Generatie van hiPSC-afgeleide darmorganoïden voor ontwikkelings- en ziektemodelleringstoepassingen

Samenvatting

Dit protocol maakt het mogelijk om menselijke pluripotente cellen te differentiëren tot darmorganoïden. Het protocol bootst de normale menselijke ontwikkeling na door cellen te differentiëren in een populatie van definitief endoderm, endoderm van de dikke darm en vervolgens darmepitheel. Dit maakt het protocol geschikt voor het bestuderen van zowel darmontwikkeling als toepassingen voor ziektemodellering.

Samenvatting

hiPSC-afgeleide darmorganoïden zijn epitheelstructuren die zichzelf assembleren uit gedifferentieerde cellen tot complexe 3D-structuren, representatief voor het menselijke darmepitheel, waarin ze crypte/villusachtige structuren vertonen. Hier beschrijven we de generatie van hiPSC-afgeleide darmorganoïden door de stapsgewijze differentiatie van hiPSC's tot definitief endoderm, dat vervolgens wordt geposterioriseerd om het epitheel van de dikke darm te vormen voordat het wordt overgebracht naar 3D-kweekomstandigheden. De 3D-kweekomgeving bestaat uit extracellulaire matrix (ECM) (bijv. Matrigel of andere compatibele ECM) aangevuld met SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 en CHIR99021. Organoïden ondergaan elke 7 dagen passaging, waar ze mechanisch worden verstoord voordat ze worden overgebracht naar een verse extracellulaire matrix en mogen uitzetten. QPCR en immunocytochemie bevestigen dat hiPSC-afgeleide darmorganoïden volwassen darmepitheelceltypen bevatten, waaronder bekercellen, Paneth-cellen en enterocyten. Bovendien vertonen organoïden tekenen van polarisatie door expressie van villine gelokaliseerd op het apicale oppervlak van epitheelcellen.

De resulterende organoïden kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van de menselijke darm te modelleren, evenals tal van menselijke darmziekten, waaronder inflammatoire darmaandoeningen. Om darmontsteking te modelleren, kunnen organoïden worden blootgesteld aan ontstekingsmediatoren zoals TNF-α, TGF-β en bacteriële LPS. Organoïden die worden blootgesteld aan pro-inflammatoire cytokines vertonen als reactie daarop een inflammatoir en fibrotisch fenotype. Het koppelen van gezonde versus hiPSC's afkomstig van patiënten met IBD kan nuttig zijn bij het begrijpen van mechanismen die IBD veroorzaken. Dit kan nieuwe therapeutische doelen en nieuwe biomarkers aan het licht brengen om te helpen bij een vroege diagnose van de ziekte.

Inleiding

De eigenschappen van pluripotente stamcellen (PSC's), zoals zelfvernieuwing en het vermogen om te differentiëren naar elk celtype van het menselijk lichaam, maken ze tot waardevolle hulpmiddelen bij de studie van ontwikkeling, ziektepathologie en het testen van geneesmiddelen^. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn bijzonder nuttig voor ziektemodelleringsstudies, omdat ze kunnen worden afgeleid van patiënten en rechtstreeks het genoom vastleggen dat verantwoordelijk is voor het ziektefenotype ^2,3. Dergelijke hiPSC's kunnen worden gedifferentieerd naar het celtype dat door het genetische defect wordt aangetast, waardoor het moleculaire mechanisme van de ziekte zorgvuldig kan worden onderzocht⁴.

Differentiatieprotocollen voor menselijke PSC's zijn gericht op het sturen van differentiatie van cellen via de belangrijkste ontwikkelingsstadia door activering of remming van specifieke signaalroutes die de afstammingsverbintenis en specificatie regelen. Het handhaven van hiPSC in een pluripotente toestand vereist matige niveaus van Activine A (Act-A)-signalering, terwijl een hoge dosering Act-A gedurende 3 dagen hiPSC verplicht tot een definitief endoderm (DE) lot ^5,6. Act-A- en Wnt-routes leiden de anterieure-posterieure identiteit van de DE. Signalering door Act-A induceert voordarm (FG) markers zoals HHEX, HNF4α en GATA4, terwijl de expressie van achterdarm (HG) genen zoals CDX2 wordt geblokkeerd. Wnt-signalering induceert posteriorisatie van de DE, die vervolgens een HG-genexpressieprofiel ^7,8 aanneemt. Zodra de identiteit van HG-cellen is vastgesteld, kan de differentiatie worden verplaatst van 2D naar 3D en gericht zijn op de vorming van darmorganoïden.

