en worden verder aangetast door veroudering. Neuronale subtypes binnen hetzelfde zenuwstelsel vertonen verschillende omzetcapaciteiten voor huntingtine-Dendra2. Over het algemeen kan het monitoren van een eiwit dat met Dendra2 is gesmolten, belangrijke informatie opleveren, niet alleen over de degradatie en de spelers van het betrokken proteostasenetwerk, maar ook over de locatie, de handel en het vervoer ervan.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het proteoom van een levend organisme vernieuwt zichzelf voortdurend. Eiwitten worden voortdurend afgebroken en gesynthetiseerd volgens de fysiologische vraag van een cel. Sommige eiwitten worden snel geëlimineerd, terwijl andere langer worden geleefd. Het monitoren van eiwitdynamica is een eenvoudigere, nauwkeurigere en minder invasieve taak bij het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (FPs). FPs vormen auto-katatisch en kunnen worden gefuseerd tot elk eiwit van belang (POI), maar vereisen geen enzymen te vouwen of cofactoren nodig, behalve voor zuurstof1. Een nieuwere generatie FPs is onlangs ontworpen om kleur te schakelen op bestraling met een lichtpuls van bepaalde golflengte. Deze fotoactivatable FPs (PAF's) maken het mogelijk om POI's, organellen of cellen waarin ze zich bevinden, te labelen en bij te houden, en om hun kwantitatieve en/of kwalitatieve parameters te onderzoeken2. FPs maken het mogelijk om elke POI's beweging, directionaliteit, snelheid van beweging, coëfficiënt van diffusie, mobiele versus onbeweeglijke breuken, de tijd dat het zich in een cellulair compartiment, evenals de omloopsnelheid. Voor specifieke organellen kunnen bewegings- en transport- of splijtings- en fusiegebeurtenissen worden bepaald. Voor een bepaald celtype kunnen de positie, de verdelingssnelheid, het volume en de vorm van een cel worden vastgesteld. Cruciaal is dat het gebruik van PAFP's tracking mogelijk maakt zonder continue visualisatie en zonder interferentie van een nieuw gesynthetiseerde sonde. Studies zowel in cellen als in hele organismen hebben met succes PAFP's gebruikt om biologische vraagstukken in vivo aan te pakken, zoals de ontwikkeling van kanker en metastase, assemblage of demontage van het cytoskelet en RNA-DNA/eiwit interacties3. In dit manuscript worden lichtmicroscopie en PAFP's gebruikt om de omloopsnelheid van het aggregatiegevoelige eiwit huntingtine (HTT) in vivo bloot te leggen in een C. elegans-model van neurodegeneratieve ziekte.

Het hier beschreven protocol kwantificeert de stabiliteit en afbraak van het fusie-eiwit huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 is een monomerieke PAFP4 van de tweede generatie die zijn emissie/excitatiespectra onomkeerbaar schakelt van groen naar rood in reactie op UV of zichtbaar blauw licht, met een toename van de intensiteit tot 4.000-voudig5,6. Huntingtine is het eiwit dat verantwoordelijk is voor het veroorzaken van de ZvH, een fatale erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Huntingtine exon-1 bevat een stuk glutamines (CAG, Q). Wanneer het eiwit wordt uitgedrukt met meer dan 39Q, het misfolds in een mutant, giftig en pathogene eiwit. Mutant HTT is gevoelig voor aggregatie en leidt tot neuronale celdood en degeneratie, hetzij als korte oligomerische soorten of als grotere zeer gestructureerde amyloïden7.

