Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61282

⸱

9 september 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol demonstreert een eenvoudige methode voor het traceren van ventrale tegmentale gebied (VTA) glutamaatprojecties naar de hippocampus. Fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen werd gecombineerd met CA1-opname om aan te tonen hoe VTA-glutamaatterminals ca1-putatieve piramidale vuursnelheid in vivo moduleren.

Samenvatting

Optogenetische modulatie van neuronsubpopulaties in de hersenen heeft onderzoekers in staat gesteld neurale circuits in vivo en ex vivo te ontleden. Dit biedt een premisse voor het bepalen van de rol van neurontypen binnen een neuraal circuit en hun betekenis in informatiecodering ten opzichte van leren. Evenzo kan de methode worden gebruikt om de fysiologische betekenis van twee of meer verbonden hersengebieden bij wakkere en verdoofde dieren te testen. De huidige studie laat zien hoe VTA glutamaat neuronen moduleren de vuursnelheid van putatieve piramidale neuronen in de CA1 (hippocampus) van verdoofde muizen. Dit protocol maakt gebruik van adeno-geassocieerd virus (AAV)-afhankelijke etikettering van VTA-glutamaatneuronen voor het traceren van VTA presynaptische glutamaatterminals in de lagen van de hippocampus. Expressie van lichtgestuurde opsin (channelrhodopsine; hChR2) en fluorescentie-eiwit (eYFP) die door de AAV-vector werd opgeslagen, maakte anterograde tracing van VTA-glutamaatterminals en fotostimulatie van VTA-glutamaatneuroncellichamen (in de VTA) mogelijk. Acute siliciumelektroden met hoge impedantie werden in de CA1 geplaatst om multi-unit en single-unit reacties op VTA-fotostimulatie in vivo te detecteren. De resultaten van deze studie tonen de laagafhankelijke verdeling van presynaptische VTA-glutamaatterminals in de hippocampus (CA1, CA3 en DG) aan. Ook verhoogde de fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen de vuur- en burstsnelheid van putatieve CA1-piramidevormige eenheden in vivo.

Inleiding

In het afgelopen decennium is een reeks genetische hulpmiddelen ontwikkeld om de specificiteit van neuron-type modulatie te verhogen, en het in kaart brengen van complexe neurale netwerken1. Met name neurotrope virussen met een inherent vermogen om te infecteren en te repliceren in neuronale cellen zijn ingezet om specifieke eiwitten in neuronsubtypen uit te drukken of af te zwakken. Bij het herbergen van fluorescentie-eiwitten of genetisch gecodeerde synaptische activiteitsindicatoren labelen en afbakenen AAV-vectoren neurale netwerken in hersengebieden2,3. De keuze van een promotor in de AAV-constructie stuurt de expressie van de vector in neurontypen met een bepaald specificiteitsniveau(promotorafhankelijke expressie). Echter, door Cre-lox recombinatie, AAV constructies worden ingezet met een grotere specificiteit voor neuron labeling4,5,6,7. Van belang, foto geactiveerde microbiële opsinen en fluorescentie-eiwitten verpakt in AAV vectoren kunnen worden uitgedrukt in verschillende neuron subtypes8, en zijn ideaal voor beeldvorming, neuron-type circuit tracing, en fotomodulatie9,10.

AAV's construeren stereotactically geïnjecteerd in een hersengebied (of kern) drijft de expressie van het reporter eiwit in de soma, dendriet, en axonen terminals. Neurale expressie van AAV met een reportergen (eYFP) vergemakkelijkt het labelen van neuroncellichamen en anatomische tracering van projecties van en naar andere hersengebieden11,12,13,14. AAV-eYFP constructies met lichtgestuurde opsin (bijv. hChR2), kunnen worden ingezet als een hulpmiddel voor beeldvorming6,15 en stimulatiegebaseerde fysiologische tracering van neurale projecties om hersengebieden in vivo te targeten16. Afhankelijk van het AAV-serotype kan de richting van neuronetikettering anterograde of retrograde11,12zijn . Eerdere studies hebben aangetoond dat AAV5 anterogradely reist in neuronen12. Zo produceert fotostimulatie van cellichamen die hChR2 uitdrukken presynaptische effecten elders in de hersenen (doel)17.

