Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen

Samenvatting

Hier beschrijven we de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Onder een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum, deze plakken verbeelden evoluerende epileptische-achtige gebeurtenissen en kan worden beschouwd als een ex vivo model van epileptogenese. Dit systeem is een uitstekend hulpmiddel voor het monitoren van de dynamiek van spontane activiteit, evenals voor het beoordelen van de progressie van neuro-inflammatoire kenmerken gedurende de loop van epileptogenese.

Samenvatting

Organotypische plakculturen zijn veel gebruikt om hersenaandoeningen te modelleren en worden beschouwd als uitstekende platforms voor het evalueren van het neuroprotectieve en therapeutische potentieel van een medicijn. Organotypische plakjes worden bereid uit geëplanteerd weefsel en vertegenwoordigen een complexe meercellige ex vivo omgeving. Ze behouden de driedimensionale cytoarchitectuur en de lokale omgeving van hersencellen, behouden de neuronale connectiviteit en de neuron-glia wederkerige interactie. Hippocampale organotypische segmenten worden geschikt geacht om de basismechanismen van epileptogenese te verkennen, maar klinisch onderzoek en diermodellen van epilepsie hebben gesuggereerd dat de rhinale cortex, bestaande uit perirhinale en entorhinale cortices, een relevante rol speelt bij het genereren van aanvallen.

Hier beschrijven we de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Opnames van spontane activiteit uit het CA3-gebied onder perfusie met volledig groeimedium, bij fysiologische temperatuur en bij afwezigheid van farmacologische manipulaties, toonden aan dat deze segmenten evoluerende epileptische gebeurtenissen in de loop van de tijd in de cultuur weergeven. Verhoogde celdood, door propidium jodide opnametest, en gliose, beoordeeld met fluorescentie-gekoppelde immunohistochrie, werd ook waargenomen. De gepresenteerde experimentele benadering benadrukt de waarde van rhinale cortex-hippocampus organotypische segmentculturen als een platform om de dynamiek en progressie van epileptogenese te bestuderen en potentiële therapeutische doelen voor deze hersenpathologie te screenen.

Inleiding

Epilepsie, een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen wereldwijd, wordt gekenmerkt door het periodieke en onvoorspelbare optreden van gesynchroniseerde en overmatige neuronale activiteit in de hersenen. Ondanks de verschillende beschikbare anti-epileptica (AED's) is een derde van de patiënten met epilepsie refractair voor therapie¹ en blijven ze aanvallen en cognitieve achteruitgang ervaren. Bovendien belemmeren beschikbare AED's de cognitie vanwege hun relatief gealgemeiseerde acties op neuronale activiteit. Epileptogenese is moeilijk te bestuderen bij mensen, vanwege de meervoudige en heterogene epileptogene verwondingen, lange latente perioden die maanden tot decennia duren en de misleidende effecten van anticonvulsieve behandeling na de eerste spontane aanval.

De identificatie van potentiële therapeutische middelen voor de behandeling van epilepsie is mogelijk geworden als gevolg van diermodellen van epilepsie: 1) genetische modellen, die genetisch gepredisponeerde dieren gebruiken waarbij aanvallen spontaan of als reactie op een zintuiglijke stimulus optreden; 2) modellen van elektrische stimulatie-geïnduceerde aanvallen; en 3) farmacologische modellen van aanvalsinductie die pilocarpine (een muscarinische receptoragonist), kainate (een kainatereceptoragonist) of 4-aminopyridine (een kaliumkanaalblokker) gebruiken, onder anderen. Deze modellen waren cruciaal in het begrip van de gedragsveranderingen, evenals moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan epilepsie, en ze hebben geleid tot de ontdekking van veel AED's².

Ex vivo preparaten zijn ook een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te verkennen die ten grondslag liggen aan epileptogenese en ictogenese. Acute hippocampale plakjes, die elektrofysiologische studies van levende cellen over een periode van 6-12 uur mogelijk maken, en organotypische hippocampale plakjes die gedurende een periode van dagen of weken in een incubator kunnen worden bewaard, zijn uitgebreid gebruikt in studies naar epileptiforme activiteit³.

