Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Continue meting van biologische ruis in Escherichia Coli met behulp van time-lapse microscopie

3.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61290

⸱

27 april 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk presenteert een microscopiemethode die live beeldvorming van een enkele cel Escherichia coli mogelijk maakt voor analyse en kwantificering van het stochastische gedrag van synthetische gencircuits.

Samenvatting

Het hier ontwikkelde protocol biedt een hulpmiddel om computertracking van Escherichia coli-deling en fluorescerende niveaus gedurende meerdere uren mogelijk te maken. Het proces begint met het screenen op kolonies die overleven op minimale media, ervan uitgaande dat alleen Escherichia coli die de juiste plasmide herbergt, in staat zal zijn om te gedijen in de specifieke omstandigheden. Omdat het proces van het bouwen van grote genetische circuits, waarvoor de assemblage van veel DNA-onderdelen vereist is, een uitdaging is, worden circuitcomponenten vaak verdeeld over meerdere plasmiden op verschillende kopieernummers die het gebruik van verschillende antibiotica vereisen. Mutaties in de plasmide kunnen transcriptie van de antibioticaresistentiegenen vernietigen en interject met middelenbeheer in de cel die leidt tot necrose. De geselecteerde kolonie is ingesteld op een petrischaal met glazen bodem en een paar focusvlakken zijn geselecteerd voor microscopietracking in zowel heldere veld- als fluorescerende domeinen. Het protocol handhaaft de beeldfocus gedurende meer dan 12 uur onder initiële omstandigheden die niet kunnen worden gereguleerd, waardoor een paar problemen ontstaan. Dode cellen beginnen zich bijvoorbeeld op te hopen in het scherpstelgebied van de lenzen na een paar uur beeldvorming, waardoor gifstoffen zich ophopen en het signaal vervaagt en vervaagt. Uitputting van voedingsstoffen introduceert nieuwe metabolische processen en belemmert de gewenste reactie van het circuit. De temperatuur van het experiment verlaagt de effectiviteit van inductoren en antibiotica, wat de betrouwbaarheid van het signaal verder kan schaden. De minimale mediagel krimpt en droogt, waardoor de optische focus in de loop van de tijd verandert. We ontwikkelden deze methode om deze uitdagingen in Escherichia colite overwinnen , vergelijkbaar met eerdere werken die analoge methoden voor andere micro-organismen ontwikkelden. Bovendien biedt deze methode een algoritme om de totale stochastische ruis in ongewijzigde en gewijzigde cellen te kwantificeren, waarbij wordt vastgesteld dat de resultaten consistent zijn met voorspellingen van stroomanalysatoren, zoals aangetoond door een vergelijkbare variatiecoëfficiënt (CV).

Inleiding

Synthetische biologie is een multidisciplinair gebied dat in het afgelopen decennium is ontstaan en tot doel heeft technische ontwerpprincipes te vertalen naar rationeel biologisch ontwerp1,2,3, in een poging om multi-signaalintegratie en -verwerking in levende cellen te bereiken voor het begrijpen van de basiswetenschap4,5, diagnostische, therapeutische en biotechnologische toepassingen6,7,8,9,10. Ons vermogen om de input-output respons van synthetische gencircuits te kwantificeren is revolutionair veranderd door recente vooruitgang in eencellige technologie, waaronder de flow analyzer en live cell imaging met behulp van geautomatiseerde time-lapse microscopie11. Een stroomanalysator wordt vaak gebruikt om de respons van deze circuits in de steady state1,12te meten , en omgekeerde microscopie wordt gebruikt om de dynamische respons van synthetische gencircuits op het niveau van een enkele cel te meten3. Een van de vroege werken in de synthetische biologie betrof bijvoorbeeld de bouw van genetische oscillatornetwerken in levende cellen met behulp van negatieve feedbacklussen met een vertraging3. Later werden de genetische oscillatorcircuits toegepast om de metabolische controle in de dynamische omgeving van levende cellen te begrijpen4. Geautomatiseerde time-lapse microscopie is een methode om dergelijke circuits te karakteriseren. We veronderstellen dat de gastheercellen, Escherichia coli,synchroniseren bij het vormen van microkolonies, waardoor het meten van signaal en berekening van ruis mogelijk is zonder exacte moeder-dochterrelaties te volgen.

