Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven

Summary

Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.

Abstract

Foerageer- en voedingsgedrag stelt dieren in staat om toegang te krijgen tot energiebronnen en voedingsstoffen die essentieel zijn voor hun ontwikkeling, gezondheid en fitheid. Het onderzoeken van de neuronale regulatie van dit gedrag is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan nutritionele homeostase. Het gebruik van genetisch trekbare diermodellen zoals wormen, vliegen en vissen vergemakkelijkt dit soort studies aanzienlijk. In het afgelopen decennium is de fruitvlieg Drosophila melanogaster gebruikt als een krachtig diermodel door neurobiologen die de neuronale controle van voedings- en foerageergedrag onderzoeken. Hoewel ongetwijfeld waardevol, onderzoeken de meeste studies volwassen vliegen. Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van het eenvoudigere larvale zenuwstelsel om neuronale substraten te onderzoeken die het voedingsgedrag controleren wanneer larven worden blootgesteld aan diëten die verschillen in hun eiwit- en koolhydraatgehalte. Onze methoden zijn gebaseerd op een kwantitatieve colorimetrische no-choice voedingstest, uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch activeringsscherm. Als uitlezing werd de hoeveelheid voedsel die door larven gedurende een interval van 1 uur werd gegeten, gebruikt bij blootstelling aan een van de drie diëten met een kleurstoflabel die verschillen in hun eiwit-koolhydratenverhoudingen (P:C). De werkzaamheid van dit protocol wordt aangetoond in de context van een neurogenetisch scherm in larvale Drosophila, door kandidaat-neuronale populaties te identificeren die de hoeveelheid voedsel reguleren die wordt gegeten in diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. We waren ook in staat om de geteste genotypen te classificeren en te groeperen in fenotypische klassen. Naast een korte bespreking van de momenteel beschikbare methoden in de literatuur, worden de voor- en nadelen van deze methoden besproken en worden ook enkele suggesties gedaan over hoe dit protocol kan worden aangepast aan andere specifieke experimenten.

Introduction

Alle dieren zijn afhankelijk van een uitgebalanceerd dieet om de nodige hoeveelheden voedingsstoffen te verkrijgen voor overleving, groei en voortplanting¹. De keuze van wat en hoeveel te eten wordt beïnvloed door een veelheid aan interactiefactoren die verband houden met de interne toestand van het dier, zoals het verzadigingsniveau en omgevingsomstandigheden, zoals voedselkwaliteit^2,3,4,5. Eiwitten en koolhydraten zijn twee belangrijke macronutriënten en de evenwichtige inname ervan is essentieel om de fysiologische processen van dieren te ondersteunen. Daarom is het begrip van de neurale mechanismen die het voedingsgedrag controleren en een evenwichtige inname van deze macronutriënten ondersteunen uiterst relevant. Dit komt omdat levensgeschiedeniskenmerken zoals levensduur, vruchtbaarheid en metabole gezondheid direct worden beïnvloed door de niveaus van eiwitinname^6,7,8,9,10.

Het gebruik van eenvoudigere meer tracteerbare organismen die evolutionair geconserveerde voedingsgewoonten vertonen bij complexe dieren, waaronder zoogdieren, is essentieel voor dit soort studies. Belangrijk is dat deze eenvoudigere diermodellen een goede gelegenheid bieden om complexe biologische vragen te ontleden in een dure, ethische en technisch effectievere context. In de afgelopen decennia is Drosophila, met zijn krachtige genetische toolkit, ingewikkeld en stereotiep gedrag en geconserveerde architectuur van perifere en nutriëntendetectiemechanismen met zoogdieren, een vruchtbaar model geweest voor gedragsneurobiologen¹¹. Uiteindelijk is de hoop dat door te begrijpen hoe voedselinname bij dit dier wordt gereguleerd, met een eenvoudiger zenuwstelsel, we dan kunnen beginnen met het ontwarren van neuronale storingen die ten grondslag liggen aan menselijke eetstoornissen.