De nematode is een modelsysteem voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie dankzij het gemak van manipulatie, isogene aard, korte levensduur, en de optische transparantie8. Om de stabiliteit van HTT in vivo te bestuderen, werd een fusieconstructie uitgedrukt in het zenuwstelsel van C. elegans. Een HTT-D2 transgene met ofwel een fysiologische stretch van 25Qs (HTTQ25-D2) of een pathologisch traject van 97Qs (HTTQ97-D2) is overexpressed pan-neuronally gedurende de levensduur van de nematode9. Door live C. elegans te onderwerpen aan een kort en gefocust lichtpunt, wordt een enkel neuron gefotoswitcheerd en wordt de omgebouwde HTT-D2 in de loop van de tijd bijgehouden. Om de hoeveelheid HTT-D2 te laten afnemen, wordt het verschil tussen het rode signaal van de vers omgebouwde HTT-D2 vergeleken met het resterende rode signaal van HTT-D2 na een bepaalde periode. Daarom wordt het mogelijk om te onderzoeken hoe huntingtine wordt afgebroken wanneer het in zijn uitgebreide en toxische vorm wordt gevonden in vergelijking met zijn fysiologische vorm; hoe anterie of achterste neuronen anders reageren op de aanwezigheid van Q97 versus Q25, vooral over langere perioden; en hoe de ineenstorting van het proteostasenetwerk (PN) tijdens de vergrijzing bijdraagt aan de verschillen in degradatiepercentages. Deze resultaten beschrijven slechts een kleine reeks opmerkingen over de omzet van HTT-D2. Echter, veel meer biologische vragen die relevant zijn voor zowel het gebied van eiwit aggregatie en proteostase kan worden aangepakt met deze in vivo toepassing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van C. elegans die neuronale Huntingtine-Dendra2 fusie-eiwit uitdrukken

  1. Kloon het gen dat de POI codeert in een nematode expressievector (d.w.z. pPD95_75, Addgene #1494), door traditionele restrictie enzymvertaet10, Gibson assemblage11, of een methode van keuze. Plaats een promotor om expressie te stimuleren in een gewenst weefsel of in een gewenste ontwikkelingsfase. Plaats de Dendra2 fluorofophore n- of C-terminaal in frame met de POI.
  2. Het genereren van transgene C. elegans die de fusieconstructie uitdrukken (bijvoorbeeld via microinjectie)12.
    LET OP: De plasmide die het transgene draagt, blijft als een extrachromosomale array. Integratie van de constructie is niet nodig, maar kan indien gewenst worden uitgevoerd13. In dit protocol, C. elegans werden microinjected met een plasmide die de fusie constructie huntingtine exon 1-Dendra2 (HTT-D2) onder de controle van de pan-neuronale promotor Prgef-1. De C. elegans expressie ruggengraat werd verkregen uit Kreis et al.14, de huntingtine exon 1 met Q25 of Q97 werd verkregen uit Juenemann et al.15, en Dendra2 werd verkregen uit Hamer et al.16.

2. Leeftijdsmatching en onderhoud van C. elegans

  1. Leeftijd komen overeen met alle aaltjes door te synchroniseren met alkalische hypochloriet oplossing behandeling17 of via ei leggen voor 4 uur bij 20 °C. Voor het leggen van eieren, plaats 10 gravid volwassenen op een vers gezaaide nematode groei media (NGM) plaat en laat voor 4 uur voor het verwijderen. De eieren gelegd in deze tijdspanne zal aanleiding geven tot gesynchroniseerde aaltjes.
  2. Houd experimentele C. elegans op nematode groei media (NGM) platen gezaaid met de bacteriële voedselbron E. coli OP50, volgens standaard nematode veeteelt18.
  3. Kweek aaltjes bij 20 °C naar het gewenste stadium. Voor dit protocol zijn de vereiste leeftijden dagen 4 en 10.
    OPMERKING: Jongvolwassenen op dag 4 kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van eieren in hunlieren en hun hoge mobiliteit. Leeftijd dag 10 aaltjes zijn post-vruchtbaar, en ondergaan weefsel verslechtering en locomotief daling19.
  4. Voor dag 10 nematoden, passage dagelijks na de L4 fase op dag 3, zodra nematoden vruchtbaar zijn, om een gemengde bevolking te voorkomen.