Hier werd AAV (serotype 5) met een CaMKIIα promotor gebruikt om eYFP (reporter) en hChR2 (opsin) uit te drukken in VTA glutamaat neuronen en axonale projecties. De resultaten van deze studie tonen de laagafhankelijke verdeling van VTA-glutamaat presynaptische terminals in de CA1-, CA3- en DG hippocampale regio's aan. Ook verhoogde fotostimulatie van VTA-glutamaatneuronen ca1 multi-unit en single-unit firing rates in vivo in vergelijking met baseline waarden. Dit protocol maakt gebruik van betaalbare tools en commercieel beschikbare software die de kwaliteit van gegevens die zijn verkregen uit neurale circuit tracing experimenten kan verhogen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele en dierbehandelingsprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Louisiana State University School of Veterinary Medicine.

1. Proefdier

  1. Gebruik muizen van 5-6 weken oud.
  2. Huis 3-5 dieren per kooi onder standaardomstandigheden van 12 uur afwisselend licht en donkere cyclus. Voedsel en water moeten ad libitum worden verstrekt.

2. Craniotomie en dierlijke voorbereiding

OPMERKING: Deze sectie beschrijft pre- en peri-operatieve procedures voor craniotomie van muizen. Gebruik standaard stereotactische apparatuur en geschikte coördinaten (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML en Dorsoventral: DV). Raadpleeg een muishersenatlas om de coördinaten voor het hersengebied van belang te bepalen.

  1. Verdoof muizen door intraperitoneale ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) cocktailinjectie. Voer een teenknijptest uit om de afwezigheid van gevoel voor het begin van de operatie te garanderen.
    OPMERKING: Als alternatief kan isofluraan anesthesie met een geschikte neuskamer ook voor deze stap worden gebruikt.
  2. Bevestig het hoofd van het dier voorzichtig op het stereotaxic-apparaat.
    OPMERKING: Het is belangrijk om tijdens dit proces voorzichtig met dieren om te gaan. Controleer ook de ademhalingsfrequentie en andere vitale functies voordat u doorgaat met de operatie. Laat het dier ~7 min rusten om stress te verminderen.
    1. Plaats een verwarmingskussen op het stereotaxic frame zodat het lichaam van het dier erop ligt. Dit zal helpen de lichaamstemperatuur te handhaven en het dier warm te houden tijdens de procedure. Houd het verwarmingskussen vast voor postoperatieve zorg en herstel.
  3. Gebruik een tondeuse om haar over de hoofdhuid te verwijderen en de huid schoon te maken met een jodiumoplossing.
    1. Breng topische lidocaïne aan om het gevoel op de hoofdhuid te blokkeren.
    2. Gebruik een scalpel om een midline hoofdhuidincisie te maken die zich uitstrekt van het frontale naar het occipitale gebied.
    3. Reinig het incisiegebied met jodiumoplossing en stel vervolgens de calvaria bloot.
      OPMERKING: Een kleine hoeveelheid van 3% waterstofperoxideoplossing kan worden toegepast om periosteum uit de calvaria te verwijderen. Dit zal de zichtbaarheid van oriëntatiepunten (bregma en lambda) en hechtingen vergroten.
    4. Bepaal met behulp van een stereotactische atlas van de muishersenen de AP- en ML-coördinaten ten opzichte van het bregma.
    5. Plaats voor VTA-injectie een ultrafijne stompe naaldspuit (bijv. Neuros-spuit) op de coördinaten AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm ten opzichte van het bregma.
    6. Gebruik een boorgereedschap om een gat van 1 mm (craniotomie) in de schedel te boren op de gemarkeerde AP/ML-coördinaat.
      OPMERKING: Deze stap vereist een aanzienlijke mate van voorzichtigheid. Tijdens het boren moet minimale druk worden uitgeoefend om te voorkomen dat de boor het hersenweefsel verplettert. In de huidige studie was de boor 0,8 mm en de boorsnelheid was ingesteld op 15.000 tpm.
      LET OP: Als waterstofperoxide is gebruikt bij het reinigen van de incisie of calvaria, zorg dan voor volledige verwijdering van de oplossing of laat volledige droogheid toe voordat u gaat boren.