Intestinale organoïden worden meestal gekweekt in een 3D extracellulaire matrix (bijv. Matrigel of andere compatibele ECM's) gebaseerd kweeksysteem⁹, bestaande uit laminine, collageen IV en entactine en verrijkt met groeifactoren zoals EGF, FGF, PDGF en IGF-1 om bij te dragen aan de ondersteuning van overleving en proliferatie. De organoïden worden gekweekt in een gedefinieerd medium dat Gastrine, Noggin en CHIR bevat om de groei en proliferatie van darmstamcellen tijdens langdurige kweek te stimuleren en te ondersteunen.

Nadat darmepitheelcellen zijn ingebed in de extracellulaire matrix, beginnen darmcrypten zich te vormen en uit te zetten en uiteindelijk sferoïden te vormen. Deze rijpen uit tot organoïde structuren die het fysiologisch functioneren van het darmepitheel nabootsen. Organoïden kunnen doorgaans langer dan 1 jaar worden gekweekt zonder significant verlies van functionele en genexpressieprofielen. Passaging is wekelijks vereist met behulp van enzymatische vertering van de organoïden in kleinere fragmenten die vervolgens zichzelf weer in elkaar zetten tot complete organoïden.

Gevestigde organoïdelijnen kunnen worden gebruikt als een betrouwbaar model van tal van aandoeningen die verband houden met de darm, waaronder de ziekte van Crohn, colitis ulcerosa en colorectale kankers 10,11,12,13. Dit is een voorkeursmodel voor dierlijke cellen, omdat ze menselijke genen tot expressie brengen die verband houden met deze aandoeningen en reageren op externe stimuli die meer lijken op die in menselijk weefsel in vivo.

Protocol

OPMERKING: Al het weefselkweekwerk dat hieronder wordt beschreven, moet worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap van klasse II.

1. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) differentiatie naar het endoderm van de dikke darm

1. Om een celkweekkolf te coaten met extracellulaire matrix, berekent u eerst de benodigde hoeveelheid matrix. Hier is een voorbeeld van een plaat met 12 putjes die is gecoat met Matrigel. Bereken de benodigde hoeveelheid extracellulaire matrix om een plaat met 12 putjes te coaten. Gebruik de volgende formule:
   
