Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61264

⸱

31 augustus 2020

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Samenvatting

Neurofilament eiwit polymeren bewegen langs axonen in de langzame component van axon vervoer bij gemiddelde snelheden van ~ 0,35-3,5 mm per dag. Tot voor kort was de studie van deze beweging in situ alleen mogelijk met behulp van radio-isotopenpuls, die analyse van axonaal transport in hele zenuwen met een temporele resolutie van dagen en een ruimtelijke resolutie van millimeters mogelijk maakt. Om neurofilamenttransport in situ te bestuderen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die neurofilament-eiwit M met fotoactiviteitbare GFP in neuronen uitdrukt. Hier beschrijven we fluorescentie fotoactivatie pulse-escape en pulse-spread methoden om neurofilament transport te analyseren in enkele myelinated axonen van scheenbeen zenuwen van deze muizen ex vivo. Geïsoleerde zenuwsegmenten worden gehandhaafd op de microscoop stadium door perfusie met zuurstofrijk zout en afgebeeld door spinnen schijf confocale fluorescentie microscopie. Violet licht wordt gebruikt om de fluorescentie te activeren in een kort axonaal venster. De fluorescentie in de geactiveerde en flankerende gebieden wordt na verloop van tijd geanalyseerd, waardoor de studie van neurofilament transport met tijdelijke en ruimtelijke resolutie op de volgorde van minuten en micron, respectievelijk. Wiskundige modellering kan worden gebruikt om kinetische parameters van neurofilament transport met inbegrip van de snelheid, directionele bias en pauzeren gedrag uit de resulterende gegevens te extraheren. De puls-escape en pulse-spread methoden kunnen ook worden aangepast om neurofilament transport in andere zenuwen te visualiseren. Met de ontwikkeling van extra transgene muizen kunnen deze methoden ook worden gebruikt om het axonale transport van andere cytoskeletale en cytosolische eiwitten in axoons te beelden en te analyseren.

Inleiding

Het axonale transport van neurofilamenten werd voor het eerst gedemonstreerd in de jaren 1970 door radio-isotopen pulse-labeling1. Deze aanpak heeft een schat aan informatie opgeleverd over neurofilament transport in vivo, maar het heeft een relatief lage ruimtelijke en temporele resolutie, meestal in de orde van millimeters en dagen op zijn best2. Bovendien is radio-isotopenpulslabeling een indirecte benadering die de injectie en het offer van meerdere dieren vereist om een eenmalige cursus te genereren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en vooruitgang in fluorescentiemicroscopie in de jaren 1990, werd het vervolgens mogelijk om neurofilament transport direct in gekweekte neuronen beeld op een tijdschaal van seconden of minuten en met sub-micrometer ruimtelijke resolutie, waardoor veel meer inzicht in het mechanisme van beweging3. Deze studies hebben aangetoond dat neurofilament polymeren in axonen snel en met tussenpozen bewegen in zowel anterograde als retrograde richtingen langs microtubulisporen, aangedreven door microtubuli motorische eiwitten. Echter, neurofilamenten zijn diffractie-beperkte structuren slechts 10 nm in diameter die meestal zijn verdeeld afgezien van hun buren door slechts tientallen nanometer; daarom kunnen de polymeren alleen worden gevolgd in gekweekte neuronen die schaars verdeelde neurofilamenten bevatten, zodat de bewegende polymeren kunnen worden opgelost van hun buren4. Zo is het momenteel niet mogelijk om enkele neurofilamenten in axonen te volgen die overvloedige neurofilament polymeren bevatten, zoals gesedineerde axonen.

Om het axale transport van neurofilamenten in neurofilamentrijke axonen te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie, gebruiken we een fluorescentie fotoactivatie pulse-escape methode die we ontwikkelden om het langdurige pauzegedrag van neurofilamenten in gekweekte zenuwcellen4,5te bestuderen. Neurofilamenten gelabeld met een fotoactivatable fluorescerende neurofilament fusie-eiwit worden geactiveerd in een kort segment van axon, en vervolgens wordt de snelheid van vertrek van die filamenten uit het geactiveerde gebied gekwantificeerd door het fluorescentieverval in de loop van de tijd te meten. Het voordeel van deze aanpak is dat het een populatie-niveau analyse van neurofilament transport dat kan worden toegepast op een tijdschaal van minuten of uren zonder de noodzaak om de beweging van individuele neurofilament polymeren volgen. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de kinetiek van neurofilamenttransport in myelineculturen te analyseren6.

