Een Drosophila Model om wound-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen

Samenvatting

Wond-geïnduceerde polyploïdie is een geconserveerde weefsel herstel strategie waar cellen groeien in grootte in plaats van te delen om te compenseren voor celverlies. Hier is een gedetailleerd protocol over hoe de fruitvlieg te gebruiken als een model om ploidy en de genetische regulatie in epitheelwond herstel te meten.

Samenvatting

Polyploïdie is een frequent verschijnsel waarvan de impact op de organisatie en de ziekte nog steeds slecht wordt begrepen. Een cel wordt gedefinieerd als polyploid als het meer dan de diploïde kopie van zijn chromosomen bevat, wat het gevolg is van endoreplicatie of celfusie. Bij weefselherstel blijkt dat de door wond geïnduceerde polyploïdie (WIP) een geconserveerde genezingsstrategie is van fruitvliegjes tot gewervelde dieren. WIP heeft verschillende voordelen ten opzichte van celproliferatie, waaronder resistentie tegen oncogene groei en genotoxische stress. De uitdaging is geweest om te bepalen waarom polyploïde cellen ontstaan en hoe deze unieke cellen functioneren. Voorzien is een gedetailleerd protocol voor het bestuderen van WIP in het volwassen fruitvliegeptheel waar polyploïde cellen worden gegenereerd binnen 2 dagen na een punctiewond. Profiterend van d. melanogaster's uitgebreide genetische tool kit, de genen die nodig zijn om te starten en te reguleren WIP, met inbegrip van Myc, zijn begonnen te worden geïdentificeerd. Voortdurende studies met behulp van deze methode kan onthullen hoe andere genetische en fysiologische variabelen, waaronder geslacht, dieet, en leeftijd reguleren en invloed op wip's functie.

Inleiding

Drosophila melanogaster is een aantrekkelijk modelsysteem om de cellulaire en moleculaire mechanismen van epitheliale wondherstel te bestuderen. Net als bij zoogdieren zijn de gebruikte weefselherstelmechanismen afhankelijk van zowel het weefsel als de ontwikkelingsfase. Scarless wondgenezing vindt plaats in het fruitvliegembryo waar een actomyosine "purse string" ontstaat aan de epitheelvoorkant waardoor de wond naadloos^1,2kan sluiten . Post-embryonale wondgenezing in larven, poppen en volwassen fruitvliegjes resulteert in extracellulaire matrixherinrichting, melaninelittekenvorming en epitheliale celgroei^3,4,,5,6. De epitheelcellen worden groter door celfusie en de endocycle, een onvolledige celcyclus die mitose^3,4,7,8omzeilt . Als gevolg hiervan wordt celverlies gecompenseerd door polyploïde celgroei in plaats van celdeling. De volwassen vlieg achterdul, midgut, en folliculair epitheel ook vertrouwen op polyploïde celgroei te compenseren voor celverlies na weefselschade^9,10,11.

Polyploïdie is een bekend aspect van de organismale ontwikkeling bij planten en insecten, maar in de afgelopen jaren is het duidelijker geworden dat polyploïdie een geconserveerde weefselherstelstrategie is bij gewervelde dieren¹². De zebravis, die de capaciteit heeft om zijn hart te regenereren, vertrouwt op polyploïde celgroei om beschadigde epicardium¹³te helen. Polyploïdie draagt ook bij aan leverregeneratie van zoogdieren en niertubule epitheelreparatie na acuut letsel^14,15. In deze voorbeelden worden polyploïde cellen gegenereerd door endoreplicatie via endocycle of endomitose, wat resulteert in een binucleated cel als gevolg van een blok in cytokinese¹². Het raadsel is de reden waarom polyploïde cellen ontstaan tijdens wondherstel en hoe polyploïdie de weefselfunctie beïnvloedt. Recente studies hebben nieuw inzicht gegeven in de vraag of polyploïdie een helingvoordeel of nadeel biedt. In zebravis epicardium, polyploïdie verbeterde de snelheid van wondgenezing¹³. In D. melanogaster hindgut en zoogdierlever bleek polyploïdie beschermend te zijn tegen oncogene groei^11,14. Bij volwassen vliegeptheel werd onlangs vastgesteld dat polyploïdie wondherstel mogelijk maakt in aanwezigheid van genotoxische stress¹⁶. Endoreplicatie is bestand tegen DNA-schade, waardoor wondgenezing wanneer celproliferatie anders zou worden aangetast¹⁷. Voor cardiomyocyten in muis- en zebravisharten vertraagt polyploïdie echter de genezing, wat resulteert in verbeterde littekenvorming^18,19. Daarom kan polyploïdie, afhankelijk van het orgaan- en/of celtype, een heilzame of schadelijke weefselherstelstrategie zijn. De toegankelijkheid van D. melanogaster genetica in combinatie met analyse van de wond-geïnduceerde polyploïdie (WIP) respons maken het een ideaal model systeem voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die deze wondgenezing strategie begeleiden.

Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van WIP in het volwassen D. melanogaster epitheel. Inbegrepen zijn instructies voor fruitvliegletsel, dissectie, immunostaining, montage, beeldvorming en analyse van re-epithelialisatie, celfusie en endoreplicatie (ploidy). De beeldvorming en ploidy analyse kan ook worden aangepast aan andere modellen om te testen of WIP optreedt. Opgemerkt moet worden dat met een toename van het nucleaire DNA-gehalte vaak een overeenkomstige toename van de nucleaire omvang is. Er zijn echter veel voorbeelden in de biologie waar de nucleaire omvang geen overeenkomstige verandering in ploidy²⁰weerspiegelt. Nog meer voorzichtigheid moet worden genomen bij de interpretatie van de nucleaire grootte in de context van een wondomgeving waar cellen zich vaak zullen verspreiden of uitrekken om de wondplaats te bedekken. Daarom is het enige definitieve bewijs van verandering in ploidy het meten van DNA-inhoud met deze methode (of anderen, zoals hele genoom sequencing)²¹. Deze methode verhoogt de geschiktheid van de volwassen D. melanogaster buikeptheel als een model om de rol en regulering van polyploïdie in wondherstel te bestuderen.