Lawaai is een fundamenteel, inherent aspect van biologische systemen die vaak uit meerdere bronnen voortkomen. Denk bijvoorbeeld aan biochemische reacties met signalen die afkomstig zijn van het transport van discrete willekeurige dragers, zoals diffusie van eiwitten13. Deze signalen verspreiden zich met willekeurige fluctuaties14. Andere geluidsbronnen zijn de beschikbaarheid van hulpbronnen, celdeling en variaties in omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid en druk. Biologische signalen die zich voortplanten in synthetische gencircuits hebben vaak een zeer lage signaal-ruisverhouding (SNR), wat de prestaties van dergelijke circuits verstoort. Daarom blijft het ontwerp van genetische circuits een van de meest uitdagende aspecten van genetische manipulatie15. In tegenstelling tot de meeste benaderingen die alleen de gemiddelde genexpressie berekenen (gemeten over de gehele celpopulatie), wordt bijvoorbeeld de variantie van het gemeten signaal overwogen om voorspelbaar gedrag te ontwikkelen via synthetische gennetwerken12. Als zodanig spelen de variabiliteits - of ruisniveaus in de eiwitexpressie een dominante rol bij het ontwerp en de prestaties van analoge en digitale gencircuits1,16,17.

Er zijn vele benaderingen ontwikkeld om de variabiliteit tussen cellen te kwantificeren, onder meer in Escherichia coli3,7,18. Deze methoden worden vaak gebruikt om genactivatie en metabole routes te bestuderen, maar met minder focus op de studie van stochastische geluidsdynamica, zoals het meten en ontwarren van specifieke geluidsbronnen, vooral voor genetische circuits in levende cellen waar dit een fundamentele uitdaging is19,20,21. Verschillende factoren, zowel overgeërfd aan het circuit zelf (intrinsiek) als afgeleid van de gastheercellen (extrinsiek), kunnen de continue prestaties van genetische circuits verstoren. In dit artikel hebben we een protocol ontwikkeld dat tot doel heeft het totale geluid in Escherichia coli-cellen te kwantificeren, inclusief de intrinsieke en extrinsieke geluidsbronnen6,22. Door het totale geluid te kwantificeren en vervolgens de SNR23te evalueren, kan het ontwerp van gencircuits worden verbeterd. Deze methode kan worden aangepast om onafhankelijke geluidsbronnen afzonderlijk te meten, door verschillende fluorescerende eiwitten6,20temonitoren . Voor het hier beschreven protocol houden we de omgevingsomstandigheden goed onder controle en meten we continu de activiteit van cellen zonder invloed van externe factoren. We meten het signaal van fluorescerende eiwitten in enkele cellen in de loop van de tijd en stellen ze tegelijkertijd in beeld onder een agarosesubstraat. De resulterende beelden worden geanalyseerd met behulp van het aangepaste MATLAB van het laboratorium.

Idealiter zal continue meting van de real-time activiteit van fluorescerende eiwitten in een cel nauwkeurige gegevens produceren door de groei en deling van de cellen. Het is echter een uitdaging om dergelijke gegevens te verkrijgen. Dit komt door afbraak van fluorescerende eiwitten, bekend als fotobleken7, wanneer ze worden blootgesteld aan straling in het excitatieproces. Bovendien zijn Escherichia coli-cellen ook gevoelig voor de excitatie, wat kan leiden tot fototoxiciteit7. Beide kwesties beperken de hoeveelheid fotolijsten die kunnen worden verkregen en de tijd tussen verwervingen. Ook het substraat en de mediumtypes (bijv. lysogeney bouillon) die worden gebruikt om de cellen tijdens beeldvorming te laten groeien, spelen een cruciale rol. We raden ten zeerste aan om minimaal medium te gebruiken, dat de niet-fluorescerende achtergrond minimaliseert en de celdelingstijd verlengt.