Onlangs hebben we beschreven de ontwikkeling van een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die lage niveaus van een paGFP-tagged neurofilament eiwit M (paGFP-NFM) in neuronen onder de controle van de menselijke neuron-specifieke Thy1 promotor7uitdrukt. Deze muis maakt de analyse van neurofilament transport in situ met behulp van fluorescentie microscopie. In dit artikel beschrijven we de experimentele benaderingen voor het analyseren van neurofilamenttransport in geïhileerde axonen van scheenzuwen van deze muizen met behulp van twee benaderingen. De eerste van deze benaderingen is de hierboven beschreven puls-escape methode. Deze methode kan informatie genereren over het pauzeren van gedrag van de neurofilamenten, maar is blind voor de richting waarin de filamenten het geactiveerde gebied verlaten, en laat daarom geen meting van de netto directionaliteit en transportsnelheid8toe. De tweede van deze benaderingen is een nieuwe puls-spread methode waarbij we analyseren niet alleen het verlies van fluorescentie uit de geactiveerde regio, maar ook de voorbijgaande toename van fluorescentie in twee flankerende ramen waardoor de fluorescerende filamenten bewegen als ze vertrekken de geactiveerde regio in zowel anterograde en retrograde richtingen. In beide benaderingen kunnen parameters van neurofilamenttransport zoals de gemiddelde snelheid, netto directionaliteit en pauzegedrag worden verkregen door wiskundige analyse en modellering van de veranderingen in fluorescentie in de meetvensters. Figuur 3 illustreert deze twee benaderingen.

Dit protocol toont dissectie en voorbereiding van de zenuw, activering en beeldvorming van de paGFP fluorescentie, en kwantificering van neurofilament vervoer van de verworven beelden met behulp van de FIJI distributiepakket van ImageJ9. We gebruiken de scheenzenuw omdat het lang is (enkele cm) en niet vertakt; in principe is elke zenuw die paGFP-NFM uitdrukt echter geschikt voor gebruik met deze techniek als deze kan worden ontleed en ontleed zonder de axonen te beschadigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University.

1. Voorbereiding van de zenuwsoutoplossing

  1. Maak 100 mL van Breuer's zoutoplossing10: 98 mM NaCl, 1 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,5 mM CaCl2, 5,6% D-glucose, 23,8 mM NaHCO3 in dubbelgedestilleerd water.
  2. Bel 95% zuurstof/5% kooldioxide (carbogen) door de zoutoplossing gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik. Restjes zout kunnen binnen een week worden hergebruikt; het moet echter vóór elk gebruik opnieuw worden geoxygeneerd.
  3. Giet zuurstofrijk zout in een spuit van 60 mL en zorg ervoor dat er minimale lucht in de spuit blijft.

2. Initiële montage van zenuwperfusiekamer

  1. Sluit de spuit en de slang zoals aangegeven in figuur 1A, het plaatsen van de uitstroombuis in een afvalfles.
  2. Plaats de buitenpakking in de behuizing van de perfusiekamer, zodat de stroominlaat en uitlaatpalen zijn afgestemd op de gaten in de pakking.
  3. Leg de binnenpakking (siliconen, 100 μm dik) op een #1,5 cirkelvormige coverslip (40 mm diameter), zorgvuldig gladstrijken van eventuele rimpels in de pakking om een strakke afdichting te garanderen. Om de latere montage te vergemakkelijken, plaatst u de hoezenlip en de pakking op een papieren handdoek of taakdoek met de pakking naar boven gericht.

3. Dissectie en voorbereiding van de muis scheensleerzenuw

  1. Offer het dier op door inademing van kooldioxide of een andere institutioneel goedgekeurde methode. Start een timer wanneer het dier stopt beweging / ademhaling, zoals experimenten mogen alleen worden uitgevoerd binnen 3 uur na offer7.
  2. Spuit de vacht met 70% ethanol en verwijder zoveel mogelijk uit de poten en rug van het dier met behulp van een elektrisch scheerapparaat.
  3. Met behulp van een paar grote dissectie schaar, maak een dorsale incisie in de huid in de buurt van het midden van de wervelkolom en blijven de snede rond de ventrale aspect van het dier. Vanaf deze snede, langzaam weerspiegelen de huid van de benen door zachtjes te trekken uit de buurt van de spier en het snijden van de fascia.
  4. Plaats het dier in een supine positie op een dissectie lade en pin alle vier poten. Eventueel pin de staart om de beweging verder te verminderen.
  5. Met behulp van microdissection schaar, maak een incisie in de dijspieren halverwege tussen de staart en knie om de heupzenuw bloot te stellen. Zorg ervoor dat de zenuw, die zichtbaar is door de spier, niet wordt gesneden.
  6. Breid de incisie dorsaal en ventrally om de spier te verwijderen. Verwijder ook de spieren van het kalf, houd bezuinigingen ondiep en kort om schadelijke zenuw te voorkomen.
  7. Verwijder de spieren totdat de scheenzenuw volledig is blootgesteld vanaf het punt waar het vertakt van de heupzenuw (aan de knie) naar de hiel(figuur 2A).
    OPMERKING: Vermijd in alle stappen, inclusief en na dissectie van de scheenzenuw, onnodige blootstelling aan omgevingslicht om mogelijke incidentele activering van paGFP in de zenuw te minimaliseren.
  8. Grijp de scheenzenuw aan het wervelkolom-proximale einde met een paar tangen en snijd de zenuw met behulp van een paar microdissection schaar. Zorg ervoor dat je geen spanning op de zenuw legt, het uit de buurt van de spier tilt, eventuele hulpstukken snijdt.
  9. Snijd het wervelkolom-distale uiteinde van de scheenzenuw en breng over op een kleine petrischaal van kamertemperatuur zuurstofrijk zout. Vanaf dit punt in de procedure, altijd zeker bij te houden van de proximale en distale uiteinden van de zenuw.
    OPMERKING: Een manier om dit te doen is om het distale uiteinde van de zenuw te markeren met een schuine snede zodanig dat de taper zichtbaar is.
  10. Vanaf het proximale uiteinde van de zenuw, pak voorzichtig de blootgestelde axonuiteinden met een paar zeer fijngepuntige tangen.
  11. Met een tweede paar tangen, pak de zenuwschede proximally, en langzaam trek naar het distale uiteinde van de zenuw. De zenuwschede schuift langs de axonen met minimale weerstand. Zorg ervoor dat er geen onnodige spanning wordt toegepast op de zenuw tijdens dit proces.