Protocol

1. Enscenering en wond van volwassen fruitvliegjes

1. Selecteer D. melanogaster stam van keuze (d.w.z., epi-Gal4/ UAS stam, zie Tabel van Materialen).
   OPMERKING: Hier wordt het Gal4/UAS-systeem gebruikt om epitheliale specifieke genexpressie (epi-Gal4) van een gen of RNAi gecodeerd stroomafwaarts van UAS mogelijk te maken. Deze studie maakt gebruik van fluorescerend membraaneiwit (UAS-Cd8.mRFP), mitotische inducer (UAS-fzr^RNAi, UAS-stg) en WIP-remmer (UAS-E2F1^RNAi; UAS-Rac^DN).
2. Verzamel twee flesjes van 10-15 nieuw ingesloten vrouwelijke fruitvliegjes elk en leeftijd op verse voedsel flesjes op 25 °C tot 3-5 dagen oud. Een flesje zal dienen als de ongewonde controle en de andere flacon zal gewond raken zoals hieronder beschreven. De vrouwelijke vliegen moeten worden gehandhaafd met mannetjes (~ 5 /flacon).
3. Om de vliegen te verwonden, monteren verschillende pinhouders elk met een enkele 0,10 mm roestvrijstalen pin. Zorg ervoor dat het scherpe uiteinde van de pin naar buiten gericht is. Pinnen kunnen gemakkelijk buigen of chipen na het doorboren van de vlieg en verslaafde of beschadigde pinnen moeten worden weggegooid.
4. Verdoof de oude vrouwelijke fruitvliegjes op een CO_{2-vliegkussen}onder een stereomicroscoop en lijn ze uit in een rij met behulp van een penseel. Het dragen van een veiligheidsbril, het houden van de pin houder in de ene hand en tangen in de andere, gebruik tangen om een vlieg positie met zijn ventrale buik naar boven.
5. Doorprik het volwassen vrouwtje vliegt binnen het epitheel pleuraatgebied van tergiet A4 aan weerszijden van de ventrale middellijnventen(figuur 1A). Doorspekteren dit ventrale gebied biedt optimale ruimte weg van de dissectie sites waar weefsel randen zullen worden gescheurd door mechanische verwerking.
6. Breng gewonde vliegen terug naar het voedsel flesje en leeftijd naar de gewenste dag na letsel (dpi). Epitheelwondengenezing begint bij 1 dpi en eindigt met 3 dpi. Endoreplicatie pieken op 2 dpi, wat ideaal is voor de EdU-test (punt 4, figuur 2).

2. Vlieg buikdissectie

OPMERKING: Tijdens deze stap is het belangrijk om te voorkomen dat het ventrale buikweefsel wordt aangeraakt met de dissectiegereedschappen, omdat het de integriteit van het epitheel in gevaar brengt.

1. Verkrijg alle benodigde materialen voor ontleding: Grace's oplossing, tangen, Vanna's Spring Scissors, 0,10 mm pinnen, ontleedplaten, 9 goed glazen dissectieschotel, fixatieve oplossing (4% paraformaldehyde in 1x PBS), 1x PBS, doekjes, pipettes en tips voor 30 μm, en handschoenen (zie Tabelmaterialen).
2. Bevestig dat vliegen met succes gewond zijn geraakt door het verdoven van gewonde vliegen op een CO_{2-vliegkussen}onder een stereomicroscoop en controleren op de aanwezigheid van het wondlitteken (d.w.z. een melaninevlek op de buik, zie figuur 1B). Gooi vliegen weg uit de experimentele groep die niet met succes gewond raakten.
3. Om te beginnen dissectie, vul een put van een 9 goed glazen dissectie schotel met Grace's oplossing. Gebruik een paar tangen om een gewonde vrouwelijke vlieg te grijpen door de rugzijde van de thorax en dompel de vlieg onder in de put met Grace's oplossing.
4. Met behulp van tangen in de andere hand zonder het vrijgeven van de thorax, punctie de dorsale cuticula onder tergite A6 en trek de cuticula van de achterkant van de fruitvlieg. De inwendige organen (eierstok en darm) zal meestal komen bij deze stap. Zo niet, duw dan voorzichtig op de rugzijde van de buik met de tangen om de resterende organen eruit te persen en in een lege put te gooien.
5. Klik uit de volle buik bij de thoraxverbinding boven tergite A2 met behulp van de tangen en breng de buik over naar een lege put met ~100 μL van Grace's oplossing.
6. Herhaal stappen 2.3-2.5 totdat alle vliegenbuiken zijn ontleed.
7. Verminder het volume van Grace's oplossing tot 30 μL in de put met gepoolde, ontleedbuik.
8. Fileer de buiken open door de positie van de buik op de rugzijde met de tangen in de ene hand en vervolgens het invoegen van het onderste blad van van vanna's lente schaar in de buikholte met de andere hand. Snijd langs de dorsale middellijn tot de buik volledig is geopend, wat tot drie sneden kan vereisen(figuur 1C, 1D).
9. Zet een droge ontleedplaat met vier pinnen van 0,10 mm per buikbevestigingsgebied. Elke 35 mm ontleden plaat past maximaal zeven montagegebieden. Pipette 30 μL van Grace's oplossing op elk montagegebied en breng één gefileerde buik over naar elke druppel.
10. Speld de gefileerde buiken aan de schotel op de vier rughoeken(figuur 1E). Zorg ervoor dat het weefsel plat ligt zonder het buikweefsel te scheuren of te overbelasten.
11. Om het weefsel te repareren, pipet uit de Grace's oplossing en voeg 30 μL van de fix oplossing aan de vastgemaakte buik.
    LET OP: Draag handschoenen tijdens het hanteren van de fix oplossing, omdat paraformaldehyde giftig is.
12. Herhaal stappen 2.10-2.11 totdat alle gefileerde buiken op de ontleedplaat zijn gespeld.
13. Plaats een tape label op de bodem van elk gerecht om elke controle en experimentele groep te markeren. Fix monsters voor 30-60 min op kamertemperatuur (RT).
14. Was de oplossing door op elke plaat op 1,5 mL van 1x PBS te pipetten. Gooi fixoplossing en kunststoffen in geschikte containers voor vloeibaar of droog chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.
15. Was platen 2x met 1,5 mL 1x PBS en bewaar vast weefsel bedekt met 1,5 mL van 1x PBS in een plastic container met deksel. Voeg een laag vochtige papieren handdoek toe aan de bodem van de container en bewaar monsters op 4 °C tot ze binnen 1 week na de ontleding klaar zijn om immunostain.

