Dit protocol beschrijft methoden die worden gebruikt om de stemplooien van ratten voor te bereiden op histochemisch neuromusculair onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van de rattenzangplooi voor neuromusculaire analyses
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van deze tutorial is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat voor histochemische neuromusculaire studie te beschrijven. Dit protocol schetst procedures voor larynxdissectie van ratten, flash-bevriezing en cryosectie van de stemplooien. Deze studie beschrijft hoe cryosectie stemplooien in zowel longitudinale als cross-sectionele vlakken. Een nieuwigheid van dit protocol is de larynxtracking tijdens cryosectioning die zorgt voor een nauwkeurige identificatie van de intrinsieke larynxspieren en de kans op weefselverlies vermindert. Cijfers tonen de progressieve cryosectie in beide vlakken aan. Negenentwintig rattenhemi-larynges werden gecryopteerd en gevolgd vanaf het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van het eerste gedeelte dat de volledige stemplooi omvatte. De volledige stemplooi werd gevisualiseerd voor alle dieren in beide vlakken. Er was een grote variabiliteit in de afstand van het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van de volledige stemplooi in beide vlakken. Gewicht was niet gecorreleerd aan de diepte van larynxoriëntatiepunten, wat suggereert dat individuele variabiliteit en andere factoren die verband houden met weefselvoorbereiding verantwoordelijk kunnen zijn voor de hoge variabiliteit in het uiterlijk van oriëntatiepunten tijdens secties. Deze studie beschrijft een methodologie en presenteert morfologische gegevens voor het voorbereiden van de stemplooi van de rat voor histochemisch neuromusculair onderzoek. Vanwege de hoge individuele variabiliteit moeten larynxoriëntatoren tijdens cryosectie nauwlettend worden gevolgd om oversectioning van weefsel en weefselverlies te voorkomen. Het gebruik van een consistente methodologie, inclusief adequate weefselvoorbereiding en bewustzijn van oriëntatiepunten in het strottenhoofd van de rat, zal helpen bij consistente resultaten in alle onderzoeken en nieuwe onderzoekers helpen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de stemplooi van de rat als een model om larynx neuromusculaire mechanismen te onderzoeken.
Inleiding
Het strottenhoofd van de rat is een goed ingeburgerd model om structurele en functionele neuromusculaire larynxaanpassingen aan ontwikkeling, veroudering, ziekte en farmacologische agentia te onderzoeken1,2,3,4,5. Consistentie van histologische methoden is van cruciaal belang voor deze manier van werken, omdat er meerdere fijne kneepjes betrokken zijn bij spiervoorbereiding en -analyse, evenals uitdagingen in verband met larynxgrootte, vorm en topografie van de spieren ingekapseld in het larynxkarbeen1,6,7,8,9,10,11 . Vanwege de kleine omvang van de intrinsieke strottenhoofdspieren van de rat zijn systematische inbedding, bevriezing en cryosectie van cruciaal belang om consistente en nauwkeurige resultaten te bereiken. Bijvoorbeeld, bij het snijden van de stemplooi van de rat in het coronale vlak, bevinden de neuromusculaire juncties (NMJ's) van vier van de intrinsieke larynxspieren zich binnen minder dan 1,8 mm weefseldiepte11. Daarom is nauwkeurige monitoring van de anatomie van de larynxspier tijdens cryosectioning noodzakelijk om de sectie (s) van belang nauwkeurig te identificeren en oversectie van weefsel te voorkomen. Oversectie van de doelspier kan resulteren in een onnauwkeurige identificatie van het aantal en de topografie van NMJ's11 of kan resulteren in een algehele vermindering van de steekproefgrootte als de doelspier wordt weggegooid als gevolg van oriëntatierichtingsverwarring12. Aangezien nieuwe modellen voor de studie van larynxspieren en hun respectieve aanpassingen worden ontwikkeld, zijn standaard operationele procedures essentieel om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn in alle onderzoeken.