4. Definitieve zenuwperfusiekamerassemblage

  1. Grijpen het proximale uiteinde van de zenuw, verwijder het uit de zoutoplossing en langzaam leg het neer op de coverslip van de perfusiekamer binnen de rechthoekige opening van de binnenste pakking, met behoud van zachte spanning op de zenuw als je het vastlegt, zodat het recht ligt.
  2. Plaats de microaqueduct glijbaan over de zenuw met de gegroefde kant naar de zenuw, en de richting van de stroom parallel aan de zenuw. Draai de coverslip en microaqueduct assemblage over, en plaats het in de perfusie kamer behuizing met de microaqueduct dia apposed aan de buitenste pakking. De zenuw en de omliggende binnenpakking worden nu ingeklemd tussen de coverslip en de microaqueduct schuif, die worden gescheiden door de pakking, met de coverslip naar boven(Figuur 1B).
  3. Zet de perfusiekamer vast door deze in de metalen behuizing te plaatsen en de vergrendelingsring te draaien. Zorg ervoor dat de kunststof behuizing volledig onder alle metalen clips zit en draai goed aan om zoutlekkage te voorkomen. Overtightening kan de microaqueduct dia of coverslip kraken. Draai de kamer om zodat de coverslip naar beneden gericht is.
  4. Druk langzaam de zoutspuitzuiger in om de perfusiekamer te vullen. Houd de inlaat- en uitlaatslang, uitlaatkolf en spuit te allen tijde boven de kamer zelf tijdens de installatie en beeldvorming. Dit voorkomt overheveling, die kan leiden tot bellen of veroorzaken focus instabiliteit als gevolg van negatieve druk in de kamer.
  5. Breng de perfusieassemblage over in een omgekeerde microscoopfase en monteer de zoutspuit in de spuitpomp. Start de motor op een geschikte snelheid voor een debiet van 0,25 mL/min. Sluit vervolgens de in-line oplossingsverwarming op 37 °C aan en zet deze in.
  6. Sluit de objectieve kachel aan en zet op 37 °C, breng olie aan op de doelstelling en steek de perfusiekamer in de podiumbevestiging.
  7. Breng olie aan op het verwarmingskussen van de kamer en bevestig aan de perfusiekamer. Sluit de kachel aan en zet deze aan; ingesteld op 37 °C.
    OPMERKING: Temperatuurveranderingen kunnen ervoor zorgen dat er bellen ontstaan in de perfusiekamer als gevolg van uitgassing van de oplossing. Als bellen vormen, kort verhogen van de oplossing stroomsnelheid met 5-10x totdat bellen duidelijk de kamer.
  8. Vergrendel de perfusiekamer in de stadiumadapter en breng de objectieve olie in contact met de afdeksel aan de onderkant van de kamer.
    OPMERKING: De Bioptechs kamer met ASI stage adapter die hier wordt gebruikt zijn ontworpen voor een omgekeerde microscoop configuratie.