3. AAV cocktail injectie

OPMERKING: Deze sectie beschrijft het proces voor AAV-injectie in de VTA van volwassen C57BL/6 muizen (23–27 g). De beschreven methode kan worden gebruikt voor AAV-injectie in elk hersengebied met behulp van standaard stereotactische apparaten en geschikte coördinaten. Om dit protocol aan te tonen, werden eYFP en hChR2 uitgedrukt in VTA-glutamaatneuronen met behulp van AAV5-gemedieerde transfectie onder een CaMKIIα-promotor (Figuur 1). Cre-lox recombinatie kan ook worden gebruikt voor deze stap.

  1. Monteer een spuit met ultrafijne stomppuntnaald (32 G; 5 μL capaciteit met 100 nL nauwkeurigheid) op een injector. Bevestig de spuithouder op een micromanipulator.
    OPMERKING: Voor deze procedure werd een handmatige spuithouder met 1,6 nL kalibratie gebruikt. Er kan ook een geautomatiseerde injector worden gebruikt.
  2. Vul de spuit met dubbel gedestilleerd water om de vloeistofstroom te reinigen en te testen.
  3. Ontdooi aliquots van AAV (serotype 5) cocktail op ijs. AAV's kunnen het beste bij -80 °C worden opgeslagen om virale titer te behouden voor een goede expressie.
  4. Vul de gemonteerde spuit met 1.000 nL AAV-oplossing (10 ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4). Doseer 10 nL van de AAV-oplossing om de vloeistofstroom te bevestigen voordat u de naald op een injectieplaats laat zakken.
  5. Gebruik een micromanipulator om de naald stereotactisch in de gewenste diepte te laten zakken (DV-coördinaat). Laat de spuit na het verlagen van de naald tot de gewenste diepte 10 minuten op zijn plaats blijven voordat u de injectie ondergaat.
    OPMERKING: Voor deze procedure werd de naald in de VTA neergelaten op een diepte (DV) van 4,5 mm van het piale oppervlak van de hersenen. Gebruik voor andere hersengebieden de juiste dorsoventrale coördinaat (zie de muishersenatlas).
  6. Injecteer 600–800 nL AAV in de VTA. Het injectievolume kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de doellocatie.
    1. Lever de AAV-oplossing met een snelheid van 60 nL/min (interval van 3 minuten).
    2. Om eYFP en hChR2 uit te drukken in VTA glutamaat neuronen en projecties, injecteer AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      OPMERKING: Cre-lox recombinatiemethode kan ook worden gebruikt, afhankelijk van het doel van het experiment.
    3. Laat de naald na AAV-injectie 15 minuten op zijn plaats blijven. Dit vermindert diffusie en terugstroming.
  7. Trek de spuitnaald terug en hecht vervolgens de incisie om de wond te sluiten.
  8. Antibiotica en analgesie toedienen als onderdeel van postoperatieve zorg. Plaats de muis op een warm opgevuld platform en houd het dier in de gaten tot het wakker is.
    OPMERKING: Na 3 weken injectie kan AAV-expressie worden waargenomen door fluorescentiedetectie van reportereiwit (eYFP) in muishersensecties. Ook kunnen fotostimulatie-experimenten na 3 weken worden uitgevoerd (figuur 2).