Het doel van dit artikel is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat te detailleren voor optimale longitudinale en cross-sectionele analyse. Gedetailleerde methoden die regelmatig in ons laboratorium worden gebruikt, worden beschreven om doelspieroriëntatoren tijdens cryosectie te identificeren. Hoewel vergelijkbare methoden in verschillende laboratoria worden gebruikt, wordt hier meer detail verstrekt dan in de literatuur om betrouwbare en nauwkeurige replicatie te garanderen wanneer deze door beginnende onderzoekers wordt geïmplementeerd. Het doel van deze tutorial is om een standaardmethodologie te bieden voor immunohistochemische (IHC) evaluatie van de stemplooi van de rat om de consistentie tussen laboratoria en onderzoeken te verbeteren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee van de New York University School of Medicine.
1. Ontleed het strottenhoofd van de rat
- Euthanaseer rat volgens het institutioneel goedgekeurde protocol. Scheer de ventrale nek van de onderkaak tot het schoorsteenvlies en veeg met alcohol om bontbesmetting in de weefselmonsters te voorkomen.
- Onder een ontleedbare scope met 10x vergroting wordt het hele strottenhoofd weggesneden door een middellijnhalsincisie met een scalpel te maken totdat de luchtpijp wordt blootgesteld.
- Scheid de ventrale extrinsieke larynxspieren aan de middellijn om het strottenhoofd bloot te leggen met behulp van een tang en een ontleedschaar of een scalpel.
- Snijd de luchtpijp caudaal naar de derde tracheale ring en maak een incisie rostral naar het tongbeen om het hele strottenhoofd te verwijderen met behulp van een ontleedschaar.
- Verwijder de extrinsieke larynxweefsels (slokdarm, schildklier en extrinsieke larynxspieren) uit het strottenhoofd met behulp van microdissectiehulpmiddelen (pincet, pinnen en microscisors) onder vergroting.
- Met microscissors, bisect het strottenhoofd dorsaal tussen de arytenoïden met behulp van de middellijn tussen de achterste cricoarytenoïde spieren als oriëntatiepunt. Pin laterale wanden van het strottenhoofd om de stemplooien bloot te leggen en vervolgens ventraal door de middellijn van het schildklierkraakbeen tussen de voorste commissure van de stemplooien met microscissors (figuur 1).
OPMERKING: Deze stap kan optioneel zijn; het kan worden overgeslagen om het strottenhoofd heel te houden. Bissectie van strottenhoofden maakt meerdere immunostainingtechnieken mogelijk door afzonderlijk de rechter- en linkerkant van hetzelfde strottenhoofd te gebruiken. - Spoel elk hemi-strottenhoofd in fosfaat gebufferde oplossing (PBS) gedurende ~ 10 s en droog voorzichtig met een taakwisser om de vorming van ijskristallen tijdens het invriezen te verminderen.
2. Fixeer en/of flash-freeze larynxweefsel
OPMERKING: Fixatie is mogelijk niet ideaal voor alle immunostainingprotocollen. Vaak worden larynxweefsels onmiddellijk na dissectie vers ingevroren. Sla stap 2.1 over om strottenhoofdweefsel te bevriezen zonder fixatie.
- Om hemi-larynges te fixeren, plaatst u weefsels in een centrifugebuis gevuld met 4% formaldehyde in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 70 tpm. Breng de tissues over in een schone centrifugebuis en spoel 3x gedurende 20 minuten in PBS. Breng vervolgens over in een schone centrifugebuis en dompel onder in een 20% sucrose / 5% glyceroloplossing (~ 18 uur of totdat het weefsel zinkt) bij 4 °C.
LET OP: Formaldehyde is gevaarlijk en moet worden gebruikt in een zuurkast samen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Plaats alle hemi-larynges in een uniforme positie in een cryo-mal gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding. Plaats voor een hemilarynx het weefsel met het mediale oppervlak van de stemplooi naar de onderkant van de cryomold en het longitudinale aspect van de stemplooi evenwijdig aan de onderrand van de cryomoldopening. Plaats voor hele strottenhoofden het weefsel met de achterste cricoarytenoïden naar de onderkant van de cryomold en het longitudinale aspect van de stemplooi evenwijdig aan de onderrand van de cryomoldopening.