3. Immunofluorescentie

1. Reagentia vers bereiden (zie tabel met materialen):wasbufferoplossing (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA in 1x PBS). Restjes wasbuffer kan worden opgeslagen bij 4 °C en gebruikt worden voor de duur van het 2-daagse kleuringsprotocol. Bereid voldoende primaire antilichaamoplossing per test (Figuur 2) met behulp van Anti-FasIII (1:50 muis anti-Fasciclin-III) in wasbuffer met ofwel anti-Grh (1:300 affiniteit gezuiverd konijn anti-Grainyhead⁸) of anti-RFP (1:1,000 konijn anti-RFP). Primaire antilichaamoplossingen kunnen bij 4 °C worden opgeslagen en meerdere keren worden hergebruikt totdat het signaal aanzienlijk wordt verminderd.
2. Doordring weefsel door pipetting off 1x PBS, het toevoegen van 1,5 mL wasbuffer, en incubatie voor ten minste 30 min op een orbitale shaker (80 rpm) bij RT.
3. Verwijder 's nachts wasbuffer en vlekweefsel met 1,5 mL primaire antilichaamoplossing, uitbroeden op een orbitale shaker (80 rpm) bij 4 °C. Verzamel de primaire antilichaamoplossing en bewaar in een buis bij 4 °C voor toekomstige experimenten.
4. Spoel het monster eerst snel af met 1x PBS en was vervolgens 3x met 1,5 mL wasbuffer. Voor elke wasbeurt, incubeer monsters op RT op een orbitale shaker gedurende ten minste 30 min.
5. Bereid tijdens de laatste wasoplossing de secundaire antilichaamoplossing voor: 1:1.000 ezelanti-konijn Alexa 488 of 568 en 1:1.000 geitantimuis Alexa 488 of 568 (of fluorofoof naar keuze) in wasbuffer.
6. Verwijder wasbuffers en vlekweefsels met 1,5 mL secundaire antilichaamoplossing. Bedek monsters met aluminiumfolie en incubaal op een orbitale shaker bij RT voor 3 uur. Als alternatief kunnen monsters 's nachts bij 4 °C worden geïncubeerd op een orbitale shaker.
7. Was de monsters door eerst secundaire antilichaamoplossing weg te gooien en spoel het monster vervolgens snel af met 1x PBS, gevolgd door drie wasbeurten met 1,5 mL wasbuffer. Voor elke wasbeurt, incubeer monsters op RT op een orbitale shaker gedurende ten minste 30 min.
8. Bereid de DAPI-oplossing voor door DAPI te verdunnen tot 10 μg/mL in wasbuffer. Na de laatste wasbeurt, vlek monsters met 1,5 mL DAPI oplossing uitbroeden op RT gedurende 30 min.
9. Gooi DAPI-oplossing weg en spoel monsters 2x in 1,5 mL van 1x PBS. Bewaar gekleurd weefsel in 1,5 mL van 1x PBS in het donker, bedekt met aluminiumfolie, bij 4 °C tot klaar om te monteren op een glazen glijbaan met coverslip. De montagestap moet binnen 1 week worden uitgevoerd.

4. Celcyclusactiviteit (EdU-test)

1. Maak een edu-voorraadoplossing van 10 mM uit click-iT-kit (zie tabel van materialen)door EdU-poeder op te lossen in dH₂0 en ~15 min te mengen tot het volledig is opgelost. De voorraadoplossing kan worden gespalteerd (250 μL per buis) en opgeslagen bij -80 °C.
2. Voer vliegt EdU door eerst verdunnen EdU voorraad tot 5 mM in dH₂O. Voeg droge gist totdat de oplossing is troebel en kort vortex te mengen. Snijd een 0,5 mL tube cap en plaats deze op de bodem van de vliegvoedsel flacon. Duw de dop in het voedsel, dus het is stabiel.
3. Verdoven de vliegen en transfer 3-5 dagen oude vliegt in de flacon. Tik op de vliegen tot een rand, zodat niemand vast zitten in de dop.
4. Pipette 75 μL gist-EdU oplossing in de dop. Vliegen moeten worden gevoed verse gist-EdU oplossing elke dag en overgebracht naar een vers voedsel flesje met een dop om de andere dag om ervoor te zorgen dat de vliegen niet vast komen te zitten in de bodem van de flacon.
5. Om vliegen over te brengen, flip naar een nieuwe flacon met een pet, zet vliegen in slaap, tik vliegen aan de ene kant, en voeg verse gist-EdU oplossing.
6. Op de derde dag verwonden de vliegen en blijven gist-EdU voeden tot dissectie op 2 dpi (Figuur 4A). Zie protocolsectie 2 voor dissectie- en fixatiemethoden.
7. Edu-kleuringsrensiaaten voorbereiden: wasbuffer (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA in 1x PBS), permeabilisatiebuffer (0,5% Triton X 100 in 1x PBS), blokkerende buffer (3% BSA in 1x PBS) en reagentia voor te bereiden uit de EdU-testkit (zie Tabel van Materialen),inclusief 1x reactiebuffer en 1x reactiebufferadditief zoals aangegeven door de fabrikant.
8. Was monsters voor 1 uur, mengen op RT in 1,5 mL wasbuffer.
9. Voeg 1,5 mL permeabilisatiebuffer en incubeermonsters toe gedurende 20 minuten.
   LET OP: Ontdooi en bereid reactiecocktailoplossing met een volume van 500 μL/plaat.
10. Was monsters 1x snel met 1x PBS en dan 3x snel met 1 mL blokkeerbuffer.
11. Pipette uit alle resterende blokkeerbuffer en voeg 500 μL reactiecocktailoplossing per plaat toe. Draai platen om ervoor te zorgen weefsels zijn volledig bedekt. Incubeer in een lade in het donker voor 1 uur op RT.
12. Was monsters 1x snel met 1,5 mL blokkeerbuffer.
13. Vlek met 1,5 mL DAPI-oplossing op 1:5.000 in wasbuffer gedurende 30 minuten.
14. Was 2x met 1x PBS snel, wikkel in folie en bewaar in het donker op 4 °C tot het binnen 3 dagen klaar is om monsters te monteren.