5. Fluorescentie activering en beeldverwerving

  1. Met behulp van brightfield verlichting, focus op de laag van axonen op het onderste oppervlak van de zenuw het dichtst bij de coverslip oppervlak (Figuur 2B). Myelinated axonen (meestal 1 - 6 μm in diameter bij volwassen muizen) kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een myelineschede, die zichtbaar is onder helderveld uitgezonden lichtverlichting zonder contrastverbetering. Schmidt-Lanterman kloven en knooppunten van Ranvier zijn ook duidelijk zichtbaar. Unmyelinated axonen zijn slanker (meestal <1 μm diameter) en zijn over het algemeen aanwezig in bundels (Remak bundels), waar ze over het algemeen te nauw worden opgepast om van elkaar te worden opgelost.
  2. Indien beschikbaar op de microscoop, activeer het autofocussysteem om de focus te behouden in de loop van timelapse imaging.
  3. Een overzichtsafbeelding van brightfield verkrijgen. Noteer de oriëntatie van de zenuw (wervelkolom-proximale en distale uiteinden) met betrekking tot beelden.
  4. Verkrijg een confocale afbeelding met behulp van een 488 nm laser en een emissiefilter geschikt voor paGFP (bijvoorbeeld 525/50 nm) om de pre-bleekmiddel autofluorescentie op te nemen. Houd het laservermogen laag om fotobleaching te minimaliseren, waarbij de belichtingstijd dienovereenkomstig wordt aangepast om het zwakke signaal te detecteren. Als voorbeeld, representatieve gegevens werden verkregen op 5% laservermogen en 4 s blootstellingen. Neem de acquisitie-instellingen op voor gebruik in alle toekomstige experimenten.
    OPMERKING: Na fotoactivatie produceren de ideale beeldvormingsinstellingen een signaal-ruisverhouding > 8 en fotobleaching van minder dan 25% van het oorspronkelijke signaal in de loop van 20 beelden. De axonen kunnen ook worden afgebeeld door widefield epifluorescentie microscopie zoals we oorspronkelijkdeden 7,maar de beeldkwaliteit zal inferieur zijn als gevolg van gebrek aan confocaliteit.
  5. Stel de laserkracht in op ongeveer 5x normaal beeldvermogen en verwerf een beeld met een belichtingstijd van 3-4 minuten. Hoewel niet essentieel, wordt deze stap aanbevolen om autofluorescentie en andere bronnen van ongewenste fluorescentie te bleken om achtergrondsignaal te verminderen en zo het signaal-naar-ruis van de fotogeactiveerde fluorescentie te maximaliseren.
  6. Verkrijg een afbeelding met de instellingen die worden gebruikt in stap 5.4 om de autofluorescentie vóógrond van vooractivering op te nemen na deze bleekstap.
  7. Teken op de afbeelding brightfield een lijn die parallel loopt met de axonen met een lengte die gelijk is aan de gewenste grootte van het activeringsvenster. De lengte van dit venster zal variëren afhankelijk van het experimentele doel en de parameters, maar typische lengtes zijn 5 μm voor het puls-vluchtparadigma en 40 μm voor het puls-uitgespreide paradigma.
  8. Teken met deze regel als leidraad een rechthoekig interessegebied (ROI) over het gezichtsveld loodrecht op de axonen. De regio moet alle axonen omvatten die moeten worden gefotoactiveerd.
  9. Bepaal optimale instellingen voor foto-activiteit met 405 nm verlichting.
    OPMERKING: Voer deze stappen en substappen alleen uit voordat de eerste experimentele activering wordt uitgevoerd. In de loop van een experiment moeten dezelfde instellingen voor fotoactiviteit worden gebruikt.
    1. Activeer een gebied van belang herhaaldelijk met behulp van de 405 nm laserlijn, lage laserkracht (bijvoorbeeld 5%), en pixel verblijfstijd (bijvoorbeeld 40 μs), en een puls, het verwerven van een beeld van de geactiveerde GFP fluorescentie na elke activering. Herhaal dit totdat de fluorescentie niet meer toeneemt en kwantificeer vervolgens de fluorescentie in een gebied dat voor elk beeld van belang is.
    2. Plot de gemiddelde fluorescentie intensiteiten versus puls nummer. Selecteer het aantal pulsen waarna de fluorescentie niet meer toeneemt als het optimale aantal pulsen voor activering.
  10. Activeer de paGFP fluorescentie van de regio getrokken in stap 5.8 door patroon excitatie met 405 nm licht. Zorg ervoor dat een afbeelding wordt verkregen vlak voor en net na de activering.
    OPMERKING: De ideale paGFP-activering zorgt voor een duidelijk gedefinieerd gebied van fluorescentie met scherpe grenzen binnen de ROI.
  11. Start een timer van 1 minuut als de activering is voltooid. Aan het einde van 1 minuut, start de aankoop van een timelapse serie.
    OPMERKING: De vertraging van 1 minuut is noodzakelijk om de toename van fluorescentie mogelijk te maken die wordt waargenomen na fotoactivatie van paGFP11. Voor de pulsspreadmethode is een acquisitieperiode van 5-10 minuten met 30 tweede timelapse intervallen voldoende voor het meten van de initiële hellingen in de centrale en flankerende ramen om snelheid en directionaliteit te meten. Voor de puls-escape methode, een overnameperiode van 30-150 minuten met 5 of 10 minuten timelapse intervallen maakt analyse van de lange termijn pauzeren gedrag van de filamenten
  12. Sla alle verkregen afbeeldingen op, evenals de ROI die wordt gebruikt voor fluorescentieactivering.
  13. Ga naar een nieuw gebied van de zenuw en herhaal stap 5.1-5.11. Als het nieuwe gebied zich langs dezelfde axon bevindt, moet het ten minste 500 μm uit het eerder geactiveerde gebied zijn om detectie van fluorescerende neurofilamenten te voorkomen die uit het andere geactiveerde gebied zijn verplaatst. De aankoop van de laatste timelapse moet voor het einde van de 3 uur venster eindigen.
    OPMERKING: Het is mogelijk dat de voorbereiding langer dan 3 uur levensvatbaar is, maar dat hebben we niet bevestigd. Met vakkundige dessectie en voorbereiding kunnen tussen de vijf en acht timelapse-beeldsets van 10 minuten binnen deze periode van 3 uur worden aangeschaft.
  14. Nadat de laatste timelapse-beeldreeks is verkregen, stopt u de zoutstroom, koppelt u de oplossing en kamerverwarming los en verwijdert u het perfusieapparaat uit het microscoopstadium.