De studie van neuronale substraten voor voedingsgedrag is sterk afhankelijk van het tegelijkertijd kunnen meten van de voedselinname van dieren terwijl ze hun neuronale activiteit manipuleren. Vanwege de minimale hoeveelheden voedsel die worden ingenomen, is het kwantificeren van de hoeveelheid voedsel die door vliegen wordt gegeten uiterst uitdagend en alle methoden die momenteel beschikbaar zijn, vertonen aanzienlijke beperkingen. De gouden standaard is dus het gebruik van een combinatie van complementaire methodologieën¹². Volwassen vliegen zijn historisch begunstigd als een genetisch en gedragsmodel. Niettemin bieden Drosophila-larven ook mogelijkheden om neuronale substraten te onderzoeken die coderen voor voedingsgedrag. Het larvale centrale zenuwstelsel (CZS), met ongeveer 12.000 neuronen, is aanzienlijk minder complex dan dat van de volwassene, die ongeveer 150.000 neuronen bevat. Deze lagere complexiteit is niet alleen numeriek, maar ook functioneel, omdat larvaal gedrag afhankelijk is van eenvoudigere locomotieffuncties en sensorische systemen. Ondanks de schijnbare eenvoud van hun zenuwstelsel vertonen larven nog steeds volledig voedingsgedrag, en sommige methoden om voedselinname in Drosophila-larven te kwantificeren zijn beschreven^5,13,14,15. Door te paren met manipulaties van neuronale activiteit, kunnen Drosophila-larven een zeer tracteerbaar model vormen voor het begrijpen van de neurale regulatie van voedselinname.

Hier is een gedetailleerd protocol beschikbaar om de voedselinname te kwantificeren bij larven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. De diëten, zogenaamde macronutriëntenbalanceringsdiëten, verschilden in de eiwit- en koolhydrateninhoud, met name met betrekking tot de eiwit-koolhydraatverhoudingen (P:C): 1:1 (eiwitrijk dieet), 1:4 (tussendieet) en 1:16 (eiwitarm dieet), zoals weergegeven in figuur 1A. Kortom, een kwantitatieve no-choice voedingstest werd vastgesteld met behulp van deze drie isocalorische sucrose-gist (SY) gebaseerde diëten geverfd met een blauwe voedselkleurstof. Omdat gistextract en sacharose werden gebruikt als eiwit- en koolhydraatbronnen en beide koolhydraten bevatten, werd variatie in de P:C-verhoudingen verkregen door de balans van deze twee componenten te veranderen, zoals eerder beschreven¹⁶ en zoals aangegeven in figuur 1B. Een schematisch overzicht van het protocol, met de belangrijkste experimentele stappen, is beschikbaar in figuur 2.

Dit protocol is opgesteld met als doel de rol van specifieke neuronale populaties te onderzoeken op de regulering van larvale voedingsniveaus in diëten met verschillende P:C-verhoudingen en in de context van een thermogenetisch neuronaal scherm. Een goed gekarakteriseerd neurogenetisch hulpmiddel werd gebruikt uit de Transient Receptor Potential (TRP) familie: Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), een temperatuur- en spanningsge gated cation kanaal, waardoor het afvuren van actiepotentiaal wanneer de omgevingstemperatuur boven 25 °C¹⁷stijgt. Om de dTRPA1 transgene uit te drukken, hebben we gebruik gemaakt van de Gal4-lijnen op basis van cis-regulerenderegio's uit het Drosophila-genoom, gevestigd in het Rubin-laboratorium, in het kader van het FlyLight-project op Janelia Research Campus^18,19.

Hoewel het protocol, hier beschreven, is vastgesteld in de context van een activeringsscherm, kan het door de experimenteerder gemakkelijk worden aangepast aan andere specifieke behoeften of interesses, namelijk om een onderdrukkingsscherm uit te voeren met behulp van de temperatuurgevoelige neuronale geluiddemper ShibireTS²⁰, in alternatief voor dTRPA1. Deze en andere aanpassingen worden besproken in de protocol- en discussiesecties.