   OPMERKING: Smeer celkweekschalen in met extracellulaire matrix naar keuze. Gebruik bij gebruik van Matrigel 24 uur vóór het zaaien een concentratie van 0,035 mg/cm² voor differentiatie. Controleer de batchconcentratie van de extracellulaire matrix op het productblad en bereid kleinere aliquots voor voorafgaand aan experimenten volgens de instructies van de fabrikant.
2. Verdun de benodigde hoeveelheid extracellulaire matrix in koude DMEM-media met behulp van een p1000-pipet.
3. Meng goed met een stripette van 5 ml.
4. Voeg 500 μL verdunde matrix toe aan elke putplaat. Schud de plaat voorzichtig om de verdunde extracellulaire matrix gelijkmatig te verdelen en incubeer gedurende minimaal 12 uur bij 37 °C.
5. Voordat u cellen op de plaat zaait, wast u elk putje met 500 μL PBS om overtollige extracellulaire matrix te verwijderen. Dit voorkomt celloslating tijdens de differentiatie.
6. Laat de laatste was in de putjes staan tot het klaar is om te zaaien om uitdroging van de extracellulaire matrix te voorkomen.
7. Om te zaaien voor hiPSC-differentiatie naar definitief endoderm (DE) of dikke darm (HG), neemt u een kolf met hiPSC's gekweekt in een onderhoudsmedium naar keuze (bijv.: essentiële 8-media) en zuigt u de media op. (Hier zaaien we cellen met 25.000 cellen/^cm2).
   OPMERKING: De zaaidichtheid is cruciaal voor een succesvolle differentiatie en moet worden geoptimaliseerd voor elke individuele hiPSC-cellijn.
8. Was de cellen in de kolf met 5 ml PBS. Zuig de PBS op.
9. Voeg 2,5 ml celdissociatieoplossing (bijv. TrypLE) toe en laat 4 minuten op RT staan. Zuig de celdissociatieoplossing op en tik zachtjes op de kolf om de cellen los te maken.
10. Spoel de kolf met 5 ml DMEM-media die zijn opgewarmd tot 37 °C en verzamel alle cellen in een buis van 15 ml.
11. Neem 10 μL geresuspendeerde celoplossing en meet de celdichtheid met een hemocytometer.
12. Neem voldoende van de celsuspensie om 1,05 x 10⁶ cellen te verzamelen en plaats deze in een buisje van 15 ml.
13. Centrifugeer op 160 x g gedurende 3 min. Terwijl de cellen worden gecentrifugeerd, zuigt u PBS op uit de met extracellulaire matrix beklede plaat met 12 putjes.
14. Na het centrifugeren het supernatans opzuigen en de celpellet resuspenderen in 12 ml onderhoudsmedia met ROCK-remmer (10 μM).
15. Voeg met behulp van een p1000-pipet 1 ml celsuspensie toe aan elk putje van de plaat met 12 putjes. Resuspendeer de cellen goed om een gelijkmatige verdeling tussen de putjes te garanderen.
16. Schud de plaat voorzichtig om de cellen in de putjes van de plaat te verdelen, maar vermijd het ronddraaien van de media, omdat dit de cellen in het midden van de putjes zal concentreren.
17. Plaats in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ .
18. Verander media 24 uur na het zaaien alleen naar onderhoudsmedia (bijv. essential 8 media) (geen ROCK-remmer).
19. Om te beginnen met differentiatie naar DE, bereidt u de basale media van het endoderm voor volgens tabel 1.
    OPMERKING: Aan het begin van de differentiatie moeten de cellen tussen de 60-80% samenvloeiing hebben.
20. Bereid 12 ml DE-media voor door Activine A (100 ng/ml) en Wnt3 (50 ng/ml) toe te voegen aan de basale media van het endoderm.
21. Verwarm het medium tot 37 °C.
22. Zuig media op uit elk putje van de weefselkweekplaat of -kolf.
23. Start de DE-differentiatie door 1 ml DE-media toe te voegen aan elk putje van de plaat met 12 putjes.
24. Bereid 24 uur na het starten van de DE-differentiatie (D1 DE) nieuwe DE-media voor en voer de mediawissel uit.
25. Herhaal stap 1.24 na 48 uur (D2 DE). Als er in dit stadium veel celdood aanwezig is, was dan alle putjes met 500 μL PBS voordat de media worden vervangen.
    OPMERKING: Om een succesvolle endodermdifferentiatie te bevestigen, voert u flowcytometrie uit om de expressie van SOX17 te beoordelen. Normaal gesproken verwachten we dat >80% van de cellen SOX17-positief is tegen D3 DE. Als de expressie van SOX17 suboptimaal is, moet de dichtheid van de celzaaiing worden geoptimaliseerd, evenals de concentraties van Act-A.
26. Begin op dit punt met HG-differentiatie, d.w.z. 72 uur na het begin van de DE-differentiatie. Bereid 12 ml HG-media voor door CHIR99021 (3 μM) en RA (1 μM) toe te voegen aan endoderm basale media (tabel 1).
    OPMERKING: Bij D3 DE had de cel een uniforme monolaag moeten vormen. Optimale DE-differentiatie is cruciaal voor verdere stadia van differentiatie.
27. Zuig DE-media op.
28. Start HG-differentiatie door 1 ml HG-media toe te voegen aan elk putje van de 12-wellsplaat.
29. Ga door met de differentiatie gedurende 4 dagen met dagelijkse mediawisselingen.
    OPMERKING: Om het succes van DE-posteriorisatie te bepalen, voert u flowcytometrie uit om de expressie van CDX2 te beoordelen. Normaal gesproken verwachten we dat >80% van de cellen CDX2-positief is. Als de posteriorisatie suboptimaal is, moet de concentratie van CHIR99021 worden geoptimaliseerd.
30. Om een monster voor RNA-extractie te verzamelen, zuigt u differentiatiemedia op en wast u het putje met 500 ul PBS.
31. Zuig PBS op en voeg een geschikt volume cellysebuffer toe uit een RNA-extractiekit.
32. Schraap met een p1000-pipet de bodem van het putje om ervoor te zorgen dat alle cellen lysis krijgen.
33. Zuig het cellysaat op en plaats het in een schone buis.
34. Ga verder met RNA-extractie of vries het lysaat in bij -20 °C totdat het klaar is voor RNA-extractie.
35. Voor immunokleuring differentiatiemedia opzuigen en putjes wassen met 500 μL PBS.
36. Aspireer de PBS en voeg 500 μL 4% PFA toe.
    OPMERKING: PFA is giftig. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en volg de lokale laboratoriumprocedures voor het verwijderen van PFA.
37. Incubeer bij 4 °C gedurende 20 min.
38. Verwijder PFA en was de putjes drie keer met 500 μL PBS.
39. Laat de laatste PBS-wasbeurt op de cellen zitten totdat ze klaar zijn om immunokleuring uit te voeren.