4. Set-up voor in vivo neurale opnames met optogenetica

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de stappen voor acute neurale opname met de optogenetische tracering van een hersencircuit (VTA glutamaat neuron projectie naar de CA1). Controleer indien nodig het systeem (versterker en aansluitingen) op elektrische ruis en aardingsproblemen voordat u met deze stap begint. Het uitvoeren van deze stap in een Kooi van Faraday kan helpen bij het elimineren van elektrische ruis in de opname.

  1. Verdoof muizen na 3 weken na AAV-injectie met intraperitoneale urethaaninjectie (0,2 mg/kg).
    LET OP: Urethaan is kankerverwekkend en moet voorzichtig worden behandeld tijdens het dragen van beschermende kleding. Ook is het toedienen van urethaan anesthesie in deze concentratie niet-overleving.
  2. Breng het hoofd van het dier aan op een stereotiep frame zoals eerder beschreven (stap 2.2, figuur 3A). Voer een craniotomie uit om de dura bloot te leggen (figuur 3A). Gebruik een boorgereedschap (bitgrootte: 0,8 mm, snelheid: 15.000 tpm) om een deel van het pariëtale bot te verwijderen.
    1. De craniotomie moet ongeveer 3 mm x 4 mm breed zijn. Breng druppels kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) aan op dit gebied om uitdroging te voorkomen.
  3. Gebruik onder een dissectie (digitale) microscoop een gebogen naaldpunt (27 G) om de blootgestelde dura te verwijderen. Pas op dat u de delicate pialbedekking en corticale weefsels in dit gebied niet uit elkaar trekt.
  4. Boor een gat in het achterhoofdsbeen (bitgrootte: 0,8 mm, snelheid: 10.000 tpm) om de grondschroef (pankop Phillips-schroef; M0,6 x 2,0 mm).
  5. Sluit een roestvrijstalen aardingsdraad aan.
    OPMERKING: Er kunnen ook andere soorten draden worden gebruikt (figuur 3b).
  6. Gebruik voor gecombineerde fotostimulatie (VTA) en neurale opname (CA1) een multi-rail stereotaxic apparaat uitgerust met ultrafijne (10 μm of 1 μm) micromanipulatoren. Monteer de optische vezel en de opnameneurale sonde op respectievelijk 10 μm-bereik en 1 μm-bereik micromanipulator.
    1. Gebruik indien nodig een adapter voor de hoofdtrapsonde (afbeelding 3c).
      OPMERKING: In het huidige protocol was een 32-kanaals hoofdtrap uitgerust met een adapter voor het vasthouden van een 4-kanaals opnameelektrode (afbeelding 3d). De roestvrijstalen aarddraad werd aan de aardingspoort van de adapter gesoldeerd.
  7. Bij coördinaten AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, laat de 400 μm diameter optische vezel in de VTA zakken.
    1. Voordat u de optische vezel verlaagt, sluit u de ferrule aan op een glasvezelkabel (met roestvrijstalen of keramische ferrule) die is gekoppeld aan een vezelgekoppelde LED-bron.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de lichtintensiteit en scherpstelling naar wens zijn ingesteld. De keuze van de LED-lichtbron moet overeenkomen met de opsins die het doelwit zijn. Hier werd een 470 nm (blauw licht) LED-driver gebruikt voor hChR2-fotoactivering (figuur 4a).
    2. Om de lichtpuls te synchroniseren met de neurale opname, sluit u de LED-driver en de digitale IN-poort van de opnamecontroller aan op een transistor-transistorlogica (TTL) pulser(afbeelding 4b). Dit kan worden bereikt met behulp van een BNC-splitter.
      OPMERKING: Het gebruik van een TTL-pulser biedt de flexibiliteit om de gewenste frequentie en duur van de pulstrein digitaal in te stellen. In het huidige protocol werden 10 ms lichtpulsen geactiveerd bij 50 Hz18. Voor TTL-bediening van het LED-stuurprogramma schakelt u de driver in op "trigger". In deze modus kan de lichtintensiteit worden geregeld door aan de "knop" te draaien. De stimulatiefrequentie kan worden aangepast aan experimentele variabelen en kan variëren van 1 tot 100 Hz. Voor neurale circuit tracing wordt een stimulatiefrequentie van >20 Hz aanbevolen.
    3. Pas de knop aan om de effectieve intensiteit te bepalen die een reactie kan genereren zonder foto-elektrische artefacten te produceren. Indien nodig, herpositioneer de optische vezel om artefacten te elimineren19.
      OPMERKING: De LED-driver die voor het huidige protocol wordt gebruikt, produceert een lichtvermogen van ~ 21,8 mW.