Protocol

1. Bereiding van het sucrose-gist (SY) dieet

1. Weeg alle droge ingrediënten (agar, gist, sacharose) voor de macronutriëntenbalancering en L3-opfokdiëten. De hoeveelheden in gram voor elk van de ingrediënten die nodig zijn om 1 L voedsel te bereiden , zijn aangegeven in figuur 1B.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat er ongeveer 13 ml voedsel nodig is om een petrischaal van 60 mm te vullen.
2. Los alle ingrediënten op in steriel gedestilleerd water (gebruik ongeveer 50% van het totale volume water dat nodig is om het voedsel te bereiden) en roer het medium gedurende 5-10 minuten.
3. Autoclaaf gedurende 50 minuten.
4. Nadat u de mediums hebt laten afkoelen, voegt u nipagine- en propionzuuroplossingen toe aan de diëten, bij een eindconcentratie (v/v) van respectievelijk 3% en 0,3%. Voeg aan de macronutriëntenbalanceringsdiëten blauwe voedselkleurstof toe aan een eindconcentratie (v/v) van 1%. Voltooi de totale volumes met gedestilleerd water.
5. Giet de voedseldiëten zorgvuldig naar 60 mm Petri-gerechten, zodat de hoeveelheid gegoten voedsel ongeveer hetzelfde is in elk van de borden. Label de borden met de P:C-verhoudingen van de diëten.
   OPMERKING: Bereid de macronutriëntenbalanceringsdiëten voor op de dag van de voedingstest. Indien niet mogelijk, bewaar de bereide diëten bij 4 °C, in een verzegelde container, voor een maximale duur van 3 dagen. Langere opslagperioden maken het dieet te droog en hard en de larven kunnen zich niet in het medium graven.

2. Genetisch kruis van ouderlijke lijnen

OPMERKING: Gebruik het Gal4/UAS-systeem²¹ om de genetische kruisen in te stellen. In dit protocol, om neuronale functie in specifieke neuronale populaties te activeren, werden vrouwelijke maagden van de UAS dTRPA1 lijn¹⁷ gebruikt en gekruist naar mannen van de Janelia Gal4-lijnen (Figuur 2A). De gebruikte genetische controle was het nageslacht van een kruising tussen de dTRPA1-lijn en een "lege GAL4"-lijn, die Gal4 draagt in de vector die wordt gebruikt om de Rubin Gal4-collectie te genereren, maar zonder regelgevend fragment aanwezig (attP2)²². Om de neuronale onderdrukking te bevorderen, kan een UAS-lijn worden gebruikt die codeert voor ShibireTS^20, in plaats van dTRPA1.

1. Zet 60 mm embryo-verzamelkooien op met L3-opfokdieetplaten, aangevuld met wat actieve gistpasta.
2. Breng de volwassen UAS dTRPA1 vrouwelijke maagden en Janelia Gal4-mannetjes van 5-8 dagen over naar de embryo-verzamelkooien en laat de paring gedurende 24-48 uur plaatsvinden, bij 25 °C, met een luchtvochtigheid van 60% en een licht-donkere cyclus van 12:12 uur (figuur 2A). Gebruik voor 60 mm embryo-verzamelkooien ongeveer 100 maagdelijke vrouwtjes en 30 mannetjes per kruis.
3. Verwijder aan het einde van de paarperiode de L3-opfokdieetplaten die in de genetische kruisen worden gebruikt en gooi deze weg. Vervang ze door verse L3-opfokdieetplaten om de eier legt en larvale enscenering uit te voeren.