3. Voorbereiding van microscopieglijbanen voor beeldvorming

  1. Bereid de microscopieglijbanen voor op de dag van de beeldvorming. In een magnetron, smelt algemene rang agarose bij een concentratie van 3% (w / v) in ddH2O. Laat iets afkoelen.
  2. Snijd de punt van een 1 mL pipetpunt en aspiraat ongeveer 400 μL gesmolten agarose. Plaats voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en plaats onmiddellijk een andere dia op de top, ervoor te zorgen dat een dunne pad van agarose wordt gemaakt tussen de twee. Laat drogen voordat u de bovenkant voorzichtig schuift of optilt.
  3. Plaats de agarose pad glijbanen in een bevochtigde container om te voorkomen dat ze uitdrogen. Deze kunnen binnen 2-3 uur worden gebruikt.
    OPMERKING: Vermijd vorming van kleine belletjes in de agarose, omdat de aaltjes erin kunnen worden opgesloten.

4. Definitie van confocale microscoopparameters

OPMERKING: Definieer alle instellingen op de confocale acquisitiesoftware voordat u de aaltjes en gegevensverwerving monteert. De instellingen kunnen worden aangepast aan de imaging hardware en software van keuze.

  1. Open de confocale software en definieer de laserbeeldvormingsinstellingen. Stel het lichtpad in voor excitatie/emissie voor groene Dendra2 op 486-553 nm en voor rode Dendra2 op 580-740 nm. Pas het vermogen en de winst van beide kanalen/lasers aan op basis van de intensiteit van de fluorofoof. Verander de digitale versterking of offset niet en stel het gaatje zo volledig open.
  2. Definieer de acquisitie-instelling: selecteer een sequentiële kanaalmodus en schakel van spoor over elk frame. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1.024 x 1.024, met een regelstap van 1. Stel het middeling in op 2 en gemiddeld met gemiddelde methode en wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op 8 bits.
  3. Definieer de instellingen voor multidimensionale acquisities voor de conversie van Dendra2. Voor conversie en bleken gebruik maken van de 405 nm diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Activeer indien beschikbaar de veilige blekende GaAsP om de detectoren te beschermen.
  4. Selecteer een tijdreeks van twee cycli, met een interval van 0,0 ms ertussen en een normale start en stop. Begin met bleken na scan 1 van 2 en herhaal voor 30 iteraties. Stop met bleken wanneer de intensiteit daalt tot 50%.
  5. Definieer de snelheid van acquisitie/pixelbewoning zo snel (bijvoorbeeld maximaal = 12) voor conversie en gemiddelde snelheid (bijvoorbeeld medium = 5) voor het vastleggen van een snap-afbeelding.
    OPMERKING: De hier gedefinieerde bleekparameters zijn richtlijnen. Voor andere Dendra2-getagde POI's moeten de laserkrachtinstellingen en het bleken van iteraties en waarden empirisch worden vastgesteld.

5. Montage van C. elegans op microscopieglijbanen

OPMERKING: Plaats indien mogelijk een stereomicroscoop die in de montage dicht bij de confocale microscoopopstelling staat en monteer de aaltjes vlak voor beeldvorming.

  1. Op de glazen deksel schuif aan de andere kant van de agarose pad, teken een venster met vier vierkanten met een permanente marker en nummer ze.
  2. Pipet 15 μL levamisole in het midden van het agarosepad. De concentratie levamisole zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de nematode: Bij beeldvorming dag 4 aaltjes gebruiken 2 mM levamisole; bij beeldvorming dag 10 aaltjes gebruiken 0,5 mM levamisole.
  3. Breng vier aaltjes in de vloeistof met behulp van een draad te halen. Met behulp van een wimper pick, voorzichtig bewegen elke individuele aaltje naar een venster vierkant. Draai de wimper zodat elk spoor van E. coli OP50 wordt verdund en de fluorescerende achtergrond niet interfereert met signaalverwerving.
  4. Wacht tot de aaltjes bijna stoppen met bewegen en plaats voorzichtig een afdekkingslip bovenop de vloeistof om de aaltjes in de laag levamisole tussen het agarosepad en de afdekslip te immobiliseren.
  5. Plaats de omgekeerde dia op het confocale stadium om de aaltjes in beeld te brengen.