6. Flatfield en darkfield image acquisition

  1. Maak een oplossing van fluoresceïne door 250 mg fluoresceïnepoeder toe te voegen aan 0,5 mL dubbel gedestilleerd water. Meng tot er geen zichtbare deeltjes en draai de oplossing gedurende 30 seconden in een tafelblad centrifuge om onopgelost materiaal te sedimenteren. Deze oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard als deze wordt beschermd tegen blootstelling aan licht.
  2. Voeg 8 μL fluoresceïneoplossing toe aan een dia en breng een #1,5 coverslip aan. Dep overtollige vloeistof, verzegel met nagellak, en laat drogen.
    OPMERKING: Bij deze hoge concentratie dooft de sterke absorptie van de fluorescerende kleurstof de lichtdoorlatende straal in de oplossing, waardoor een dun fluorescentievlak ontstaat aan het oppervlak van de coverslip dat zowel uniform als bestand is tegen fotobleaching als gevolg van snelle diffusieve uitwisseling12.
  3. Plaats de fluoresceïne dia coverslip-kant naar beneden op de omgekeerde microscoop stadium en pas de focus op het dunne vlak van fluorescentie aan het oppervlak van de coverslip. Beweeg rond de dia om een gezichtsveld te vinden dat geen luchtbellen (donkere vlekken) of grote fluoresceïnedeeltjes (lichtpuntjes) bevat.
  4. Verwerf een z-stack van 6 μm met intervallen van 0,2 μm, zodat de middelste afbeelding het oorspronkelijke scherpstelvlak is. Gebruik een korte belichtingstijd (bijvoorbeeld 40 ms) omdat de fluorescentie zeer helder zal zijn. Deze z-stack acquisitie is nodig om de maximale fluorescentie vast te leggen over het gezichtsveld als de coverslip is zelden perfect horizontaal en het vlak van fluorescein fluorescentie is zeer smal. Herhaal dit voor een totaal van 25 velden van mening, het verplaatsen van de fase met ten minste 20 μm in elke richting tussen velden.
  5. Sluit alle lichtpadluiken, inclusief de cameraluik, en stel de laserkracht en de belichtingstijd op nul. Verwerf een stapel van 100 afbeeldingen met deze instellingen. Deze beelden zullen worden gemiddeld om de darkfield beeld te genereren, die zal worden gebruikt om te corrigeren voor donkere stroom en de bias offset op de camera chip.
    OPMERKING: Streaming acquisitie is een ideale manier om deze beelden vast te leggen.

7. Imaging glycolytisch geremd zenuwen voor bleekmiddel correctie

  1. Maak en zuurstof een zoutoplossing zoals in stap 1; vervang echter 2-deoxy-D-glucose voor D-glucose en voeg 0,5 m natriumydoacetaat toe om glycolyse13te remmen. We noemen dit "remmende zoutoplossing".
  2. Herhaal stap 2-5 met behulp van de remmende zoutoplossing, met een timelapse-afbeelding van 10-30 minuten in stap 5.11. Laat 40-50 minuten na het aanbrengen van remmende zoutoplossing voor beeldvorming om volledige remming van neurofilament transport te garanderen.
    OPMERKING: Glycolytische remming zal uiteindelijk doden de axonen, zodat er een smal venster van de tijd na remming waarin gegevens te verwerven, meestal ongeveer 30 minuten. Een indicator van het niveau van metabole remming is de flavin autofluorescentie van de axonnale mitochondriën, die kan worden gedetecteerd in de timelapse-serie als gevolg van de lange blootstelling die we gebruiken om het beeld van de paGFP fluorescentie14. Typisch, mitochondriale autofluorescentie zal toenemen tijdens de behandeling met remmende zoutoplossing. Als de mitochondriën beginnen te round-up of fragment, dan stoppen met beeldvorming.