5. Neurale opname

  1. Gebruik een acute neurale sonde met een 15-50 μm dikke schacht, met een lengte van ten minste 5 mm.
    OPMERKING: Voor opname van diepe hersenstructuren zijn neurale sondes met een langere schacht nodig. In de huidige studie werd een sonde met een schachtlengte van 20 mm gebruikt.
  2. Sluit de voorversterkerkoptrap aan op de opnamecontroller via een spi-kabel (serial peripheral interface). Controleer de kleurverlichting van de LED's op de poorten van de opnamecontroller. Groene en gele LED's geven de juiste spanning aan op de aangesloten versterkerplaat. Rode LED geeft een werkende software-head stage control aan (Figuur 5b).
  3. Plaats met behulp van een micromanipulator de contactplaatsen van de elektrode in de piramidale cellaag van de CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 tot 1,2 mm).
    OPMERKING: De optische vezel en elektrode kunnen in andere gewenste hersengebieden worden geplaatst voor fotostimulatie en opname.

6. Versterker- en filterinstellingen

  1. Sluit het versterkersysteem van de opnamecontroller aan op een computer via een USB 3.0-poort. Sluit de hoofdtrap aan op de versterker met behulp van de SPI-kabel. Start de controllersoftware. Als het systeem niet correct is aangesloten, wordt een bericht 'apparaat niet gevonden' weergegeven.
  2. Klik op Uitvoeren om de activiteit op de kanalen weer te geven. Elke golfvorm wordt uitgezet als de spanning (y-as) versus tijd (x-as). Afhankelijk van de regio van belang, pas de spanning en tijdschalen aan om de golfvormweergave aan te passen.
  3. Als slechts een paar kanalen actief zijn, schakelt u ongebruikte kanalen uit om de bestandsgrootte op de opslagschijf te verkleinen.
  4. Stel de samplingfrequentie en cut-off frequenties in door bandbreedteparameters op de acquisitiesoftware te bewerken. Stel voor opname met één eenheid de bovenste en onderste afsluitfrequenties in op respectievelijk 300 Hz en 5.000 Hz. Verander de bemonsteringsfrequentie van de versterker in 30 kS/s.
    OPMERKING: Als u een hoge bemonsteringsfrequentie kiest, wordt een grotere bestandsgrootte gemaakt.
  5. Controleer voor het opnemen de integriteit van de elektrodekanalen door de impedantie bij 1.000 Hz te meten. Dit kan door de functie in de gebruikersinterface (controllersoftware) te starten. Een werkkanaal moet een impedantiewaarde hebben die varieert van 0,1 tot 5 MΩ.
  6. Als een audio-uitgang (luidspreker) is aangesloten op de ANALOG OUT-poort, past u de versterking en geluiddemper aan voor een optimaal spikegeluid.
  7. Als u de TTL-pulstreinmarkering in de spike-opname wilt weergeven, schakelt u het display voor de DIGITAL IN-markering in. Als u de tijdstempel van de pulstrein wilt opnemen, schakelt u de digitale in-kanaalweergave in vóór het hoofdexperiment.
    OPMERKING: Er is meestal meer dan één "DIGITAL IN" kanaal (1 of 2). Zorg ervoor dat de BNC-kabel van de TTL-pulser is aangesloten op de "DIGITAL IN"-poort die is geselecteerd voor weergave in de opnamecontrollersoftware.
  8. Voor realtime weergave van de piekgolfvorm opent u het venster spikebereik en stelt u de drempel in met de muisklik.
  9. Inspecteer het geluidsniveau door het Wortelgemiddelde Vierkant (RMS in μV) te controleren. Voor schone spike-opname heeft het de voorkeur dat de neurale piekdrempel ten minste 5x RMS is.
  10. Zodra de installatie is voltooid, selecteert u de indeling voor bestandsuitvoer.
    OPMERKING: Hier is de CA1 neural spike opgenomen in .rhd formaat. Andere bestandsindelingen (.rhs en .dat) kunnen ook worden geselecteerd om overeen te komen met de bestandsindelingen die door de analysesoftware zijn toegestaan.