Bovendien moet het monster worden bereid met inachtneming van de volgende vereisten (1) Een lage celdelingsgraad maakt minder frequente blootstellingen mogelijk om de delingcyclus nauwkeurig in beeld te brengen en de kans op fototoxiciteit en fotobleaching te verminderen. We hebben de acquisitietijd ingesteld op ongeveer de helft van de voorspelde mitosetijd (2) Lage celdichtheid aan het begin van het experiment zorgt voor een betere uniformiteit en trackability van deling. De celdichtheid wordt beïnvloed door de verdunningsverhouding van de Escherichia coli-cellen, wat een belangrijke parameter is voor het succes van dit protocol en voor elk laboratorium moet worden bepaald. Om de verhouding vast te stellen, moet elke nieuwe Escherichia coli-stam of -medium die wordt gebruikt, worden uitgerust met groeisnelheidsgrafieken (aanvullende figuur 1). Een geschikte verhouding is bereikt als cellen kunnen groeien zonder extra schudden na een korte incubatie van een initiële dichtheid van ongeveer OD600nm = 0,1. Cellen in deze fase zullen zich alleen delen afhankelijk van de omgevingstemperatuur (3) Beperking van celbeweging: celbeweging is sterk afhankelijk van de stevigheid van substraat (agarose pad). De stevigheid van het substraat hangt af van de hoeveelheid totale agarose en de gelstollingstijd. Gels kunnen niet 's nachts bij kamertemperatuur worden gestold, omdat de Escherichia coli mitose zal ondergaan. Andere factoren die de substraatstabiliteit beïnvloeden, zijn de hoeveelheid water in het monster en de vochtigheid. Aanvullende kwesties worden in detail besproken in de representatieve resultaten. Dit protocol biedt veel details en gaat geleidelijk van de ene stap naar de andere. Het protocol biedt lange stabiliteit voor beeldvormingsexperimenten en biedt een basistool voor beeldverwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Media- en cultuurvoorbereiding

  1. Bereid stamoplossing van 1.000x carbenicilline (50 mg/ml) of relevant antibioticum.
    1. . Weeg 0,5 g carbenicilline. Voeg 10 ml steriel H2O. Volledig oplossen toe.
    2. Steriliseer de carbenicillinevoorraad via een spuitfilter van 0,22 μm. Aliquot de antibiotica-oplossing en bewaar bij -20 °C.
  2. Voor het bereiden van lysogene bouillon (LB) platen, meng 5 g trypton, 5 g NaCl, 2,5 g gistextract en 7,5 g Bacto agar met 0,5 L steriel h2O. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 20 minuten.
    1. Dompel de gesmolten gelmix gedeeltelijk onder in een waterbad van 50 °C. Voeg 1.000 μL carbenicilline (50 mg/ml) toe.
    2. Bereid Petrischalen in een steriele omgeving. Laat de borden inzetten voordat je ze in de koelkast bewaart.
  3. Bereid voor minimale M9-media afzonderlijke voorraadoplossingen van het volgende: 5x M9-zouten (56,4 g/L), 2 M glucose en 2% biotinevrije casaminozuren. Autoclaaf de oplossingen bij 121 °C gedurende 20 min.
  4. Om 5 Petri-platen te bereiden, mengt u 1125 mg laagsmeltende agar en 400 mg agar met 89,2 ml minimale media (1x M9). Voeg 10 ml 2% casaminozuren (2% [vol/vol]) toe in een Erlenmeyerkolf van 250 ml.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de media op de binnenlippen van de kolf giet.
  5. Magnetron de oplossing in korte bursts van 3 tot 4 seconden. Herhaal dit totdat de oplossing duidelijk is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kookpunt niet bereikt.
  6. Plaats de Erlenmeyerkolf van 250 ml in een warmwaterbad (60 °C) om verder te mengen door diffusie en laat afkoelen tot de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.
  7. Steek de vlam aan op de bord-gietbank.
  8. Voeg snel alle oplossingen toe in de volgende volgorde:
    800 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
    100 μL thiamine (B1)
    1100 μL glucose (2 M)
    100 μL carbenicilline (50 mg/ml).
  9. Wervel de Erlenmeyer om een gelijkmatige verdeling van alle ingrediënten door de agar te garanderen.
  10. Open één bord tegelijk naast de vlam en begin te gieten.
    1. Laat de platen een paar minuten op de bank liggen tot de eerste stolling.
    2. Draai de platen ondersteboven om te voorkomen dat er watercondensatie op de gel druipt.
    3. Laat de platen ongeveer 2 uur stollen bij kamertemperatuur.
    4. Zodra de platen gestold en gedroogd zijn, kunnen ze ongeveer 3 maanden bij 4 °C worden bewaard.