2. Passaging van darmorganoïden

1. Bereid intestinale basale media voor volgens tabel 2.
2. Om over te schakelen van 2D- naar 3D-celcultuur, gebruikt u een plaat met 6 putjes om DE-cellen te genereren die hiPSCS vormen. Maak de monolaag van cellen los van de 6-cellige plaat met behulp van een strip van 5 ml.
3. Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 400 x g om een celpellet te produceren.
4. Resuspendeer de celpellet in intestinale groeimedia die groeifactoren bevatten: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrine (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/ml), CHIR99021 (6 μM), ROCK-remmer (10 μM).
5. Voeg het juiste volume extracellulaire matrix toe, afhankelijk van het aantal putjes waarin wordt geplateerd. Dit kan worden berekend met behulp van de onderstaande vergelijkingen.
   [1] Totaal volume extracellulaire matrix/media (μL) = 30 μL * aantal putjes van 48-wells plaat
   [2] Benodigd volume van extracellulaire matrix (μL) = Antwoord van [1] * 2/3
   [3] Benodigd mediavolume (μL) = Antwoord van [1] * 1/3
6. Voeg 30 μL celsuspensie toe aan het midden van elk putje van een plaat met 48 putjes.
7. Incubeer de plaat minimaal 5 minuten in een incubator van 37 °C om de extracellulaire matrix te laten uitharden.
8. Zodra de extracellulaire matrixkoepels zijn uitgehard, voegt u 300 μL darmgroeimedia met alle groeifactoren toe aan elk putje.
9. Plaats de plaat terug in een incubator van 37 °C met 5% CO₂.
   OPMERKING: Als er na 48 uur geen organoïden kunnen worden waargenomen en/of er sprake is van significante celdood, moeten de ROCKi- en NOGGIN-concentraties mogelijk worden geoptimaliseerd.
10. Om de organoïden te passeren, observeert u de cellen onder een lichtmicroscoop om de dichtheid en grootte van organoïden te beoordelen en te bepalen of ze moeten worden gepasseerd.
11. Vervang celkweekmedia door ijskoud PBS.
    OPMERKING: Organoïdeculturen moeten ongeveer elke 5-7 dagen worden gesplitst. Passaging van darmorganoïdeculturen is vereist zodra er een opeenhoping van celresten zichtbaar is in het organoïdelumen en een vergeling van het omringende darmgroeimedium.
12. Maak organoïden en extracellulaire matrixbol mechanisch los van de plaat met behulp van een schrapende beweging met een strip van 5 ml.
13. Verzamel de organoïden van elk putje in een centrifugebuisje van 15 ml.
14. Centrifugeer de organoïdensuspensie op 400 x g gedurende 1 minuut om de organoïden te pelleteren. Zuig het supernatans op totdat het de bovenkant van de celpellet bereikt, wees voorzichtig bij het bereiken van de zichtbare extracellulaire matrixlaag.
15. Resuspendeer de pellet in 15 ml ijskoude PBS.
    NOTITIE: Deze stap dient om alle resterende extracellulaire matrix te wassen die niet is verwijderd tijdens de eerste centrifuge.
16. Centrifugeer op 400 x g gedurende 1 min. Zuig de media op tot de pellet, die de organoïden bevat.
17. Resuspendeer in 1 ml ijskoude PBS. Gebruik een p200-pipet om de intacte organoïden handmatig te verstoren door meerdere keren op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Observeer de grootte van de organoïden met behulp van een lichtmicroscoop om te bepalen of ze verder moeten worden gedissocieerd.
18. Voeg 9 ml media toe zonder groeifactoren.
19. Centrifugeer op 400 x g gedurende 1 min. Zuig het supernatans op tot de organoïden korrelen.
20. Bereken de benodigde hoeveelheid extracellulaire matrix en media met behulp van de onderstaande vergelijkingen:
    [1] Totaal volume extracellulaire matrix/media (μL) = 30 μL * aantal putjes van 48-wells plaat
    [2] Benodigd volume van extracellulaire matrix (μL) = Antwoord van [1] * 2/3
    [3] Benodigd mediavolume (μL) = Antwoord van [1] * 1/3
21. Resuspendeer de organoïdekorrel in het berekende volume darmmedia met groeifactoren (o.a. Noggin & ROCK-remmer).
22. Voeg het vereiste volume extracellulaire matrix toe aan deze celsuspensie en resuspendeer om een gelijkmatige verdeling van organoïden te garanderen.
23. Pipetteer 30 μl van deze suspensie in het midden van elk putje van een plaat met 48 putjes (bij voorkeur voorverwarmd in een incubator van 37 °C).
24. Plaats de plaat 5 minuten terug in een incubator van 37 °C totdat de extracellulaire matrix is uitgehard.
25. Bereid darmmedia voor met groeifactoren (+ ROCK-remmer) (ongeveer 17 ml per plaat met 48 putjes).
26. Voeg 300 μL toe aan elk putje.
27. Incubeer bij 37 °C bij 5% CO₂.
28. Na het passeren de media voor de darmorganoïden opzuigen en om de 2-4 dagen vervangen door verse darmmedia met groeifactoren (zonder Noggin & ROCK-remmer).
    OPMERKING: Als er na 48 uur geen organoïden kunnen worden waargenomen en/of er sprake is van significante celdood, moeten de ROCKi- en NOGGIN-concentraties mogelijk worden geoptimaliseerd.
    OPMERKING: Intestinale organoïden reageren in vivo op een reeks ontstekingsmediatoren. TNFα is een celsignaleringseiwit dat betrokken is bij verschillende ontstekingsprocessen.
29. Om een ontstekingsreactie in darmorganoïden op te wekken, bereidt u TNFα in een concentratie van 40 ng/ml alleen in basale media.
30. Zuig media op van een plaat met 48 putjes.
31. Voeg 300 μl bereide basale media toe die 40 ng/ml TNFα bevatten.
32. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C om een pro-inflammatoire omgeving na te bootsen.
    OPMERKING: Intestinale organoïden reageren in vivo op een reeks ontstekingsmediatoren. TNFα is een celsignaleringseiwit dat betrokken is bij verschillende ontstekingsprocessen.
33. Gooi alle resterende cellen weg door aspiratie in een vacuümval met 5% Trigene.