8. Beeldverwerking en -analyse met ImageJ

  1. Flatfield en darkfield correctie
    1. Open de darkfield afbeeldingsstack en bes gemiddeld de afbeeldingen door op Afbeelding te klikken | Stapels | Z Project en selecteer Gemiddelde intensiteit in het vervolgkeuzemenu om de donkere veldafbeelding te genereren.
    2. Open de fluoresceïne flatfield afbeeldingsstapels en maak een maximale intensiteitsprojectie van elk (25 in totaal) door op Afbeelding te klikken | Stapels | Z Project en selecteer Max Intensiteit in het vervolgkeuzemenu.
    3. Combineer de resulterende 25 maximale projectiebeelden in één stapel door op Afbeelding te klikken | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen. Maak een gemiddelde intensiteitsprojectie van deze stapel door op Afbeelding te klikken | Stapels | Z Project en selecteer Gemiddelde intensiteit in het vervolgkeuzemenu om de flatfield-afbeeldingte genereren.
    4. Trek de donkere afbeelding van de flatfield-afbeelding af door op Proces te klikken | Afbeeldingscalculator, als aftrek selecteren als bewerking. Controleer of de 32-bits resultaatoptie (float) is ingeschakeld. Het resultaat is het gecorrigeerde flatfield beeld.
    5. Meet de gemiddelde pixelintensiteit van de gecorrigeerde flatfieldafbeelding door eerst op Analyseren te klikken | Stel Metingen in en controleer het vak Gemiddelde grijze waarde en druk op de 'm'-toets.
    6. Verdeel het gecorrigeerde flatfieldbeeld door de gemiddelde intensiteit door op Proces te klikken | Wiskunde | Verdeel en betreed de gemiddelde grijze waarde verkregen in stap 7.1.5. Dit zal de omgekeerde winst beeld te produceren.
    7. Open de pre-activerings- en postactiveringsafbeeldingen samen met de timelapse-afbeeldingsstack. Combineer de afbeeldingen in één stapel door op Afbeelding te klikken | Stapels | Hulpmiddelen | Concatenateen selecteer de afbeeldingen in chronologische volgorde in de vervolgkeuzemenu's. Controleer of de optie Openen als 4D-afbeelding niet is geselecteerd. De resulterende stack is de volledige afbeeldingsset.
    8. Herhaal stap 8.1.4 op de volledige afbeeldingsseten verdeel het resultaat door de inverse gain-afbeelding door op Proces te klikken | Afbeeldingscalculator en selecteer Verdelen als bewerking. Dit zal de gecorrigeerde volledige beeldsetproduceren, waarin elk beeld is gecorrigeerd voor de niet-uniformiteit op het gebied van verlichting en op de detector.
  2. Uitlijning van afbeeldingsstapels
    1. Installeer de uitlijning per vaste regio(supplementisch bestand 1)door op Plug-ins te klikken om de uitlijning per vaste regio te corrigeren ( Supplementaal bestand 1 ) door op Plug-ins te klikken | Installeer PlugIn,navigeert naar de map met het plug-inbestand en selecteer de plug-in. Start ImageJ opnieuw op na het installeren van de plug-in.
      OPMERKING: Deze plug-in lijnt afbeeldingen uit op basis van het principe 'minste vierkanten'15.
    2. Teken een ROI op de gecorrigeerde volledige beeldset die meerdere axonen omspant en niet verder reikt dan de proximale en distale grenzen van de geactiveerde fluorescentie binnen elk van de axonen. De geometrie van het gebied is onbelangrijk, maar met uitzondering van gebieden waarin structuren van vorm of grootte veranderen, zal de uitlijning verbeteren.
    3. Voer de uitlijningsplug-in uit door op Plug-ins te klikken | Uitlijning per vast gebied. De plug-in plaatst een standaard maximum van 2 pixels op de verplaatsing tussen frames, maar dit kan worden aangepast in het eerste pop-upvenster als er een significante afwijking van het monster is. De uitlijning kan enkele minuten duren, afhankelijk van de grootte van de afbeeldingsstapel.
    4. Inspecteer de uitgelijnde stapel visueel om de kwaliteit van de uitlijning te beoordelen. Sommige frames moeten dan mogelijk handmatig worden uitgelijnd, omdat de automatische uitlijning mogelijk niet goed functioneert voor grote schommelingen in fluorescentie tussen frames. Dit kan worden bereikt tijdens het bekijken van een frame dat moet worden verschoven door te klikken op Afbeelding | Transformatie | Vertalen. Klik op Nee op de volgende pop-up met de vraag of de hele stapel moet worden vertaald. Gebruik alleen gehele pixelwaarden in de vertaling en zorg ervoor dat het vervolginterpolatiemenu is ingesteld op Geen,omdat fractionele pixelverschuivingen of interpolatie de gegevens wijzigen als gevolg van het opnieuw samplen van de pixelintensiteiten.
    5. Sla dit op als de uitgelijnde volledige afbeeldingsset.
  3. Meting van fluorescentieintensiteiten