2. Bacteriestammen en plasmiden constructie

OPMERKING: Het genetische circuit bevat één deel; een groen fluorescerend eiwit (GFP) aangedreven door een PtetO promotor resulterend in constitutieve expressie. Alle plasmiden in dit werk werden geconstrueerd met behulp van basismoleculaire kloontechnieken en werden omgezet in Escherichia coli 10β, met behulp van een standaard hitteschokprotocol24. De uiteindelijke constructie werd omgevormd tot Escherichia coli MG1655 wilde type stam om te testen.

  1. Transformeer de gewenste plasmide in Escherichia coli MG1655 cellen met het standaard hitteschokprotocol24.
  2. Kweek de getransformeerde cellen 's nachts op een LB-agarplaat bij 37°C.
    OPMERKING: Het is mogelijk om de Petrischalen vanaf stap 2.2 tot 3 dagen te bewaren voor gebruik met microscopie.
  3. Ent een enkele kolonie in 5 ml LB bouillon aangevuld met de relevante antibiotica in een glazen buis.
  4. Kweek cellen bij 37 °C met een schudsnelheid van 250 tpm in de incubator gedurende 2 uur totdat de vloeistof troebel is.
  5. Bereid 1 ml verdunningsoplossing als volgt:
    892 μL minimale media (1x M9)
    8 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
    100 μL 2% Casamino zuren (0,2% [wt/vol])
    1 μL thiamine (B1)
    11 μL glucose (2 M)
    1 μL relevante antibiotica
    1. Mix en draai naar beneden.
  6. Verdun de celkweek (1:30) van stap 2.4 in een buis van 2 ml door 30 μL Escherichia coli-groei toe te voegen aan 1000 μL verdunningsoplossing (stap 2.5).
  7. Incubeer de buis gedurende 1 uur met schudden (250 tpm) bij 37 °C.
  8. Kweek 40 μL - 60 μL op M9 platen bereid in stap 1.10. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C.
    OPMERKING: De optische dichtheid (OD600nm)voor beplating moet ongeveer 0,1 zijn.
  9. Plaats tot drie glazen bodemplaten van 35 mm op de bank.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het glas van de plaat de juiste dikte heeft voor de gebruikte microscooplenzen.
  10. Bereid de kweek voor op zaaien op gelplaten, herhaal stap 2.3 tot 2.6 voor kolonies van plaat bereid bij stap 2.9 microscoopmetingen.
  11. Bereid de volgende oplossing voor om drie microscoopplaten te maken.
    1. Verwarm het waterbad voor op 60 °C.
    2. Meng 112,5 mg laagsmeltende agar en 40 mg agar met 8,92 ml minimale media (1x M9) en voeg 1 ml 2% casaminozuren (0,2% [vol/vol]) toe in een Erlenmeyerkolf van 25 ml.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de media op de binnenlippen van de kolf giet.
  12. Magnetron de oplossing in korte bursts van 2 tot 3 seconden. Herhaal dit totdat de oplossing duidelijk is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kookpunt niet bereikt.
  13. Plaats de Erlenmeyerkolf van 25 ml in een warmwaterbad (60 °C) om verder te mengen door diffusie en laat afkoelen op de bank totdat de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.