Resultaten

Een schema van het differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1A. Op dag 1 van het protocol moeten hiPSC's compact zijn en kleine kolonies vormen met een totale samenvloeiing van ongeveer 50-60%. 24 uur na inductie van differentiatie naar DE-cellen beginnen ze weg te migreren van de stamcelkolonies om een monolaag van cellen te vormen. Dit gaat door gedurende de volgende 3 dagen en zou een volledige monolaag moeten vormen op D3 van DE-differentiatie (Figuur 1). Genexpressie moet worden gecontroleerd in de loop van de differentiatie met pluripotentiemarkers (OCT4, NANOG, SOX2) die sterk tot expressie komen op D0 en snel worden gedownreguleerd tijdens DE-differentiatie. Tijdens DE-differentiatie zou T-expressie moeten pieken op D1, gevolgd door EOMES en MIXL op D2. Op D2 moeten DE-genen (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) tot expressie komen en pieken op D3 (Figuur 2 en Figuur 3). Cellen moeten een monolaag zijn door DE D3 en kunnen vervolgens worden geposterioriseerd in het endoderm van de dikke darm. Tijdens het posteriorisatie-evenement beginnen zich al vanaf D2 3D-structuren te vormen. Soms verschijnen ze echter pas op D4 of helemaal niet; dit is niet altijd een indicatie of de cellen al dan niet verder zullen gaan en darmorganoïden zullen vormen (Figuur 1). Tijdens HG-specificatie moet de expressie van CDX2 en HNF4a worden geïnduceerd en in de loop van de tijd toenemen (Figuur 3).