7. In vivo optogenetische opname en instellingen

  1. Open de pulsregelingssoftware (TTL) die verschillende instelbare pulsparameters weergeeft. Selecteer de juiste COM-poort op de software. Stel de pulsparameters in door de trein- en groepsinstellingen aan te passen.
    OPMERKING: De pulsconditie moet worden bepaald door experimentele variabelen en ontwerp te overwegen.
  2. Klik op de versterkercontrollersoftware op Uitvoeren om neurale spikes in de hippocampus of het gewenste hersengebied te detecteren. Pas indien nodig de elektrodediepte aan om levensvatbare en actieve neuronen te detecteren.
  3. Zodra extracellulaire spanningsactiviteit is gedetecteerd, observeer je de pieken bij aanvang gedurende 15 minuten en controleer je de vitale functies van het dier. Test ook de lichtpuls om responsieve neuronen binnen het CA1- of gewenste anatomische doelgebied te detecteren.
    OPMERKING: Controleer op foto-elektrische artefacten en elimineer door de lichtintensiteit of de positie van de glasvezel aan te passen.
  4. Registreer de basisactiviteit gedurende ~ 10 minuten voordat u de lichtpuls op de gewenste frequentie activeert (figuur 5a, b). Dit maakt het mogelijk om vuur- of burstsnelheden met en zonder verlichting te vergelijken.
    OPMERKING: In het huidige onderzoek werd de uitgangsactiviteit gedurende 10 minuten zonder verlichting geregistreerd, gevolgd door verlichting bij 50 Hz (Film 1).

8. Analyse

  1. Converteer het .rhd-bestand naar Nex 5-uitvoerindeling.
  2. Bestandsnaam verwerken. Nex5-bestand in een offline sorteersoftware om rastertreinen en golfvormen van één eenheid te detecteren (figuur 5a–b).
    1. Selecteer het gewenste kanaal in het vervolgkeuzevenster.
      OPMERKING: De continu opgenomen piekgegevens kunnen in een apart venster van het OFSS worden bekeken. De tijdschaal kan ook worden aangepast. Als een tetrode wordt gebruikt, kan de OFSS worden ingesteld om de 4 kanalen als een tetrode te sorteren.
    2. Stel het spanningsniveau in voor drempelovergangsgolfvormextractie.
      LET OP: Gebruik minimaal 5x RMS voor een goede spikedetectie.
    3. Detecteer golfvormen en voer vervolgens pieksortering uit met behulp van valley-seeking (automatisch) of K-means (semi-automatisch) methode. Voeg waar nodig eenheden samen die vergelijkbare regio's van de PCA-ruimte (3D-Principal Component Analysis) bezetten.
    4. Export gesorteerd . Nex5 bestanden voor verdere analyse (figuur 5c–d).
      OPMERKING: Analyseresultaten voor het interspike-interval, de vuursnelheid en de burst-snelheid kunnen worden geëxporteerd naar andere analyseplatforms.