6. Conversie van groene Dendra2: Data-acquisitie op tijd nul

OPMERKING: De puls-chase experimenten beginnen met het onomkeerbaar omzetten van de Dendra2 fusie-eiwit van een groene emitterende fluorofofoër naar een rode.

  1. Met behulp van het oculair van de microscoop, zoek de eerste nematode met een 20x doelstelling onder groene fluorescentie. Focus op de kop of staart en schakel over naar confocale modus.
  2. Start live laserscanning met de 488 nm blauwe laser om de groene Dendra2 in het EGFP groene kanaal te visualiseren (ex/em = 486-553 nm). Selecteer een enkel neuron en breng het in beeld. Zoom 3x in en verhoog het doel van de laserstraal4.
    OPMERKING: Selecteer één neuron per nematode. Elk neuron vormt één monster of gegevenspunt.
  3. Zoek het maximale projectievlak en verhoog of verlaag, afhankelijk van de helderheid van de fluorofofoof, de versterking of laserkracht om een verzadigd maar niet overbelicht beeld te verkrijgen dat herkenbaar is aan de kleurbereikindicator. Zodra dit is gedefinieerd, stopt u het scannen.
    LET OP: Bestraal het monster niet te lang of met te veel vermogen, want excitatie met zichtbaar blauw 488 nm-licht kan Dendra2 ook omzetten, zij het langzaam en minder efficiënt4.
  4. Open in de software het tabblad om de regio's van belang (ROI's) te selecteren en een eerste ROI rond het geselecteerde neuron te maken. Definieer een grotere tweede interesseregio die het hoofd van de nematode omvat en inclusief de eerste ROI.
  5. Selecteer in de kleurinstellingen voor de eerste ROI die moet worden verworven, gebleekt en geanalyseerd. Selecteer voor de tweede ROI die moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt.
  6. Stel de scansnelheid in op maximaal (d.w.z. snelle pixeldwell) en start het experiment om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten.
    OPMERKING: Zodra het experiment is uitgevoerd, resulteert de verkregen afbeelding in twee afbeeldingen: één voor en één na conversie. Voor het groene kanaal moet het eerste beeld een hoger groen signaal hebben dat in het tweede beeld afneemt als gevolg van de omzetting van de groene Dendra2. Voor het rode kanaal moet de eerste afbeelding negatief zijn en geen signaal weergeven, met een rood signaal dat in de after conversion-afbeelding verschijnt. Als het groene signaal niet afneemt, is de conversie niet uitgevoerd en moeten de instellingen, zoals de 405-laserkracht of het aantal iteraties, worden gewijzigd. Als er een rood signaal in het eerste beeld, dan is de 488 nm laservermogen gebruikt was te hoog en een deel van de groene Dendra2 was al omgezet in rood. In dit geval moet een nieuw neuron/nematode worden geselecteerd.
  7. Direct na conversie start live scannen met de groene 561 nm laser om Dendra2 te visualiseren in het rode kanaal (ex/em = 580-740 nm). Zoek de focus en de respectieve maximale projectie van het geconverteerde neuron met behulp van het bereik kleurindicator om overbelichting te voorkomen.
  8. Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelwoningsnelheid (bijvoorbeeld 5x) en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt gedefinieerd als timepoint zero (T0) na conversie.
    OPMERKING: De snelheid van acquisitie voor de geconverteerde afbeelding kan worden gevarieerd. Echter, eenmaal gekozen, deze snelheid moet constant blijven tijdens het verzamelen van gegevens.
  9. Sla de scan op met een identificeerbare naam en/of getal, gevolgd door het time zero label (T0).
    OPMERKING: Het is raadzaam om ook het beeld van het conversie-experiment (stap 6.6) op te slaan om het ontbreken van rood signaal voor conversie en het uiterlijk daarna te illustreren.