5. Mount gekleurd weefsel

1. Verkrijg alle benodigde materialen voor montage: glazen platen, glazen coverslips, heldere nagellak, montagemedia, een paar tangen en doekjes.
2. Om gekleurd vliegweefsel te monteren, de buiken losmaken van de ontleedplaat met behulp van tangen onder de stereomicroscoop. Breng weefsel over naar ~30 μL montagemedia op een glazen coverslip door het weefsel voorzichtig met tangen door de rugflanken te grijpen, waarbij u ervoor zorgt dat het ventrale gebied niet met tangen wordt aangeraakt.
3. Onder de stereomicroscoop oriënteert het buikweefsel, zodat de binnenkant naar beneden naar beneden wordt gericht naar de coverslip (dat wil zeggen, de externe cuticula / haren zijn naar boven gericht). Trek de georiënteerde buiken naar de rand van de media druppel met behulp van de tangen. Oppervlaktespanning zal helpen om het weefsel plat te houden(figuur 1F).
   OPMERKING: Het is nuttig voor beeldvorming om de buiken in een kolom of rij in dit stadium te organiseren.
4. Label een glazen schuif (d.w.z. besturing of experimenteel) en pak de coverslip op door de schuif langzaam dichter bij de coverslip te brengen. Flip schuif over en voorzichtig dep met een doekje om overtollige montagemedia te verwijderen.
5. Verzegel de randen van de coverslip met duidelijke nagellak en herhaal voor alle resterende experimentele groepen. Bewaar dia's in een diavak bij 4 °C tot ze klaar zijn om te worden weergegeven.

6. Beeldvorming en verwerking

1. Beeld de vlieg buikwond gebied door eerst het melanine litteken te lokaliseren met een confocale microscoop (Figuur 1B), ofwel een puntscanner of een gestructureerde verlichting (ApoTome) met een 40x olie of droge doelstelling.
2. Controleer de belichting op elk kanaal en zorg ervoor dat het signaal onder de verzadiging zit. De beeldvormingsinstellingen moeten gebaseerd zijn op de helderste voorbeeldgroep. Dit is vooral belangrijk voor ploidy analyse als de DAPI kanaal moet blijven in het lineaire bereik om nauwkeurig te meten DNA-inhoud.
3. Neem een volledige z-stack afbeelding in alle drie de kanalen met een optimale afstand van ten minste 0,50 μm tussen de segmenten. Sla vastgelegde afbeeldingen op en open het bestand in het beeldanalyseprogramma Fiji (ook bekend als ImageJ).
4. Maak voor elke afbeelding een z-stackprojectie met de som van segmenten voor alle kanalen.
5. Draai de beelden zo nodig om ervoor te zorgen dat de kernen horizontaal over afbeeldingen worden opgesteld(figuur 3A en figuur 4E).
6. Snijd alle afbeeldingen bij tot een rechthoekige selectie van 300 μm x 300 μm gecentreerd rond de wondplaats of het centrum van niet-gewonde controle. Het gebied identificeren door een rechthoek te tekenen en Bewerken te selecteren | Selectie | Opgeven. Controleer of geschaalde eenheden zich in micron bevinden om ervoor te zorgen dat het vak van dezelfde grootte wordt gebruikt om alle afbeeldingen te analyseren.