3. Bereiding van larven van derde instar (L3)

1. Breng de gepaarde volwassen vliegen over op verse L3-opfokdieetplaten en laat het leggen van eieren gedurende 3-4 uur plaatsvinden bij 25 °C (figuur 2B). Zorg ervoor dat alle borden zijn gelabeld met het genotype, P: C-verhouding van het dieet en de datum van het legen van het ei.
   OPMERKING: Om tijd te besparen, voert u het leggen van eieren rechtstreeks uit in het L3-opfokdieet, waardoor extra behandeling van de eieren wordt voorkomen. In het geval van kleinschalige genetische screenings kan optimalisatie van het leggen van eieren worden verkregen door gebruik te maken van appelsap agar platen.
2. Verwijder aan het einde van de legperiode de platen uit de kooien en bedek ze met plastic deksels. In het geval dat gistextract wordt gebruikt om de L3-opfokplaten aan te vullen, zorg er dan voor dat u alle resterende gist aan het einde van de eierlegging verwijdert. Dit is belangrijk om niet-uniforme voeding tijdens de larvale groei te voorkomen.
   OPMERKING: De gedekte volwassenen kunnen worden overgebracht naar verse L3-opfokdieetplaten, zodat er meer eier legt en meer experimentele larven kunnen worden verkregen. Opeenvolgende eierlegt kan gedurende één hele werkweek met dezelfde volwassenen worden uitgevoerd.
3. Schat het aantal eieren per plaat en houd de larvale dichtheid op maximaal 200 embryo's per plaat. Deze schatting kan worden gedaan door het aantal embryo's in een kwart van de plaat te tellen.
   OPMERKING: Een overvolle plaat vertraagt de ontwikkeling van larven en beïnvloedt het voedingsgedrag van larven.
4. Incubeer de L3-opfokplaten bij 18 °C (permissieve temperatuur), 60% vochtigheid en een licht-donkercyclus van 12:12 en laat de larven 9 dagen groeien (Figuur 2B).
5. Verzamel op de negende dag na het leggen van eieren (AEL) drie groepen van 10 L3 van elk van de genotypen (en voor de duplo's) die moeten worden getest. Verzamel bovendien groepen van 10 L3 voor de controle van "zero-dye food". Zorg ervoor dat de larvenverzameling wordt gedaan tijdens gelijkwaardige perioden van de dag die worden gebruikt om het ei te leggen (bijv. als het leggen van het ei plaatsvond tussen 10.00 en 14.00 uur, verzamel de larven gedurende dezelfde periode van 9 dagen AEL) en wordt zo voorzichtig mogelijk uitgevoerd met behulp van een tang #5 of een vedergewicht tang. Breng de larven direct over zoals aangegeven in de volgende stap (3.6).
   OPMERKING: De controledieren "zero-dye food" zijn larven die in de voedertest voedsel krijgen zonder blauwe kleurstof. Deze controle is noodzakelijk om de achtergrondabsorpance van de larvale extracten te verwijderen.
6. Breng de verzamelde experimentele larven over in plastic schaalgewicht boten met 1 ml water. Zorg ervoor dat L3 wordt verzameld en niet L2, door de aanwijzingen in figuur 3te volgen .
   OPMERKING: Het verzamelen van L3 naar plastic boten met water of 1x Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) is belangrijk om larven goed gehydrateerd te houden voor het begin van de voedertest. Dit is vooral belangrijk als meerdere experimentele L3-groepen van verschillende genotypen tegelijkertijd worden verzameld. Houd de inzamelingsvolgorde voor elke groep bij, zodat verschillen in de duur van voedseltekort voor elke groep worden geminimaliseerd. Het gebruik van plastic boten in deze stap vergemakkelijkt de optionele stap 4.3 omdat het larven in staat stelt om direct in het waterbad te drijven.

4. Thermogenetische activering en no-choice voedingstest

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de voedingstesten op ongeveer hetzelfde tijdstip van de dag uit te voeren om mogelijke variaties met betrekking tot de circadiaanse ritmes te minimaliseren. Voer ook altijd de controle-experimenten uit (het nageslacht van de "lege Gal4"-lijn die is overgestoken naar UAS dTRPA1 en de larven van "zero-dye food"), parallel aan de genotypen van belang.