OPMERKING: Consistente larynxoriëntatie binnen OCT-verbinding is van cruciaal belang voor cryosectie van de stemplooi van de rat. Zodra de hemilarynx is ingebed en bevroren, moet deze worden ontdooid om de oriëntatie te veranderen, waardoor het risico op weefselbeschadiging door meerdere dooi-vriescycli wordt geïntroduceerd. - Flash-freeze weefsels met isopentaan (2-methylbutaan) gekoeld in een stalen beker omgeven door vloeibare stikstof.
OPMERKING: Het isopentaan bereikt een optimale temperatuur voor weefselbevriezing wanneer witte neerslag zich begint te vormen aan de zijkanten en onderkant van het bekerglas13. Isopentane wordt gebruikt omdat het een hogere thermische geleidbaarheid heeft dan vloeibare stikstof, wat helpt scheuren van het weefselblok tijdens snel bevriezen te voorkomen. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van het invriezen van weefsel in OTC verwijzen wij u naar Kumar et al.13. - Wikkel elke vorm in voorgelabelde folie en plaats in een individuele diepvrieszak om uitdroging te voorkomen en bewaar onmiddellijk op droogijs totdat het wordt overgebracht voor opslag in een vriezer van -80 °C.
3. Cryosectie hemilarynx in dwarsdoorsnede
- Stel de kamertemperatuur in de cryostaat in op -20 °C, wat in het midden van het temperatuurbereik (15−25 °C) ligt dat door de handleiding van de fabrikant wordt aanbevolen voor spierweefselsectie.
- Stel de dikte van de cryostaatsectie in op 10 μm dikke secties.
OPMERKING: Voor spiervezeldoorsnedeanalyse zijn 10 μm dikke secties optimaal om volledige kleuring en robuuste beeldintensiteit van de gelabelde spiervezels voor vezeltyperingsanalyse mogelijk te maken14,15,16. Sommige protocollen kunnen een verschillende sectiedikte vereisen, afhankelijk van neuromusculaire doelen. - Breng weefsels over naar de cryostaatkamer, voeg een uniforme laag OCT-verbinding toe aan de cryostaatmonsterschijf (chuck) en plaats het ingebedde weefselblok bovenop de OCT-verbinding op de monsterschijf. Om doorsneden van de stemplooi te verkrijgen voor thyroarytenoïde (TA) spiervezelanalyse, bevestigt u het monster op de klauwplaat, zodat het ventrale schildklierkraakbeen naar het cryostaatblad en het arytenoïde kraakbeen naar de monsterschijf is gericht.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang op te merken dat deze oriëntatiepunten in dit stadium niet zichtbaar zijn, omdat de OCT-verbinding wit en ondoorzichtig wordt wanneer deze wordt bevroren. Dit gebrek aan zichtbaarheid is de reden waarom het van cruciaal belang is om de oriëntatie van de hemilarynx tijdens de flitsbevriezingsfase op te merken. - Trim OCT-verbinding door de kop van het monster met 100 μm te laten bewegen totdat het ventrale deel van het schildklierkraakbeen verschijnt.
- Trim en volg vervolgens 30 μm-secties vanaf het begin van het schildklierkraakbeen totdat de lamina propria, mediale TA-spieren en laterale TA-spier worden blootgesteld.
OPMERKING: Larynx oriëntatiepunten moeten worden gevolgd en genoteerd vanaf het begin van het schildklierkraakbeen om de 100 μm om ervoor te zorgen dat de hoek van de sectie niet schuin is. Figuur 2 toont de twee sets larynx oriëntatiepunten in het dwarsdoorsnedevlak bij 10x vergroting. - Zodra de doel TA-spier is bereikt, verzamelt u secties op positief geladen dia's bij 10 μm.
- Bewaar secties in PBS bij 4 °C om vocht vast te houden totdat ze klaar zijn om te worden gekleurd.
OPMERKING: Vast weefsel kan tot een week in PBS worden opgeslagen, afhankelijk van het IHC-doel, terwijl niet-gefixeerd weefsel onmiddellijk moet worden verwerkt.