7. Endoreplication (ploidy) analyse

1. Selecteer met Fiji het Grh-kanaalvenster en dupliceer de afbeelding. Gebruik vervolgens het gereedschap Drempelwaarde om een masker te maken. Pas de drempel handmatig aan door de bovenste balk te schuiven om de achtergrond te minimaliseren zonder dat de kernen drastisch krimpen(figuur 4D).
2. Als er kernen in het Grh-kanaal worden aangeraakt in de drempelafbeelding, gebruikt u het penseelgereedschap (2 pixelbreedte) in dezelfde kleur als de achtergrond om een lijn tussen de kernen te tekenen. Klik om 1x toe te passen wanneer u klaar bent om het uiteindelijke masker te genereren.
3. Genereer een regio van belang (ROI) kaart met behulp van de functie Deeltjes analyseren: stel grootte in op 5 μm-60 μm om de meeste kernen vast te leggen zonder de achtergrond op te geven.
4. Pas de ROI-kaart handmatig aan als dat nodig is in de ROI-manager. Verwijder selecties die geen kernen zijn en voeg kernen toe aan de lijst die niet zijn geïdentificeerd door de kern te schetsen met het keuzegereedschap uit de vrije hand en toe te voegen aan de ROI-manager (figuur 4D).
5. Selecteer het DAPI-kanaal en klik vervolgens op Alles weergeven in de ROI-manager om de gegenereerde ROI-kaart in het Grh-kanaal toe te passen op het DAPI-kanaal.
6. Verwijder selecties waarbij de epitheelkernen elkaar overlappen met niet-hellend getinte kernen (bijvoorbeeld kernen van spieren of vet) van de ROI-kaart. Grainyhead bevlekt alleen epitheelkeren, terwijl DAPI alle kernen bevlekt. Controleer of elke geschetste selectie slechts één kern bevat en verwijder of bewerk selecties met meer dan één kern. De lijst met bewerkte ROI's opslaan.
7. Meet het gebied en de geïntegreerde dichtheid van elke epitheelkernen in de ROI-kaart met behulp van de analysetools in Fiji. Exporteer de waarden naar een spreadsheetprogramma.
8. Meet de gemiddelde afbeeldingsachtergrond met behulp van het gereedschap Cirkelselectie. Teken drie cirkels die niet overlappen met kernen in verschillende gebieden van de DAPI-afbeelding. Voeg het gebied en de geïntegreerde dichtheid van elk van de cirkels toe aan een spreadsheetprogramma om de helderheid van de achtergrondafbeelding vast te stellen.
9. Begin met het berekenen van de gemiddelde achtergrond per eenheidsgebied voor elke afbeelding door elke achtergrond geïntegreerde dichtheidswaarde te delen door het bijbehorende gebied. Dan gemiddeld de drie geïntegreerde dichtheid per gebied metingen voor het beeld om de gemiddelde achtergrond per eenheid gebied te verkrijgen.
10. Bereken vervolgens de totale achtergrond van elke DAPI-kern door het gebied van de kern te vermenigvuldigen met de gemiddelde achtergrond per eenheidsgebied. De genormaliseerde DAPI-intensiteit voor elke gemeten kern kan vervolgens worden berekend door de totale achtergrond van elke kern af te trekken van de gemeten geïntegreerde dichtheid.
11. Gemiddeld alle genormaliseerde DAPI intensiteit waarden van de ongewonde epitheel controle. De ongewonde epitheelkernen werden eerder berekend om een ploidy waarde van 2C hebben en kan dienen als referentie voor de berekening van ploidy in de epitheel kernen van de experimentele omstandigheden⁸.
12. Bereken de ploidy van elke kern door de genormaliseerde DAPI-intensiteit van elke kern te delen door de genormaliseerde waarde van referentieonverwonding epitheelcontrole (2C), vermenigvuldig de waarde met 2 tot gelijk aan de genormaliseerde truc (C-waarde):
    (Nuclear Integrated Density - Background Nuclear Integrated Density)/Average Nuclear Integrated Density (uninjured epitheelnclei = 2C) x 2 = epitheliale nucleaire ploidy (C)
13. Grafiekkernen met ploidywaarden als stipplot, histogram of gegroepeerd in een staafgrafiek (d.w.z. 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], en >32C [>25.0C] (3F).

Resultaten

Een gedetailleerd protocol is voorzien om D. melanogaster te gebruiken als een model om wond-geïnduceerde polyploidisatie (WIP) te bestuderen. Dit wondgenezingsmodel biedt vele voordelen ten opzichte van zoogdier en andere vliegmodellen van WIP. Polyploïdie werd gemakkelijk veroorzaakt door een mechanische punctie met een insectenspeld en polyploïde cellen werden binnen een korte periode gegenereerd (2-3 dpi) (figuur 1A, 1B)⁴. De grootste uitdaging is de dissectie van intact buikweefsel zonder verstoringen van het epitheel. Het D. melanogaster epitheel wordt gemakkelijk per ongeluk gestoten of bekrast met de scherpe dissectiegereedschappen. Daarom moeten de stappen van dit protocol worden uitgevoerd voorafgaand aan het gebruik en de analyse.

Ten eerste was de verwonding beperkt tot de ventrale vrouwelijke buik, die een groot, plat ondoorzichtig weefselgebied biedt dat ideaal is voor beeldvorming. De steekwonden werden toegebracht in het pleurteeptheel, dat aan weerszijden van de ventrale middellijnventen ligt en gericht is tussen tergiet (T) segmenten T4-T5(figuur 1A-C). Deze wondplaatsing zorgt voor een groot zichtbaar gebied dat niet wordt verstoord door de dissectie. Uitdagende stappen zijn de buikveer schaar gesneden en pinning stappen(Figuur 1D, 1E). De veersnijdende stap werkte het beste toen de buiken werden gesneden in een verminderd volume van Grace's oplossing (~ 30 μL) om de weefselbeweging te verminderen. Een goed gecentreerde snede langs de rugmiddelijn was nodig om voldoende ruimte op de buikswanden te bieden om op de dissectieplaat open te pinnen(figuur 1C). De buik moet voorzichtig worden vastgemaakt op de vier hoeken zonder overmatige kracht(figuur 1E). Een pin push die te hard is zal het buikweefsel vervormen en kan zelfs duwen het weefsel in de dissectie plaat. Als dit gebeurt, moet het weefsel worden weggegooid. Zodra het buikweefsel was vastgesteld, bleef het op de dissectieplaat tot immunofluorescentie kleuring compleet was en de buiken werden gemonteerd op een glazen coverslip voor beeldvorming(figuur 1F).

Wondgenezing vereist een continu epitheel blad te vormen, die afhankelijk is van endoreplicatie en celfusie^4,16. Het septaatverbindingeiwit FasIII, dat celcelverbindingen labelt, gaf een indicator voor de vraag of er tijdens de bereiding verstoringen zijn opgetreden(figuur 1G, 1H). Buiken met grote krassen (onbevlekt gebied) die het wondgebied verstoren, moeten worden weggegooid en niet worden gebruikt voor verdere analyse(figuur 1H).