    1. Teken een ROI met behulp van het gereedschap Hoek op het eerste frame van de uitgelijnde volledige afbeeldingsset met de eerste arm langs één rand van het geactiveerde gebied, loodrecht op de axonen en de tweede arm verticaal. Druk op de 'm' toets om de hoek te meten, die de oriëntatie van de axonen in het gezichtsveld beschrijft.
    2. Stel de schaal van de afbeeldingen zo in dat afmetingen in micron worden gemeten door op Analyseren te klikken | Schaal instellen en de juiste waarden invoeren.
    3. Open de ROI-manager door op Analyseren te klikken | Hulpmiddelen | ROI Manager. Voor de pulse-escape paradigma, overslaan naar stap 8.3.7. Voor de puls-spread, blijven stap 8.3.4.
    4. Teken een vierkante ROI van alle dimensies en klik vervolgens op Bewerken | Selectie | Opgeven. Controleer of de optie Geschaalde eenheden is ingeschakeld en stel de ROI in op een breedte van 15μm en een hoogte gelijk aan of groter dan de hoogte van de afbeelding.
    5. Draai de ROI met de in stap 8.3.1 gemeten hoek door op Bewerken te klikken | Selectie | Draai om het loodrecht op de axonen te maken en plaats de ROI met één kant langs de proximale rand van het geactiveerde gebied. Voeg deze ROI, die we zullen verwijzen naar als de proximale gids ROI, aan de manager door te drukken op de 't' toets.
    6. Sleep de ROI om af te stemmen op de distale rand van het geactiveerde gebied en voeg deze opnieuw toe aan de ROI-manager door op de 't'-toets te drukken. We zullen verwijzen naar dit als de distale gids ROI. De proximale en distale gids ROI's zullen later worden gebruikt om de flankerende meting ROI's te trekken.
    7. Selecteer axonen voor kwantificering, met behulp van de timelapse beeldreeks die is verkregen in stap 5.11 hierboven. Deze beeldsequentie is nuttig voor dit doel omdat het de zwakke autofluorescentie van de axonen vastlegt, onthullend hun morfologie buiten het geactiveerde gebied.
      OPMERKING: Axonen die niet aan de volgende criteria voldoen, zijn uitgesloten van de analyse:
      1. Axonen moeten scherp zijn over de gehele lengte van alle meetvensters.
      2. Axonen moeten zich binnen 5° loodrecht op de proximale en distale uiteinden van het activeringsgebied bevinden.
      3. Axonen mogen geen invagaties hebben binnen 5μm van de proximale en distale uiteinden van het activeringsgebied.
      4. Sluit axonen uit die zichtbaar van vorm veranderen tijdens de beeldvorming.
      5. Sluit axonen uit die ongezond lijken, zoals blijkt uit de afwezigheid van een discreet geactiveerd gebied in de post-activeringsafbeelding(figuur 2C, onder), omdat dit wijst op diffusieve dispersie van de geactiveerde fluorescentie, wat gebeurt wanneer de axon sterft.
    8. Observeer het bleekbeeld met lange belichting vanaf stap 5.5 voor autofluorescente structuren binnen axonen. Deze fluorescentie is te wijten aan flavins in mitochondriën16. Sluit axonen uit van de analyse als deze mitochondriën lijken afgerond of gefragmenteerd(Figuur 2D, bodem), in tegenstelling tot uitgebreide, lineaire structuren (Figuur 2D, boven), omdat dit een indicatie van metabole daling.
    9. Met behulp van de hierboven gecreëerde proximale en distale gids-ROI's, trekt u drie meting-ROI's per axon die worden geanalyseerd: een centraal venster dat de axon binnen het 40 μm geactiveerde gebied omvat, en twee flankerende vensters met breedte die worden beperkt door flankerende venster 15 μm ROIs en hoogte die wordt beperkt door de diameter van de axon aan de rand van het activeringsgebied. Voeg alle drie de regio's toe aan de ROI-manager. Voor glycolytisch geremde axonen, teken een enkel gebied dat niet meer dan 5 μm breed is in het midden van het geactiveerde gebied en dat zich niet buiten de axon uitstrekt. Voor het puls-escape paradigma is het geactiveerde gebied slechts 5 μm breed, dus het hele venster moet worden gebruikt.
    10. Herhaal stap 8.3.9 voor alle axonen die voldoen aan de criteria van de stappen 8.3.7 en 8.3.8.
    11. Actieve metingen instellen op gemiddelde pixelintensiteit door op Analyseren te klikken | Stel Metingen in en selecteer de optie Gemiddelde grijze waarde. Zorg ervoor dat er geen andere meetopties worden gecontroleerd.
    12. Selecteer alle ROI's in het venster ROI Manager door het venster te selecteren en op 'Ctrl' + 'a' te drukken. Klik in het venster ROI Manager op Meer | Multi Maat om de fluorescentieintensiteiten te meten. Kopieer de gegevens uit het resultatenvenster naar een spreadsheet voor verdere analyse.
    13. Actieve metingen instellen op regiogebied door op Analyseren te klikken | Stel Metingen in en selecteer de optie Gebied. Zorg ervoor dat er geen andere meetopties worden gecontroleerd.
    14. Herhaal stap 8.3.12. Het is alleen nodig om één rij van de resultaten voor het gebied te kopiëren, omdat het gebied niet met de tijd varieert.