1. Zet een incubator op tot 30 °C (niet-permissieve temperatuur) en houd een hoge luchtvochtigheid (ten minste 65%) om uitdroging van larven tijdens de test te voorkomen.
2. Voordat u met de voedertest begint, moet u de temperatuur van de testplaten gelijkmaken door ze gedurende 30 minuten op 30 °C te verwarmen.
3. (Optioneel) Hitteschok de experimentele larven gedurende 2 minuten in een waterbad van 37 ° C. Voer deze stap uit met de dieren in de plastic gewichtsboten die wat water bevatten.
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om de neuronale activering te intensiveren door het afvuren van de neuronen sinds het begin van de voedingstest te bevorderen.
4. Houd meerdere timers ingesteld op 1 uur. Het aantal te gebruiken timers hangt af van het aantal experimentele groepen dat wordt getest en van het vaardigheidsniveau van de experimenteerder bij het hanteren van larven.
   OPMERKING: Het gebruik van meerdere timers is van cruciaal belang om de duur van de test consistent te houden voor alle genotypen.
5. Giet het water voorzichtig af van de plastic boten en breng met behulp van een bevochtigde zachte borstel de L3-groepen voorzichtig over van de boten naar het midden van de testplaten. Plaats de deksels van de platen terug en start een timer voor elke plaat (of groep platen) om nauwkeurige 1-uurs voedingssessies te behouden.
6. Laat de larven zich gedurende 1 uur, bij 30 °C, in het donker voeden (figuur 2C).
   OPMERKING: De prestaties van de test in het donker zijn belangrijk om te controleren op verschillen in de visuele signalen tussen diëten, omdat de diëten in tonen zullen verschillen, ook al bevatten ze dezelfde kleurstofconcentratie.
7. Stop de voedingstest door de platen over te brengen naar een ijsbad. Druk het ijs zoveel mogelijk naar beneden om een stabiel oppervlak voor de platen te bieden.
   OPMERKING: Koude temperaturen bevorderen het einde van de voeding door het graaf- en graafgedrag te remmen. De meeste larven zullen na enkele minuten de voedselplaten aan de oppervlakte brengen, waardoor hun herstel in de volgende stappen wordt vergemakkelijkt.

5. Extractie van voedselkleurstoffen

1. Bereid 2 ml microtubes voor elke geteste groep van 10 L3, met ongeveer dezelfde hoeveelheden 0,5 mm glazen kralen (genoeg om het onderste gedeelte van de microbuis te vullen) en 300 μL ijskoude methanol. Houd de microtubes in de kou met behulp van een bankkoeler.
   LET OP: Methanol is licht ontvlambaar en giftig. Volg alle veiligheidsprocedures die worden aanbevolen voor het gebruik van dit reagens, inclusief het werken in een goed geventileerde ruimte en het dragen van nitrilhandschoenen.
   OPMERKING: Het gebruik van methanol is belangrijk om de larvale monsters te fixeren en melanisatiereacties in de nagelriem te voorkomen.
2. Met behulp van #5 of vedergewicht-tang, zorgvuldig herstellen van de groepen van 10 L3 van de voedertest platen en breng ze over naar de deksels van de assay platen met wat water. Spoel de larven af om voedselresten op hun lichaam te verwijderen terwijl ze voorzichtig met de larven omgaan om verwondingen te voorkomen. Houd het aantal teruggevonden larven per genotype per replica bij, zodat de gemiddelde hoeveelheid voedselinname per larve kan worden gekwantificeerd.
   OPMERKING: Gewonde larven moeten worden weggegooid omdat ze een gemelaniseerde cuticula hebben, die niet geschikt zijn voor colorimetrische kwantificering.
3. Breng de L3-groepen over naar de microbuisjes van 2 ml die in 5.1 zijn bereid.
4. Lyse de larvale weefsels om de voedselkleurstof uit de darmen te extraheren door middel van een mechanische lysismethode met behulp van een weefsellyzer en glasparels toegevoegd in stap 5.1. (als er geen tissue lyzer beschikbaar is, gebruik dan een homogeniserende stamper). Voer deze stap bij voorkeur uit bij 4 °C (figuur 2D).
   OPMERKING: De duur van deze stap is afhankelijk van de gebruikte apparatuur. Met behulp van een conventionele weefsellyser is 1 min extractie voldoende. In geval van tijdsvernauwing kan het protocol aan het einde van deze stap worden onderbroken en later worden voortgezet. Bewaar de monsters bij -20 °C.
5. Breng de extracten over om 1,5 ml microtubes schoon te maken, door de 2 ml microtubes direct om te keren naar de nieuwe 1,5 ml microtubes. Indien voorzichtig uitgevoerd, blijven de meeste glazen kralen aan de onderkant van de 2 ml microbuis.
6. Verwijder het celafval door de extracten bij een maximale snelheid van 10 minuten bij 4 °C te centrifugeren.
7. Verzamel de supernatanten om 1,5 ml microtubes schoon te maken. Als er nog celresten zichtbaar zijn in de supernatanten, herhaalt u stap 5.6 en 5.7.