De volgende stap was het analyseren van intacte monsters op eventuele gebreken in WIP. Dit protocol bevat verschillende tests om verschillende aspecten van de WIP-respons te detecteren(figuur 2). Wondreparatie was voltooid toen een centrale, grote, multinucleated cel de wondschrozab bedekte (figuur 3A). Hier werd celfusie ontdekt door kleuring voor FasIII/Grh en het kwantificeren van het aantal Grh⁺ epitheelkernen in het door de FasIII geschetste gebied⁴. Defecten in wondsluiting of herintheelvorming werden gedetecteerd wanneer er hiaten van >10 μm in het epitheliale blad werden waargenomen(figuur 3B, rode pijl). Dit was bijvoorbeeld het geval toen WIP werd geremd door de activering van de mitotische cyclus via expressie van stg, fzr^RNAi, zoals onlangs gemeld¹⁶. In deze genetische toestand was 52% van de wonden niet in staat om een continu epitheliaal vel over de wondschab te vormen(figuur 3B, 3C).

Een andere methode om wondherstel in dit model te meten was door het epitheliale membraan te visualiseren met epi-Gal4-expressie van UAS-mCD8-ChRFP⁴ (figuur 2, figuur 3D). In de controle, 91% van de epitheelwonden volledig gesloten door 3 dpi, maar remmen WIP door het blokkeren van endoreplicatie (E2f1^RNAi) en celfusie (RacDN) tegelijkertijd, zoals eerder gemeld, veroorzaakt 92% van de epitheel wonden volledig open te blijven (Figuur 3D, 3E)^8,16. De activering van mitotische celcyclus door expressie van stg, fzr^RNAi resulteerde ook in een epitheliale wondsluitingsdefect. Echter, door het epitheliale celmembraan te visualiseren, kan de omvang van het re-epithelialisatiedefect worden bepaald. De WIP mutant (E2f1^RNAi, RacDN) vliegenwonden waren meer open dan de stg, fzr^RNAi wonden (Figuur 3D, streepje rode contouren)¹⁶. Deze membraan wond healing test gaf meer informatie over de omvang van het wondherstel defect. Als gevolg hiervan kunnen re-epithelialisatiedefecten worden gegroepeerd als volledig open, gedeeltelijk gesloten (d.w.z. >10 μm-hiaten) of volledig gesloten(figuur 3D, 3E).

Naast celfusie groeien epitheelcellen in omvang door endoreplicatie, een onvolledige celcyclus die het nucleaire DNA-gehalte verdubbelt. Endoreplicatie werd geproefd door zowel celcyclus activiteit en directe nucleaire DNA ploidy metingen (Figuur 2 en figuur 4). Hier werd celcyclusactiviteit gedetecteerd door de integratie van de thymidineanaloog EdU (figuur 4A, 4B). D. melanogaster epitheelcellen bleken in de endocycle terecht te komen, een onvolledige celcyclus die tussen de S- en G-fasen oscilleert zonder tussenliggende M-fase^4,12. De volwassen D. melanogaster dieet werd aangevuld met EdU⁺ voedsel voorafgaand aan letsel en de vliegen werden gehandhaafd op een EdU⁺ dieet tot dissectie op 2 dpi (Figuur 4A). De EdU werd vervolgens gedetecteerd met behulp van de fabrikant Click-iT protocol. Deze EdU-test werd gebruikt om te bepalen waar, wanneer en hoeveel kernen werden geactiveerd om de S-fase in te gaan als reactie op een wond. Met behulp van de Gal4 / UAS-systeem, werd onlangs vastgesteld dat epitheliale specifieke expressie van myc kan ofwel blokkeren(myc^RNAi)of verergeren (Myc overexpressie) de competentie van epitheliale cellen om S-fase in te voeren. Als gevolg hiervan is aangetoond dat Myc voldoende is om endoreplicatie in postmitotische cellen te induceren, zelfs zonder letsel^16,22.

Vervolgens werd epitheeltruidy bepaald door het direct meten van het nucleaire DNA-gehalte. Epitheele kernen werden geïdentificeerd door immunofluorescentie kleuring voor de epitheliale specifieke marker, Grh (Figuur 4D). In de Fiji imaging software, epitheel kernen werden systemisch geïdentificeerd en vervolgens drempels met behulp van Grh nucleaire vlek. Kernen werden vervolgens gescheiden en de ROI's bedekt op de som van stapels DAPI beeld (Figuur 4D, groene pijl). Overlappende kernen werden handmatig verwijderd voordat de geïntegreerde dichtheid van de geselecteerde kernen werd gemeten (Figuur 4D, rode pijlen). Deze semi-geautomatiseerde methode maakt het mogelijk om de verdeling en ploidy van de meeste kernen in de niet-gewonde en gerepareerde vlieg buikepeelium⁸kwantificeren . Zoals onlangs gemeld, de epitheelkernen rond de wond waren samengesteld uit 44% polyploïde kernen met dna-inhoud meer dan 3C op 3 dpi (Figuur 4E, 4F)¹⁶. Zoals verwacht van de EdU resultaten, knockdown van myc leidde tot een aanzienlijk blok in endoreplicatie, zoals slechts 9% van de epitheliale kernen polyploïde waren, terwijl overexpressie van Myc resulteerde in 100% polyploïde epitheelpiclei rond de wond site (Figuur 4F)¹⁶. Epitheel nucleaire grootte werd ook zichtbaar beïnvloed door myc expressie met een verminderde of vergrote kernen aanwezig. Echter, nucleaire gebied is niet een nauwkeurige maatregel van ploidy en fysiologische effecten, omdat factoren zoals cel stretching kan ook invloed hebben op nucleaire grootte zonder dat nucleaire DNA-inhoud²⁰.