Na overdracht van 2D-celvellen naar extracellulaire matrix, zullen gedurende de eerste 24 uur klonten 2D-cellen worden waargenomen. Na 48 uur zouden de vellen cellen zich automatisch moeten organiseren in meer gecomprimeerde 3D-sferoïde structuren die aanvankelijk klein zijn (Figuur 4A) en vervolgens geleidelijk toenemen in grootte en complexiteit gedurende 7-10 dagen kweek (Figuur 4B en Figuur 4C). Organoïden mogen niet worden gepasseerd voordat ze een duidelijke organoïde/sferoïde morfologie hebben bereikt met duidelijk epitheel met het lumen naar het midden van de organoïde/sferoïde gericht (Figuur 4D). In dit stadium kan immunocytochemie worden gebruikt om de expressie van darmmarkers zoals villin en CDX2 te bevestigen (Figuur 5). Niet alle klonten van 2D-cellen zullen zich ontwikkelen tot organoïden en er zullen enkele besmette dode cellen in de extracellulaire matrix zijn. Deze dode vellen cellen moeten worden genegeerd totdat de overlevende cellen grote organoïden hebben gevormd en klaar zijn om te passeren.

Om ontstekingen te modelleren, kan TNFα gedurende 24-48 uur aan het weefselkweekmedium worden toegevoegd. Na incubatie met pro-inflammatoire moleculen worden organoïden geoogst met dezelfde techniek die wordt gebruikt voor hun isolatie en passaging en vervolgens gelyseerd met behulp van een celbuffercompatibele toepassing zoals QPCR of western blotting. Als kortere blootstellingen nodig zijn, moeten organoïden eerst uit de extracellulaire matrix worden verwijderd en worden blootgesteld aan TNFα in suspensie met behulp van een buisje van 1,5 ml. Behandeling van darmorganoïden met TNFα gedurende 48 uur induceert doorgaans de expressie van pro-inflammatoire markers (TNFα, IL1B, IL8, IL23) terwijl de expressie van intestinale epitheliale markers (LGR5, VIL) negatief wordt beïnvloed (Figuur 6).

Endoderm basale media		50 ml
RPMI 1640		48,5 ml
B27 Supplement		1 ml
1% NEAA		0,5 ml

Tabel 1: Samenstelling van endodermale basale media voor endodermdifferentiatie.

Intestinale basale media		50 ml
Geavanceerde DMEM/F12		46,5 ml
HEPES-buffer		0,5 ml
GlutaMAX		0,5 ml
Nicotinamide		0,5 ml
N2 Supplement		0,5 ml
B27 Supplement		1,0 ml
Pen/streptokokken		0,5 ml

Tabel 2: Samenstelling van intestinale basale media voor kweek van darmorganoïden