3. Bereiding van agarose pads

  1. Schone bank met 70% ethanol. Stretch tape op de schoongemaakte bank. Zorg ervoor dat de tape glad en waterpas staat.
  2. Bereid twee coverslips voor: een op de tape en een tweede in de buurt. Maak een deksel klaar.
  3. Haal de kolf (bereid bij stap 2.14) uit het waterbad, veeg de buitenkant van de kolf schoon en laat afkoelen tot de temperatuur daalt tot ongeveer 45-50 °C.
  4. Om de geloplossing te maken, mengt u snel alle oplossingen in de volgende volgorde:
    80 μL 50% glycerol (0,4% [vol/vol])
    1 ml 2% casaminozuren (0,2% [wt/vol])
    10 μL thiamine (B1)
    110 μL glucose (2 M)
    10 μL relevante antibiotica.
  5. Giet 1,5 ml van de gel op de afdeklip en bedek deze met het tweede stuk dat een "sandwich" maakt.
  6. Breng de Erlenmeyer terug naar het warmwaterbad. Bedek de sandwich met het deksel en stel de timer in op 20 minuten.
  7. Incubeer tegelijkertijd de buis vanaf stap 2.11 gedurende 1 uur bij 37 °C met schudden (250 tpm)
  8. Draai na 20 minuten de sandwich (stap 3.5) om, dek af en laat 1 uur rusten.
    OPMERKING: Laat de "sandwich" voor een beter resultaat rusten op 4 °C voor de duur van stap 3.8.
  9. Zaad Escherichia coli kweek vanaf stap 3.7 door het monster op de 35 mm schaal te pipetten.
    OPMERKING: 6 μL cellen als afzonderlijke kleine druppels pipetten geeft de beste resultaten.
  10. Laat de druppels minstens 15 minuten en maximaal 30 minuten drogen.
  11. Stel de gestolde gel van de sandwich vanaf stap 3.8 bloot door de deksels weg te schuiven.
  12. Snijd sandwich in kleine individuele pads met biopsie punch of tip.
  13. Leun het voorzichtig op het monster (stap 3.9). Laat het gerecht 20 minuten op de bank staan.

4. Voorbereiding van het monster voor microscopie beeldvorming

  1. Haal de kolf uit het waterbad vanaf stap 3.6. Veeg de buitenkant van de kolf schoon en laat afkoelen tot kamertemperatuur (25 °C).
    OPMERKING: Verwijder de kolf bij stap 4.1 ongeveer 3 minuten voordat de timer eindigt.
  2. Giet 3 ml van de gel constant in een cirkelvormige beweging naar de omtrek van de plaat. Laat een paar minuten stollen.
  3. Sluit platen af met tape en prik verschillende gaten met een naald van 25 G. Draai alle borden om te voorkomen dat er watercondensatie op de gel druipt.
  4. Incubeer alle gerechten gedurende 30 minuten op 4 °C om volledige stolling mogelijk te maken en tegelijkertijd cel mitose te voorkomen.
    OPMERKING: Laat monsters bij 4 °C voor opeenvolgende metingen, niet meer dan één dag.
  5. Start de microscoop volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Zoek de initiële scherpstelling met behulp van de laagste versterkingslens en schakel het automatische scherpstelsysteem (AFS) in.
  7. Gebruik indien nodig olie, verdrink de lens met olie en spreid deze voorzichtig uit door de plaat met een platformcontroller (niet handmatig) te verplaatsen en AFS kan weer worden ingeschakeld.
  8. Gebruik relatieve doorsnede in Z-richting, volgens de standaardsuggestie voor Z-stapdoorsneden.
    OPMERKING: We maakten elke 5 minuten heldere veldafbeeldingen en elke 20 minuten fluorescerende beelden. Soms moet de focus gedurende de eerste 30 minuten worden aangepast. Het voorverwarmen van de microscoop incubator box en olie, terwijl het koelen van het monster heeft de neiging om te helpen verminderen het aanvankelijke verlies van focus.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: Om microscopiegegevens te verwerken, hebben we een computergebaseerde software in MATLAB ontworpen. Deze software vergemakkelijkt de identificatie van celgrenzen van heldere veld tiff afbeeldingen en segmenten en sorteert cellen per gebied. De uitvoer van deze beeldanalyse kan worden gebruikt als een masker op fluorescerende tiff-afbeeldingen om celintensiteitsniveaus af te leiden en artefacten in het fluorescerende domein te annuleren, zoals celhalo vanwege de beperkingen van de microscoopresolutie. De ontwikkelde software is geïnspireerd op vergelijkbare werken7,25,26,27,28,29,30 en biedt een elegante oplossing op maat van het lab.