Figuur 1: Volwassen fruitvlieg buikwonden, ontleden en weefselmontage. (A) Diagram van de volwassen buikwondentest. Vliegen moeten gewond raken aan weerszijden van de buik op tergite 4 (T4). (B) Volwassen vrouwelijke fruitvlieg 3 dpi met melanine korst gevormd uit wondgenezing (witte doos). Schaalbalk = 50 μm. (C) Ontleed volwassen buik, dorsale weergave, met tergites gelabeld. Buiken werden gefileerd langs de middellijn van de rugzijde (witte stippellijn). Schaalbalk = 50 μm. (D) Ontleed en gefileerd volwassen buiken voorafgaand aan pinning. Schaalbalk = 50 μm. (E) Vastgemaakte volwassen buik op een ontleden plaat. Een speld werd geplaatst in elk van de vier hoeken van de buik aan de rugzijde. Het weefsel werd voorzichtig geopend, maar niet uitgerekt, om scheuren te voorkomen. (F) Volwassen buiken werden gemonteerd en geplaatst op een glazen coverslip met de binnenkant van de buik naar beneden naar beneden naar de coverslip en cuticula gericht op de glazen glijbaan. (G) FasIII kleuring van intact wondgebied zonder verwerking verstoring en een centrale syncytium (stippelgele lijn). Schaalbalk = 50 μm. (H) Afbeelding van een bekrast wondgebied (*) met een onbevlekt FasIII-gebied dat het syncytium verstoort. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: WIP-analyseworkflow. Het stroomdiagram toont de drie tests die in deze studie worden beschreven en overlappende en verschillende stappen om de WIP-respons op te sporen en te meten. De EdU-test meet celcyclusactiviteit (blauwe dozen), ploidy en re-epitheelialisatie worden gedetecteerd door Grh/FasIII immunostaining (groene dozen), en expressie van membraan RFP maakt het mogelijk om de omvang van epitheelwondsluiting (roze dozen) te meten. Gemeenschappelijke stappen zijn in grijze dozen en D. melanogaster stam genotypes zijn hierboven vermeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Methoden om re-epithelialisatie tijdens WIP op te sporen. Re-epithelialisatie werd verstoord toen WIP genetisch werd geremd. Immunofluorescente beelden van de controle(A) en stg, fzr^RNAi (B) op 3 dpi. Epitheele kernen en septate knooppunten werden gekleurd met Grh (groen) en FasIII (magenta), respectievelijk. A' en B") FasIII kleuring alleen toonde aan dat re-epithelialisatie werd aangetast (rode pijl) in stg, fzr^RNAi epitheel. Schaalbalk = 50 μm. (C) Kwantificering van re-epitheelialisatiedefecten (%) bij 3 dpi (grijs): besturing (n = 8), stg, fzr^RNAi (n = 6). Foutbalken geven standaardfout aan; statistische significantie werd gemeten via de T-test van de student, **P < 0,01. Re-epithelialisatie tijdens wondherstel kan ook worden gedetecteerd door expressie van een membraan gekoppelde RFP met behulp van epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Immunofluorescente beelden van de controle, E2F1^RNAi, RacDN, en stg, fzr^RNAi op 3 dpi. Schaalbalk = 20 μm. Wondkors (gele omtrek) en open epitheel wondgebied (rode omtrek). (E) Kwantificering van wondsluiting in ctrl (n = 11), E2F1^RNAi, RacDN (n = 13) en stg, fzr^RNAi (n = 13). Aangepast van Grendler et al.¹⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Methoden om endoreplicatie tijdens wip te detecteren. (A) Tijdlijn van EdU-test: volwassen Drosophila werd 2 dagen voor de verwonding 75 μL van 5 mM gist-EdU gevoed en bleef tot 2 dpi. (B) Immunofluorescente beelden van EdU-label in vliegstammen uitgedrukt met epi-Gal4/ UAS-systeem op 2 dpi. Wondkors (W). Schaalbalk = 50 μm. (C) Gemiddeld aantal EdU+ epitheelkernen per vlieg bij 2 dpi: ctrl (n = 37), myc^RNAi#1 (n = 10) en Myc (n = 8). Foutbalken geven standaardfout aan; statistische significantie werd gemeten via de T-test van de student, *P < 0,05, **P < 0,01. (D) Schematisch van detectie en meting van epitheel kerntruc. Epitheele kernen werden geïdentificeerd en drempeled door de anti-Grh vlek in Fiji. Overlappende epitheelkernen werden gescheiden (groene pijlpunten) of verwijderd (rode pijlpunten) indien bedekt door niet-epitheale kernen. De geïntegreerde dichtheid en nucleaire gebied van overeenkomstige DAPI gekleurde kernen beeld werden gemeten. (E) Epithelial nucleaire grootte (Grh) werd gewijzigd door myc uitdrukking op 3 dpi. (F) Epithelial nucleaire ploidy (%) bij 3 dpi: ctrl (n = 4), myc^RNAi#1 (n = 6) en Myc (n = 3). Aangepast van Grendler et al.¹⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Gepresenteerd is een gedetailleerd protocol over hoe te ontleden en gebruik maken van de volwassen D. melanogaster buikeptheel om te bestuderen hoe genen reguleren WIP door het veranderen van re-epithialisatie en endoreplicatie tijdens wondherstel¹⁶. Met behulp van deze methode werd het proto-oncogeen Myc onlangs geïdentificeerd als een belangrijke regulator van WIP. Myc is vereist voor epitheelcellen om postletsel te beëindigen en is voldoende voor rustige epitheelcellen om zowel in volwassen vliegeptheel als accessoireklieren^16,22te dopen. Er werd ook vastgesteld dat het overschakelen van epitheliale cellen naar een mitotische celcyclus door expressie van stg, fzr^RNAi schadelijk is voor wondherstel. Voortdurende studies met behulp van deze methode zal identificeren andere genen die nodig zijn om re-epithelialisatie en endoreplicatie te reguleren tijdens WIP, onthullen zowel gelijkenissen en verschillen met hoe polyploïdie is gereguleerd en functioneert in een verscheidenheid van weefsels.