7. Beeldvorming van omgezette rode Dendra2 voor gegevensverwerving op een geselecteerd tweede keerpunt

  1. Om Dendra2-degradatie na verloop van tijd bij te houden, definieert u een tweede timepoint om dezelfde aalematode/neuron opnieuw teimen. Selecteer het tweede timepoint experimenteel om een relevante biologische vraag aan te pakken. Voor het protocol hier beschreven, Dendra2 is afgebeeld zowel op 2 uur (T2) en 24 uur (T24) na conversie.
    1. Op het geselecteerde momentpunt, vind dezelfde nematode / neuron met het gebruik van het oculair en rode fluorescentie.
    2. Open de T0-afbeelding van de desbetreffende nematode/neuron en herlaad/hergebruik de afbeeldingsinstellingen. Zorg ervoor dat de acquisitie-instellingen van de momentopname precies hetzelfde zijn bij het verkrijgen van de T0-, T2- en T24-beelden.
    3. Het scannen van live in het rode kanaal, breng de omgezet rode neuron in focus. Omdat de rode Dendra2 na verloop van tijd degradeert, zal de bereikindicator een minder intense maximale projectie laten zien. Wijzig geen acquisitieparameters en verkrijg een momentopname met dezelfde snelheid (bijvoorbeeld 5x) als de eerste afbeelding.
  2. Om de degradatie van Dendra2 na 4 uur of langer bij te houden, red je de aaltjes na de omzetting.
    1. Verwijder de dia onmiddellijk na het converteren en imaging van de vier aaltjes. Verwijder voorzichtig de coverslip en met behulp van een draad pick, til elke nematode uit de agarose pad.
    2. Plaats elke nematode afzonderlijk op een op de juiste wijze geëtiketteerde en identificeerbare NGM-plaat.
    3. Voor de tweede keer punt, monteer de nematode opnieuw op een verse agarose pad en ga verder met de beeldvorming van de omgebouwde rode Dendra2 volgens de instructies in sectie 6.

8. Beeldanalyse van omgerekend Dendra2

OPMERKING: Analyse van de afbraak van Dendra2 wordt uitgevoerd met Fiji / ImageJ software20.

  1. Open Fiji en sleep en zet het .lsm-bestand in de Fiji-balk. Open de T0-afbeelding die net na de conversie is genomen en de afbeelding van dezelfde nematode die is genomen op het geselecteerde tijdstip na conversie (T2 of T24 h).
    OPMERKING: Om de afbraak van het eiwit van belang gefuseerd naar Dendra2 te volgen, hoeft alleen het rode kanaal te worden geanalyseerd.
  2. De meetparameters in het menu bepalen: Analyseren | Metingen instellen. Selecteer de functies Area en Integrated Density.
  3. Selecteer de afbeelding verkregen met het rode kanaal. Selecteer het selectiegereedschap Veelhoeken in de fiji-balk.
  4. Identificeer het geconverteerde neuron op de T0-afbeelding en teken er een ROI omheen met behulp van het selectiegereedschap.
    1. Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, markeert u de intensiteitsdrempels door te selecteren in de balkAfbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Sleep de balkcursor om de drempelwaarde af te bakenen en volg rond dit gebied met het gereedschap veelhoek. Om een nauwkeurige ROI te genereren, is het ook mogelijk om de contour van het geselecteerde neuron uit het groene kanaal te gebruiken.
  5. Zodra de selectie is gemaakt in het rode kanaal venster, druk op Analyseren | Meten. Er verschijnt een pop-upvenster met de naam Resultaten en bevat de ROI-waarden voor Area, IntDenen RawIntDen.
  6. Voer hetzelfde selectie- en metingsproces uit voor de afbeelding van het tweede tijdspunt (T2 of T24 h).
  7. Kopieer de verkregen waarden in een spreadsheetsoftware, waarbij u ervoor zorgt dat de waarden op T0 na conversie en op T2 of T24 na conversie op de juiste manier worden geregistreerd.