4. Cryosectie hemilarynx in het langsvlak
- Terwijl de cryostaatkamer opnieuw is ingesteld op -20 °C, wijzigt u de sectiedikte in 30 μm.
OPMERKING: Voor NMJ-analyse kan een weefseldikte tussen 30−60 μm worden gebruikt om verschillende volledige NMJ's in de strottenhoofdspieren vast te leggen zonder fragmentatie van de zenuwterminal of motorische endplate11,12,17. - Om longitudinale stemplooisecties te verkrijgen voor NMJ-analyse van de TA-spier, bevestigt u de monsters op de klauwplaat zodat de epiglottis naar het cryostaatblad is gericht en het tracheale lumen naar beneden is gericht op de monsterschijf.
- Trim de OCT-verbinding door de kop van het monster met 100 μm te laten bewegen totdat het schildklierkraakbeen verschijnt.
- Trim- en tracksecties van 30 μm vanaf het begin van de schildklier tot de lamina propria en mediale en laterale delingen van de TA-spier worden blootgesteld.
OPMERKING: Vijf sets larynxoriëntatoren in het langsvlak worden aanbevolen om de progressie van de weefseldiepte naar de doel-TA-spier te volgen. Figuur 3 geeft de larynx oriëntatiepunten in het langsvlak weer bij 10x vergroting. - Zodra de ta-doelspier is bereikt, verzamelt u secties op positief geladen dia's bij 30 μm.
- Bewaar secties in PBS bij 4 °C om vocht vast te houden totdat ze klaar zijn om te worden gekleurd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De representatieve resultaten maakten deel uit van een lopend onderzoek naar de effecten van vocale oefening op het larynx neuromusculaire systeem. Negenentwintig mannelijke Fischer 344/bruine Noorse ratten (12 9 maanden oud, 17 24 maanden oud) werden gewogen en geëuthanaseerd met CO2-inhalatie gevolgd door een bilaterale thoracotomie.
De procedures volgden het geschetste protocol om NMJ's en vezelgrootte van de laterale en mediale TA-spieren te labelen. De afstand tussen larynxorië...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het voorbereiden van stemplooien van ratten voor neuromusculaire analyse kan verschillende uitdagingen met zich meebrengen. Niet alleen zijn larynxspieren klein en omgeven door kraakbeen, waardoor het moeilijk is om direct doelspier te extraheren, er werd ook een hoge variabiliteit gevonden tussen dieren in de diepte van larynxanatomische oriëntatiepunten. Voor spier het cross-section plane protocol, volledige stemplooisecties verschenen tussen 21−85 secties (10 μm per sectie) na het eerste verschijnen van het ventrale s...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) en K23DC014517 (Johnson, PI) van het National Institute on Deafness and other Communication Disorders van de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-Methylbutaan Gecertificeerd | Fisher Chemical | 35514 | |
| Aluminiumfolie | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo-tangs RVS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Cryostatmesjes | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Weggeefvormpjes 15mm x 15mm | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Weggeefonderleggers | Medline | 23-666-062 | |
| Dissectieset | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| IJsemmer | Bel-Art | 11999054 | |
| Vochtkamer voor immunokleuring | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| Naaldhouders | Assi | ASSI.B148 | |
| Niet-geweven sponzen, 4 lagen | Quick Medical | 9023 | |
| Orbitale shaker | Troemner | 02-217-987 | |
| Pap-pen | |||
| Paraformaldehyde, 16% w/v waterige oplossing, methanolvrij | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Premium Microcentrifugebuisjes | Fisherbrand | 5408129 | |
| Voorwerpendraagtassen | Fisherbrand | 19240093 | |
| Gemaakte roestvrijstalen maatbeker 32 oz/100 mL | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus Microscoopglaasjes | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Taakveger | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Timer | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas-patroonscharen | Assi | ASSI.SAS15RV | |
| OPMERKING: Voor alle benodigdheden zijn dit voorbeelden van apparatuur die kan worden aangeschaft. Het exacte model is niet noodzakelijk om onze methoden te voltooien. |
Referenties
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