6. Colorimetrische kwantificering van voedselconsumptie

1. Bereid standaardoplossingen voor, om een kalibratiecurve te genereren, door serieel 1:2 verdunningen uit te voeren in methanol van een beginnende blauwe kleurstofoplossing. Gebruik methanol alleen als blanco. De concentratie van de normen is afhankelijk van de voedselinname van de dieren.
   OPMERKING: In het geval van het hier gepresenteerde proefscherm werd een standaardcurve gebruikt die werd verkregen door de absorpties van 8 seriële verdunningen van een blauwkleurstofoplossing van 2 μL/ml in methanol te meten, aangezien de voor de larvale extracten verkregen kleurstofconcentraties varieerden van 0,02 tot 1,93 μL/ml. Verhoog of verlaag indien nodig de concentratie van deze oplossingen, afhankelijk van de kleurstofconcentratie van de experimentele monsters.
2. Breng 100 μL van de experimentele monsters (verkregen in stap 5.7), normen en blanco (stap 6.1) over naar de putten van een 96-put microplaat en meet de absorptie bij 600 nm, met behulp van een plaatlezer (figuur 2E). Om de achtergrondabsorpance te verwijderen, meet u de absorptie van extracten verkregen uit larven die worden gevoed met voedsel zonder blauwe kleurstof als een "nul" voor de larvale extracten ("zero-dye food control").
3. Genereer een standaardcurve en correleer de absorptiewaarden die zijn verkregen voor de monsters van elke experimentele larvale groep met de hoeveelheid voedselinname (volume in ml). Zoek de gemiddelde voedselconsumptie per larve door rekening te houden met het aantal larven dat voor elke groep is verzameld in stap 5.2

Results

Drosophila-larven reguleren hun eiwitinname ten koste van de inname van overtollige koolhydraten²³ (schematisch plot in figuur 2E). Eigenlijk is deze prioritering van eiwitinname waargenomen bij veel andere dieren en wordt het eiwit^24,25genoemd .

Gebruikmakend van deze robuuste voedingsgedragsrespons, werd een op gedrag gebaseerd scherm ontworpen om neuronale populaties te ...

Discussion

Met dit protocol zou men het vermogen van larven onder thermogenetische activering van specifieke neuronale populaties kunnen testen om de innameniveaus van eiwitten en koolhydraten, twee belangrijke macronutriënten, te reguleren wanneer ze worden blootgesteld aan diëten met verschillende P:C-samenstelling. Deze methode werd getest in de context van een larvale voorlopige screening met als doel neuronale populaties te identificeren die verband houden met de controle van voedselinname in verschillende diëten van verschill...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Oostenrijk	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, VS	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage voor 60 mm petrischalen	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Vliegvoer voor stocksonderhoud			1 L voer bevat: 10 g Agar, 100 g Gistextract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionzuur
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standaard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Serie 2, Model 230	Voor thermogenetisch voedingsexperiment (30?C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	Om larven te kweken (19?C)
Janelia lijnen	Janelia Research Campus		Gedetailleerde informatie in Tabel 2
Macronutriënt balancerende diëten			Samenstelling en voedingsinformatie in Figuur 1
Methanol	VWR	CAS-nummer: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoaat)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile handschoenen	VWR, VS
Gekoelde centrifuge	Eppendorf, Duitsland	5804 R / Serienummer: 5805CI364293
Rubin Gal4 lijnen	Janelia Research Campus		Stoks beschikbaar bij Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS lijn	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC nummer: 66600	Verstrekt door Carlos Ribeiro Groep
Zachte borstels			Voor het sorteren van verdoofd vruchtenmuggen
Spectrofotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscoop	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Reepingsdieet voor derde stadium larven (L3)			Samenstelling en voedingsinformatie in Figuur 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, VS	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS lijn	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC nummer: 26264	Drukt TrpA1 uit onder UAS controle; kan worden gebruikt om neuronen experimenteel bij 25?C te activeren
Waterbad	Sheldon Manufacturing Inc., VS	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Gistextract	Pró-vida, Portugal		51% Proteïne, 15% Koolhydraten