  1. Definieer eerst de volgende parameters in main_code.m.
    1. Definieer de map van de acquisitieafbeeldingen.
    2. Definieer de beeldtijdperiode - heldere veldkanaaltijd stap in minuten.
    3. Definieer de GFP-frequentie - snelheid van verwerving van GFP-afbeeldingen.
    4. Definieer de microscoopresolutie (d.w.z. hoeveel pixels gelijk is aan 1 μm).
    5. Definieer histogram bin range - cell area range.
      OPMERKING: Het proces van het classificeren van de gegevens op basis van het celgebied is vergelijkbaar met de principes van gating in flow cytometrie data-analyse. Poorten worden geplaatst rond populaties van cellen met gemeenschappelijke kenmerken, meestal naar voren verspreid en zij verspreid, om deze populaties van belang te isoleren en te kwantificeren. Microscopie maakt het mogelijk om verschillende celgroepen te gaten, te onderzoeken en te kwantificeren.
    6. Convolutie kernel definiëren (3,3) - deze parameter detecteert celgrenzen door globale drempelwaarden (count_cells.m).
      OPMERKING: Deze opstelling is alleen nodig bij het veranderen van het lab of de microscoop. Software vereist dat het ingangs heldere veldkanaal wordt gelabeld met index c1, fluorescentiekanaal gelabeld als c2.
  2. Voer main_code.muit , waarmee alle andere scripts automatisch worden uitgevoerd(count_cells.m cell_growth_rate.m).
    1. Programma segmenteert automatisch heldere veldafbeeldingen (zie aanvullende figuur 2-4).
    2. Combineer de segmentatieafbeelding met fluorescerende afbeelding (GFP) om het intensiteitsniveau per cel te extraheren.
    3. Bereken de grafiek van het aantal cellen op tijd en fit op basis van exponentiële groei.
    4. Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie (SOA) voor elk celgebiedsbereik.
    5. Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR) voor elk celgebiedsbereik.
    6. Plot en pas de verdeling van de hoeveelheid cellen op intensiteit.
    7. Bereken de variantiecoëfficiënt (CV) en vergelijk met flow analyzer data.
      OPMERKING: Software geeft als uitvoer de uiteindelijke segmentatieafbeeldingen voor het aanpassen van conv_kernel in een nieuwe map "yourfolder/Segmented". Software geeft als uitvoer de grafieken in een nieuwe map "yourfolder/Graphs.
  3. Gebruik compare_experiments.mom tussen experimenten te vergelijken.
    1. Definieer mappen voor de opgeslagen grafieken en het adres voor de map \CompareResult.
    2. Voer het bestand uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De software analyseert heldere velddomeinafbeeldingen die niet wit en zwart zijn. De Escherichia coli zal eruit zien als zwarte langwerpige vormen op een off-white achtergrond en dynamisch luminantiebereik moet een piek in het midden laten zien (Figuur 1). In fluorescerende beelden kunnen cellen een kleine halo hebben, maar individuele cellen met langwerpige vormen kunnen nog steeds worden opgelost. Een mitosegebeurtenis moet eerst na 30 minuten worden gedetecteerd. De focus van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk hebben we een protocol ontwikkeld dat computertracering van Escherichia coli levende cellen mogelijk maakt, na deling en fluorescerende niveaus over een periode van uren. Dit protocol stelt ons in staat om de stochastische dynamiek van genetische circuits in Escherichia coli te kwantificeren door het CV en SNR in realtime te meten. In dit protocol vergeleken we het stochastische gedrag van twee verschillende circuits zoals weergegeven in figuur 10. Het is aangetoond dat plas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Wij danken de heer Gil Gelbert (Faculteit Elektrotechniek, Technion) voor het assisteren bij de MATLAB code. We danken Dr. Ximing Li (Faculty of bio-medical Engineering, Technion) voor het helpen bewijzen van dit artikel. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Neubauer Family Foundation en het Israëlische ministerie van Wetenschap, subsidie 2027345.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35mm glass dishmattekP35G-0.170-14-Cdikte overeenkomstig met microscooplens.
Agarose Lonza5004LB-voorbereiding
AHL Sigma-AldrichK3007inducer
Bacto tryptone BD - Becton, Dickinson and Company 211705LB-voorbereiding
CarbInvitrogen10177-012antibioticum
CarbFormediumCAR0025antibioticum
Casamino aciden BD - Becton, Dickinson and Company 223050minimale media-oplossing
eclipse Tinikoninvers microscoop
GlucoseSigma-AldrichG5767minimale media-oplossing
GlyserolBio-Lab000712050100minimale media-substraat
Immersol 518Fzeiss4449600000000immersievloeistof
M9 zout oplossing Sigma-AldrichM6030minimale media-oplossing
NaClBio-Lab214010LB-voorbereiding
Noble agarSigma-AldrichA5431minimale media-substraat
parafilm tapeBemisPM-996aangeduid als tape in tekst
Seaplaque GTG AgaroseLonza50111minimale media-substraat
thaymine B1Sigma-AldrichT0376 minimale media-oplossing
Yeast ExtractBD - Becton, Dickinson and Company 212750LB-voorbereiding