9. Fluorescentiedetectie van AAV-expressie

  1. Euthanaseer het dier na de opname in een isofluraankamer.
  2. Voer transcardiale perfusie uit met 10 mM PBS (~10 ml), gevolgd door 4% fosfaatgebufferd paraformaldehyde (PB-PFA, ~10 ml).
  3. Verwijder de hele hersenen intact en bevestig het in 4% PB-PFA gedurende 48 uur.
  4. Breng de vaste hersenen over in 4% PB-PFA met 30% sacharose voor cryopreservatie bij 4 °C. Na 72 uur doorsnijd je de hersenen in een cryostaat en monteer je plakjes op een met gelatine bedekte glijbaan.
    OPMERKING: In het huidige protocol zijn secties met het gesloten deel van de hippocampus (rostral) geselecteerd om terminals met AAV-label in dg, CA3 en CA1 aan te tonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Anterograde-tracering

AAV-expressie werd geverifieerd door immunofluorescentiebeeldvorming van reportereiwit (eYFP) in de VTA van C57BL/6 muizen 21 dagen na injectie (Figuur 2). Succesvolle anterograde-etikettering van presynaptische VTA-glutamaatprojecties in de hippocampus werd ook geverifieerd door eYFP-detectie in de lagen van DG, CA3 en CA1 (figuur 6a–d; Film 2 en 3).

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In het afgelopen decennium is het ontwerp van AAV-constructies aanzienlijk vooruitgegaan. Als zodanig zijn meer neuronspecifieke promotors opgenomen in een reeks AAV-serotypen voor verbeterde transfectiespecifiekheid14. Door genen voor fluorescentie-eiwitten, transporters, receptoren en ionenkanalen te combineren, bestaan er nu bibliotheken van AAV voor beeldvorming, neuromodulatie en synaptische activiteitsdetectie. In in de handel verkrijgde AAV-constructies maakt een combinatie van een genetisc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt gefinancierd door CBS Bridging Grant toegekend aan OOM. OOM, PAA en AS ontwierpen het onderzoek en voerden de experimenten uit. AS en PAA analyseerden de resultaten. OOM en PAA maakten het manuscript klaar. We danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) voor het beschikbaar stellen van de AAV voor ons gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3% WaterstofperoxideFisher chemicalH312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPAddgenePlasmid #26969
BNC kabelAmazon
BNC SplitterAmazon
Keramisch Split Mating Sleeve voor Ø1.25mm Ferrules.ThorlabsADAL1-5
BoorDremelLR 39098
Gelatine gecoate slidesFisher scientificOBSLD01CS
Hamilton's spuit (Neuros)WPI Inc.06H
Head stage adapterNeuronexusAdpt-Q4-OM32
High impedance silicium probeNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording ControllerINTANRHD2000
JodoploogjeDynarex1425
IsofluraanPiramalNDC 66794-017-25
KetamineSpectrumK1068
LED DriverThorlabsLEDD1B
LED lichtbron (470 nm)-blauw lichtThorlabsM470F3
MicromanipulatorNarishigeM0-203
Optische vezelThorlabsCFMLC14L05
Kopschroef met kruiskop (M0.6 X 2mm)AmazonM0.6 X 2mm
Pre-versterker headstage (32 kanaal)INTANC3314
Stereotactisch frameKopf1530
TTL pulserPrizmatix4031
UrethaamSigmaU2500
XylacineAlfa AesarJ61430
SoftwareBedrijfVersie
Graphpad PrismGraphPad Softwareversie 8
Intan Recording ControllerIntantechversie 2.07
NeuroexplorerNex Technologiesversie 5.215
Plexon Offline Spike SorterPlexon Incversie 4.5
ACSF Samenstelling:
Geoxideerde ACSF met 95% Zuurstof/5%CO2 constant door de ACSF geblazen (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 en 25 Glucose).

Referenties

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10(2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251(2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269(2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528(2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697(2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

VTA glutamaatneuronenhippcampale CA1 laagAAV afhankelijke labelingoptogenetische stimulatieanterograde tracinghoog impedantie elektrodenmulti unit registratiefluorescentie imagingstereotactische chirurgiein vivo optogenetica
Gecombineerde In Vivo anatomische en functionele tracing van Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in de Hippocampus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.