Figuur 1: Morfologische veranderingen tijdens differentiatie van hiPSC via definitief endoderm naar de achterdarmlijn.
(A) Schematisch overzicht van het intestinale differentiatieprotocol. Deze cellijn van hiPSC vormt losse kolonies van kleine cellen met een hoge verhouding tussen kern en cytoplasma. Naarmate de differentiatie vordert, ondergaan de cellen veranderingen die consistent zijn met de overgang van het epitheliale naar het mesenchymale fenotype en vormen ze door DE D3 een uniforme monolaag. Zodra de juiste signalen zijn afgegeven, strekken DE-cellen zich uit en vormen ze een dichter opeengepakte monolaag met 3D-sferoïden die verschijnen zodra HD D3 verschijnt, maar dit is afhankelijk van de gebruikte cellijn en is geen vereiste voor de overgang naar 3D-cultuur (B). Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Differentiatie van hiPSC's naar HG endoderm induceert expressie van endodermale genen.
Immunokleuring van hiPSC differentiërend naar definitief endoderm toont veranderingen in expressie van TF's op eiwitniveau. Pluripotentiemarkers (NANOG en OCT4) worden gedownreguleerd door DE D3 (A). Expressie van mesendodermmarker BRA(T) is aanwezig op D1 van het protocol (B) en DE-specifieke TF's SOX17 en FOXA2 verschijnen op D2 (B & C). Schaalbalk: 200 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Genexpressieveranderingen door qPCR tijdens hiPSC-differentiatie naar het endoderm van de dikke darm (HG).
Genen geassocieerd met pluripotentie worden neerwaarts gereguleerd (OCT4, NANOG, SOX2), gevolgd door voorbijgaande expressie van mesendodermgenen (T, EOMES, MIXL1), en tenslotte expressie van DE-genen (SOX17, FOXA2, CXCR4) en achterdarmgenen (CDX2, GATA4, HNF4a). Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ±SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: HG endoderm assembleert zichzelf om 3D darmorganoïden te vormen in 3D extracellulaire matrixcultuur.
HG endoderm wordt overgebracht naar een geschikte 3D extracellulaire matrixcultuur en vormt in eerste instantie kleine vaste klompjes cellen (A). Klompen HG-endoderm breiden zich uit gedurende 7-10 dagen kweek (B) en worden dan asymmetrisch en beginnen een complexer epitheel (C) te vormen, wat uiteindelijk aanleiding geeft tot organoïden met een duidelijke epitheelmorfologie en een luminaal oppervlak dat naar het midden van de organoïde is gericht (D). Schaalbalken = 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vastgestelde hiPSC-afgeleide darmorganoïden brengen darmmarkers tot expressie.
Immunocytochemie die expressie van CDX2 en Villin aantoont. Schaalbalken = 100 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Effect van TNFα op het ontstekingsprofiel en de darmcelexpressie van gezonde darmorganoïden.
Inflammatoir profiel van gezonde organoïden in de dikke darm na 48 uur behandeling met TNFα (40 ng/ml). De expressie van pro-inflammatoire markers (TNFα, IL-8 en IL-23) neemt toe na blootstelling aan TNFα, terwijl tegelijkertijd de expressie van intestinale epitheliale markers (LGR5, VIL) wordt verlaagd. Statistische analyses werden uitgevoerd door middel van tweezijdige t-toets van de student. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van elke groep. *Blz < .01; **Blz < .001; Blz < .0001. (n=3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een protocol voor de differentiatie van menselijke pluripotente cellen tot menselijke darmorganoïden. We demonstreren hun gebruik om ontstekingen te bestuderen; dit kan echter worden toegepast op verschillende contexten, en in combinatie met CRISPR/Cas9-genbewerkingsbenaderingen¹⁴, op elke genetische achtergrond. Eenmaal gedifferentieerd, volgens de natuurlijke ontwikkelingsdifferentiatiesequentie van definitief endoderm, endoderm in de dikke darm en vervolgens darmepitheel, kunnen de resulterende organoïden continu worden gekweekt en gedurende meer dan 12 maanden worden gepasseerd.

Een cruciaal aspect van dit protocol is de initiële platingdichtheid van ongedifferentieerde stamcellen voorafgaand aan endodermdifferentiatie. Als dit niet voldoende wordt geoptimaliseerd, zullen cellen waarschijnlijk afsterven tijdens de eerste DE-differentiatiestap (als de cellen te schaars zijn) of de efficiëntie van de DE-differentiatie verminderen (als de cellen te dicht zijn). De juiste begindichtheid moet worden geoptimaliseerd voor de cellijn die wordt gebruikt, en de juiste dichtheid moet een monolaag genereren tegen het einde van DE D3. Flowcytometrie moet worden gebruikt om de efficiëntie van DE-specificatie te bepalen en we zien doorgaans >80% van de cellen positief voor SOX17 en/of CXCR4. Wanneer het aantal SOX17-positieve cellen minder dan 60% is, wordt de efficiëntie van HG-patronen beïnvloed, wat resulteert in de vorming van minder organoïden wanneer ze worden overgebracht naar de extracellulaire matrix. Dit zal er uiteindelijk toe leiden dat de resulterende organoïdeculturen mislukken. Om te bepalen of patroonvorming van DE naar HG succesvol is geweest, beoordelen we het aantal CDX2-positieve cellen door middel van flowcytometrie en verwachten we doorgaans >80% positieve cellen te zien. Nogmaals, als het aantal CDX2-positieve cellen onder de 50% daalt, zal dit een nadelig effect hebben op het aantal darmorganoïden dat wordt gegenereerd wanneer het wordt overgebracht naar 3D extracellulaire matrixcultuur.