Dit model en deze methode bieden unieke voordelen, waaronder de eenvoudige inductie van polyploïdie met een mechanische punctie en het feit dat polyploïde cellen worden gegenereerd binnen enkele dagen⁴. De weefseldissectie- en voorbereidingsprotocollen zijn gebaseerd op larve dissectietechnieken^23,maar de volwassen vliegbuik is stijver en daardoor gemakkelijk verstoord. Als gevolg hiervan vereist dit protocol oefening en precisie om een intact weefsel te isoleren om WIP te bestuderen. Eenmaal ontleed, echter, het epitheel is duidelijk zichtbaar en gemakkelijk afgebeeld, waardoor een momentopname van de wond genezingsproces. Deze methode biedt een schat aan informatie over de epitheelorganisatie van de volwassen vlieg, cel- en syncytiumgrootte en de truc van cellen en individuele kernen. Hoewel live imaging nog niet mogelijk is binnen de intacte fruitvlieg vanwege de ondoorzichtige cuticula, kan dit protocol worden aangepast aan de momenteel beschikbare ex vivo-cultuuromstandigheden die in D. melanogaster worden gebruikt om op korte termijn live imaging studies uit te voeren²⁴.

In de toekomst zal dit model ideaal zijn om cel-tot-cel crosstalk en de bijdrage van andere celtypen aan WIP te bestuderen door genexpressie te reguleren met het Gal4/UAS-systeem in andere celtypen van belang. Soortgelijke vragen kunnen ook worden beantwoord met behulp van een verscheidenheid van genetische en mutant achtergronden. De ontleed volwassen vliegbuik bevat een verscheidenheid van celtypes die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van deze methode, met inbegrip van vet lichaam en oenocyten, laterale spiervezels, sensorische neuronen, luchtpijp, en macrofaag-achtige hemocyten. Bovendien zal dit model onderzoekers in staat stellen om te onderzoeken hoe fysiologische variabelen WIP beïnvloeden, waaronder geslacht, dieet, infectie, leeftijd en milieustressoren. Terwijl het protocol de volwassen vrouwelijke vlieg gebruikt vanwege zijn grotere omvang, komt WIP ook voor in de mannelijke fruitvlieg (Gjelsvik en Losick, ongepubliceerd). Polyploïde cellen zijn gevonden om zich te voordoen tijdens veroudering en leeftijd-geassocieerde ziekte in de zoogdier lever, hersenen, oog, en hart¹². Het fruitvliegmodel stelt onderzoekers in staat om polyploïdie in fysiologische en ziektecontexten te bestuderen, omdat aan menselijke ziekten gerelateerde genen sterk worden geconserveerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 mm Petri schotels	Fisher Scientific	FB0875713	Voor het maken van platen om in te dissecteren
50 mL Conische Centrifugeerbuizen	Fisher Scientific	14-432-22	Voor het bereiden van kleuringsreagentia
AxioImager M2 met Apotome	Zeiss	NA	Voor het beeldvormen van monsters
Blowgun mini	Genesee Scientific	54-104M	Voor het anestheseren van D. melanogaster-stammen
Rundserumalbumine, 30%	Sigma	A7284-500ML	Voor immunokleuring
Koolstofdioxidetank	verschillende distributeurs	N/A	Voor het anestheseren van D. melanogaster-stammen
Click-iT EdU 594 Kit	Thermofisher	C10339	Voor EdU-test
Dekglasjes	Thermofisher	3406	Voor montage
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Voor immunokleuring
Dissectieplaten (gebruik Sylgard 184 Sil Elastic Kit)	Ellsworth Adhesives	184SIL	Voor het maken van platen om in te dissecteren. Meng epoxy zoals aangegeven, laat een nacht drogen
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat	Thermofisher	A21206	Voor secundaire immunokleuring
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 568-conjugaat	Thermofisher	A10042	Voor secundaire immunokleuring
Drosophila buizen en koppelingen	Genesee Scientific	59-124C, 59-123, 59-140	Voor het anestheseren van D. melanogaster-stammen
Dumont #5 Pincetten	Fine Science Tools	11252-20	Voor het dissecteren
epi-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793	Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793, b27392	Losick et al. Current Biology, 2013
Excel	Microsoft		Voor het uitvoeren van ploidie-berekeningen
Fiji/ImageJ (beeldanalysesoftware)	NIH	https://imagej.nih.gov/ij	Voor beeldanalyse
Vliegvoer	Archon Scientific	N/A	Maïsstroop/Soy voedsel
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	Voor het anestheseren van D. melanogaster-stammen
Glas dissectiebak	Fisher Scientific	13-748B	Voor het uitvoeren van dissecties
Glasplaatjes	Fisher Scientific	12-518-104C	Voor montage
Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaat	Thermofisher	A11001	Voor secundaire immunokleuring
Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 568-conjugaat	Thermofisher	A11031	Voor secundaire immunokleuring
Grace's Insect Medium, ongesupplementeerd	Thermofisher	11595030	Voor dissecteren
Insectenspelden	Fine Science Tools	26002-10	Voor het verwonden en vastpinnen van vliegbuiken
Muis anti-Fasciclin III (Drosophila) Primair Antilichaam	Developmental Studies Hybridoma Bank	7G10	Voor immunokleuring van epitheelcel-celverbindingen
Montagemedia	Vector Laboratories	H-1000	Anti-fade montagemedia om fotobleken tijdens beeldvorming te voorkomen
Nagellak	Electron Microscopy Sciences	72180	Voor het afdichten van plaatjes
Ortibal shaker	Fisher Scientific	02-217-988	Voor immunokleuring
Fosfaatgebufferde zoutoplossing, PH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	Voor kleuring
Pinhouders	Fine Science Tools	91606-07	Voor verwonding
Konijn anti-Grainyhead Primair Antilichaam	N/A	N/A	Voor immunokleuring van epitheelnuclei. Protocol voor het maken van antilichaam is te vinden (Ref. #4 en 8)
Konijn anti-RFP Primair Antilichaam	MBL	PM005	Voor immunokleuring van mCD8-RFP vlieg epitheel
Stereomicroscoop	Olympus	SZ51	Voor het dissecteren en monteren van vliegweefsel
Triton X-100	Sigma	10789704001	Voor immunokleuring
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN	VDRC (v) en Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v108837, b6292	Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg	VDRC (v) en Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v25550, b56562	Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b9674	Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b36123	Grendler et al. Development, 2019
Vannas Veertangschaar	Fine Science Tools	15000-00	Voor het dissecteren