9. Photobleach correctie

  1. Trek in de gegevensspreadsheet voor glycolytisch geremde axonen de gemiddelde fluorescentie van frame 1 (het pre-activeringsframe) af van de gemiddelde fluorescentie van elk frame vanaf frame 3 (het eerste timelapseframe) voor een bepaalde ROI. De resultaten zijn de achtergrond-afgetrokken middelen.
  2. Plot de gegevens als een scatterplot met de framenummers als de abscissa. Pas een exponentiële trendlijn aan de gegevens van elke ROI (de meeste spreadsheetprogramma's hebben deze functie) met een vergelijking in de vorm van Ae-bx. Deze vergelijking is gelijk aan de fotobleaching functie Ft = F0 * e-tɣ waar F0 is de fluorescentie op het eerste frame van de timelapse, ɣ is de exponentiële bleken tarief, t is de tijd, en e is de natuurlijke logaritme basis.
  3. Herhaal stappen 9.1.1-9.1.2 voor alle ROI's van alle axonen van de glycolytically geremde zenuwen. Voor de meest nauwkeurige schatting van de fotobleaching snelheid, gebruik ten minste 15 axonen in totaal van ten minste 5 afzonderlijke zenuwen. Gebruik het gemiddelde van de exponentiële bleken tarieven (ɣ) van alle geremde axonen om de experimentele gegevens te corrigeren voor fotobleaching. Voor elk experiment of elke studie moet een nieuwe kalverkalibratie worden uitgevoerd, omdat fotobleaching afhankelijk is van de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen en de laserkracht, die in de loop van de tijd kunnen veranderen.
  4. Herhaal stap 9.1.1 voor alle regio's van axonen afgebeeld met normale zoutoplossing (d.w.z. niet glycolytisch geremd).
  5. Verdeel elk gegevenspunt door e-tɣ, met behulp van tijd voor t en de gemiddelde ɣ gevonden in stap 9.1.3. Dit zijn de fotobleach-gecorrigeerde middelen.
  6. Vermenigvuldig elk gegevenspunt met het gebied voor dat gebied van belang om de totale fluorescentie in dat gebied op elk moment te vinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 3 toont representatieve beelden van puls-escape en pulse-spread experimenten. We hebben verschillende studies gepubliceerd die gegevens beschrijven die zijn verkregen met behulp van de puls-escape-methode en onze methoden voor de analyse van die gegevens5,6,7,8,17. Hieronder laten we zien hoe de pulsspreadgegevens informati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er moet aandacht worden besreed bij de analyse van puls-escape en pulse-spread experimenten omdat er een aanzienlijk potentieel is voor de invoering van fouten tijdens de nabewerking, voornamelijk tijdens de vlakke veldcorrectie, beelduitlijning en bleekmiddelcorrectie. Correctie op vlak veld is noodzakelijk om te corrigeren voor niet-uniformiteit in de verlichting, wat resulteert in een val in intensiteit over het gezichtsveld van centrum naar periferie. De mate van niet-uniformiteit is golflengteafhankelijk en moet dus...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Paula Monsma bedanken voor instructie en hulp met confocale microscopie en scheenbeen zenuwdissectie en Dr. Atsuko Uchida, Chloe Duger en Sana Chahande voor hulp bij de muishouderij. Dit werk werd mede ondersteund door collaborative National Science Foundation Grants IOS1656784 aan A.B. en IOS1656765 naar P.J., en National Institutes of Health Grants R01 NS038526, P30 NS104177 en S10 OD010383 naar A.B. N.P.B. werd ondersteund door een fellowship van het Postdoctoral Scholars Program van de Ohio State University President.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mmBioptechs1907-1422-100inner gasket
2-deoxy-D-glucoseSigmaD6134
30mm Round Gasket w/ HolesBioptechs1907-08-750outer gasket
35 x 10mm dishThermo Fisher153066dissection dishes
40mm round coverslipsBioptechs40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tipBD309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal systemAndoroutfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chlorideFisherC79
CoverslipsFisher12-541-Bfor fluorescein slide
D-(+)-glucose solutionSigmaG8769
Dissecting pinsFine Science Tools26001-70
Dissection forcepsFine Science Tools11251-30fine tipped forceps
Dissection microscopeZeiss47 50 03
Dissection pan with waxGinsberg Scientific568859
Dissection scissorsFine Science Tools14061-09initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamberBioptechs060319-2-03
Fluorescein sodiumFluka46960
Inline solution heaterWarner InstrumentsSH27-B
Laminectomy forcepsFine Science Tools11223-20initial dissection forceps
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
Microaqueduct slideBioptechs130119-5
Microscope slidesFisher12-544-3for fluorescein slide
Microscope stage insertApplied Scientific InstrumentationI-3017
Objective heater systemOkolabOko Touch with objective collar
Objective oil - type ANikondiscontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objectiveNikonMRD01901
Potassium chlorideFisherP217
Potassium phosphateSigma-AldrichP0662
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6297
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium iodoacetateSigma-AldrichI2512
Syringe pumpSage InstrumentsModel 355
Tubing adapter - femaleSmall Parts Inc.1005109
Tubing adapter - maleSmall Parts Inc.1005012
Tygon tubingBioptechs1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissorsFine Science Tools15018-10fine scissors

Referenties

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fotoactiveerbaar GFPspinning disk confocale microscopiepulse-escape methodepulse-spread methodefluorescentiemicroscopieaxonaal transportmathematische modelleringzuurstofrijke zoutoplossing
Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.