9. Berekening van de verhouding van dendra2 degradatie

  1. Om de verhouding van de afbraak te berekenen, wijst u eerst een waarde van 1 (of 100%) toe om de degradatie van tijdpunt nul (d.w.z. net na omzetting, wanneer alle rode omgezet Dendra2 nog aanwezig is) te timen. Dit vloeit voort uit het zelf verdelen van de waarde van IntRawDen van T0.
  2. Om de vermindering van het rode Dendra2 intensiteitssignaal in de loop van de tijd en de degradatie te berekenen, deelt u de waarde van RawIntDen van het tweede tijdspunt (bijvoorbeeld T2 of T24 h) door de waarde van de RawIntDen van T0. Het resulterende aantal moet kleiner zijn dan 1. Deze waarden kunnen ook worden uitgedrukt als percentages, die T0 definiëren als 100%.
  3. Herhaal sectie 7 voor elke omgezet aaltje. Voor een grafische weergave van de afbraak van Dendra2, grafiek een spreiding plot of staafgrafiek met het percentage of de verhouding waarden van fluorescentie daling verkregen in de y-as. Pas een gewenste statistische analyse toe en illustreer deze op de grafiek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Twee nematodestammen die het huntingtine exon-1 eiwitfragment in frame met het fotoconvertible eiwit Dendra2 uitdrukken, werden verkregen via micro-injectie en de plasmiden werden bewaard als een extrachromosomale array. De fusieconstructie werd uitgedrukt in het hele C. elegans zenuwstelsel van ontwikkeling tijdens de veroudering. Hier bevatte HTT-D2 ofwel de fysiologische 25 polyglutamine stretch (HTTQ25-D2, Figuur 1A) of een volle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de functie van een eiwit te begrijpen is het belangrijk om de synthese, locatie en afbraak ervan te begrijpen. Met de ontwikkeling van nieuwe, stabiele en heldere FPs is het visualiseren en monitoren van POI's eenvoudiger en efficiënter geworden. Genetisch uitgedrukte fusieps zoals Dendra2 zijn uniek gepositioneerd om de stabiliteit van een POI te bestuderen. Bij blootstelling aan paars-blauw licht breekt Dendra2 op een precieze locatie binnen een triade van geconserveerde aminozuren. De fluorofophore ondergaat een kl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP) voor financiering. We erkennen ook de Imaging Core Facility van het Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) voor het leveren van de imaging opgezet. Daarnaast willen we Diogo Feleciano bedanken die het Dendra2-systeem in het lab heeft opgezet en instructies heeft gegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM component
Agarose, Universal GradeBio & Sell GmbHBS20.46.500Mounting slide component
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
Deckgläser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Cover slips
EC Plan-Neofluar 20x/0.50 Ph2 M27Carl Zeiss AGObjective
Fiji/ImageJ 1.52pNIHAnalysis Software
Levamisole HydrochlorideAppliChem GmbHA4341Anesthetic
LSM710-ConfoCor3Carl Zeiss AGLaser Scanning Confocal Microscope
Mounting stereomicroscopeLeica Camera AGMounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2this paperC. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2this paperC. elegans strain
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50Nematode food source
Sodium ChlorideCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM component
Standard-Objekttrã¤gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Glass slides
ZEN2010 B SP1Carl Zeiss AGConfocal acquisition software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005(2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773(2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dendra2 fotoconversieconfocale microscopiehuntingtine degradatieproteostase netwerkneuronale subtypenlive imagingfluorescentiekwantificeringverouderend organisme

Gerelateerde artikelen