Na de overdracht van 2D-monolagen in 3D-cultuur zouden 24-48 uur na de overdracht kleine compacte bolletjes moeten verschijnen. Er kunnen grote vellen dode cellen verschijnen, afhankelijk van de differentiatie-efficiëntie voor de gebruikte cellijn. In plaats van onmiddellijk culturen door te geven om dit puin te verwijderen, laten we de organoïden zich volledig vormen en hun complexere, gevouwen structuur ontwikkelen. 7-10 dagen wachten voordat u de eerste passage probeert, zorgt ervoor dat er voldoende delende cellen aanwezig zijn om veel nieuwe darmorganoïden te genereren. Al het puin dat nog in de kweek aanwezig is, kan tijdens het passagingproces gemakkelijk worden verwijderd door de gedissocieerde organoïde/puinmengsels langzaam in een buis te draaien met voldoende snelheid om de organoïden te pelleteren, maar een vel cellen in de media te laten drijven. Media en celresten kunnen dan worden opgezogen, zodat alleen de korrel organoïden overblijft.

De beperking van deze benadering is dat hiPSC-afgeleide celtypen vaak niet volledig volgroeid zijn in termen van genexpressie en functionele profielen. Om te bepalen of hiPSC-afgeleid darmweefsel geschikt is voor specifieke toepassingen, moeten de organoïden worden gekarakteriseerd voor verschillende celtypen, waaronder enterocyten (VIL), entero-endocriene cellen (neurog3), bekercellen (MUC2), voorbijgaande amplificerende cellen (CD133), panethcellen (FZD5) en LGR5⁺ stamcellen (LGR5) om de organoïde cellulaire samenstelling te bepalen.

Over het algemeen is het grote voordeel van dit protocol ten opzichte van veel andere organoïdedifferentiatieprotocollen dat dit kweekplatform zeer kosteneffectief is door vervanging van verschillende recombinante eiwitten en geconditioneerde mediapreparaten door kleine moleculen^15,16. De differentiatie in HG is zeer eenvoudig en snel en kan worden toegepast op zowel menselijke embryonale als geïnduceerde pluripotente stamcellen met identieke uitkomsten. Wanneer het rigoureus wordt gevolgd en geoptimaliseerd voor de cellijnen die worden gebruikt, biedt het een relatief eenvoudig modelplatform dat vrij is van besmetting van mesenchymale cellen die vervolgens kunnen worden toegepast om darmepitheel te bestuderen in verschillende contexten, waaronder ontsteking, interacties tussen gastheerpathogenen⁷. Modellering van intestinale fibrose kan worden onderzocht door pro-fibrotische stimuli te geven en vervolgens de expressie van extracellulaire matrixeiwitten zoals collageen, laminine en fibronectine te beoordelen door QPCR, western blot en ELISA. Het gebruik van CRISPR/Cas9-genbewerkingstechnieken op ongedifferentieerde stamcellijnen voorafgaand aan differentiatie maakt het mogelijk om organoïden voor genknock-out of eiwitoverexpressie te creëren die kunnen worden gebruikt om ziektespecifieke organoïden en complexere ziektemodellen te creëren 14,17,18.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A83-01	Tocris	2939
Activine A	R&D	338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X)	Life Technologies	12654-010
B27 supplement	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
Epidermale groeifactor	R&D Systems	236-EG-01M
Gastrine	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
Growth Factor reduced Matrigel	BD
HEPES Buffer oplossing (1M)	Life Technologies	15630-080
N2 Supplement (100X)	Gibco	17502-048
N-acetyl-cysteïne	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R&D Systems	6057-NG
Niet-essentiële aminozuren	Gibco	11140-050
Paraformaldehyde	VWR	9713.5
Penicilline/Streptomycine	Gibco	15140122
Fosfaatbufferoplossing	Gibco	14190-094
Retinoïnezuur	Sigma	302-79-4
ROCK remmer	Tocris	1254/1
ROCK remmer Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R&D	5036-WN