Referenties

  1. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
  2. Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
  3. Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging. Biomedcentral Research Notes. , (2011).
  4. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. ChemPhysChem. , (2006).
  5. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).
  6. Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system. Nucleic Acids Research. , (2019).
  7. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nature Protocols. , (2012).
  8. Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. , (2002).
  10. Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. Synchronized DNA cycling across a bacterial population. Nature Genetics. , (2017).
  11. Arriaga, E. A. Determining biological noise via single cell analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).
  12. Nielsen, A. A. K., et al. Genetic circuit design automation. Science. , (2016).
  13. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  14. Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. Science. , (2005).
  15. Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. , (2014).
  16. Aoki, S. K., et al. A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation. Nature. , (2019).
  17. Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits. 4545, (2020).
  18. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  19. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  20. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades. Biophysical Journal. , (2002).
  21. Thattai, M., Van Oudenaarden, A. Intrinsic noise in gene regulatory networks. Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).
  22. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. , (2005).
  23. Van Der Ziel, A. Noise in Measurements. , Wiley & Sons Inc. (1976).
  24. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (1989).
  25. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. , (2006).
  26. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. , (2016).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. , (2016).
  28. Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology. , Wiley Online Library. (2016).
  29. Balomenos, A. D., et al. Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology. Biomedcentral System Biology. , (2017).
  30. Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data. PLoS One. , (2019).
  31. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. , (2006).
  32. Beal, J. Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).
  33. Marr, D., Hildreth, E. Theory of edge detection. Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).
  34. Otsu, N. Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).
  35. Soille, P. Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition. , (2000).
  36. Bradley, D., Roth, G. Adaptive Thresholding using the Integral Image. Journal of Graphics Tools. , (2007).
  37. Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. , (1994).
  38. Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).
  39. Millo, R., Phillips, R. What is the maturation time for fluorescent proteins. Cell Biology by Numbers. , (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Genetische schakelingenfluorescent reporterconfocale microscopiesignaal ruisverhoudingminimaal mediumkoloniescreeningagarosegel
Continue meting van biologische ruis in Escherichia Coli met behulp van time-lapse microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.