Organotypische hersenschijfjes worden bereid uit geëplanteerd weefsel en vertegenwoordigen een fysiologisch driedimensionaal model van de hersenen. Deze segmenten behouden de cytoarchitectuur van de regio van belang en omvatten alle hersencellen en hun intercellulaire communicatie⁴.  De meest gebruikte regio voor langdurige organotypische culturen is de hippocampus, omdat deze regio wordt beïnvloed door neuronaal verlies in meerdere neurodegeneratieve aandoeningen. Ze zijn veel gebruikt om hersenaandoeningen te modelleren en worden beschouwd als uitstekende hulpmiddelen voor het beoordelen van het neuroprotectieve en therapeutische potentieel van een medicijn^5,6. Modellen van epileptogenese, beroerte en Aβ-geïnduceerde toxiciteit werden beschreven in hippocampale organotypische segmenten^7,8,9,10. De ziekte van Parkinson werd onderzocht in ventrale mesencephalon en striatum, evenals cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypische plakjes¹¹. Organotypische cerebellaire plakculturen bootsen vele aspecten van axon myelinatie en cerebellaire functies na en zijn een wijdverbreid model voor het onderzoeken van nieuwe therapeutische strategieën bij multiple sclerose¹².

Klinisch onderzoek en diermodellen van epilepsie hebben echter gesuggereerd dat de rhinale cortex, samengesteld door perirhinale en entorhinale cortices, een rol speelt bij het epileptische generatie¹³. Zo werd een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes vastgesteld¹⁴. Onder een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum, rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes tonen evoluerende epileptische-achtige gebeurtenissen, in tegenstelling tot analoge plakjes altijd bewaard in een serum-bevattend medium.

Bij epilepsie, zoals bij veel acute en chronische ziekten van het centrale zenuwstelsel, slaagt de neurocentrische visie er niet in om de mechanismen die ten grondslag liggen aan het begin en de progressie van de ziekte te verduidelijken. Klinisch en experimenteel bewijs wijst op hersenontsteking, waarbij microglia en astrocyten een relevante rol spelen, als een van de belangrijkste spelers die bijdragen aan het epileptische proces. Farmacologische experimenten in diermodellen van epilepsie suggereren dat antiepileptogene effecten kunnen worden bereikt door zich te richten op pro-inflammatoire trajecten, en tegenwoordig wordt neuro-inflammatie beschouwd als een nieuwe optie voor de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor epilepsie¹⁵.

Hier beschrijven we grondig de voorbereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen, evenals de details voor het registreren van spontane epileptiforme activiteit van hen. We benadrukken dat dit systeem verschillende neuro-inflammatoire aspecten van epilepsie nabootst, waardoor het geschikt is om de rol van gliacellen en neuro-inflammatie in deze pathologie te onderzoeken. Bovendien is het een eenvoudig te gebruiken platform voor de screening van mogelijke therapeutische benaderingen voor epilepsie.

Protocol

De Portugese wetgeving en richtsnoeren van de Europese Unie (2010/63/EU) werden nageleefd in alle procedures met betrekking tot de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden. Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Instellingsorgaan voor dierenwelzijn (ORBEA-iMM) van de iMM en de nationale bevoegde autoriteit (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).

1. Bereiding van rhinale cortex-hippocampus plakjes

OPMERKING: De bereiding van rhinale cortex-hippocampus plakjes maakt gebruik van P6-7 Sprague-Dawley ratten.

1. Cultuuropstelling en medium voorbereiding
   1. Bereid op de dag voor de cultuur de vereiste media voor en plaats ze op 4 °C.
   2. Bereid dissectiemedium: 25 mM glucose in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS).
   3. Bereid kweekmedium voor: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Paardenserum (HS), 25 mM glucose, 30 μg/ml Gentamycine.
   4. Bereid onderhoudsmedium voor: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamine, 30 μg/ml Gentamycine, HS (15%, 10%, 5% en 0%).
2. Het oogsten van hersenen
   1. Voeg vlak voor het begin van de cultuur 1,1 ml cultuurmedium toe aan elke put van de 6-putplaat met een P1000-pipet en plaats deze op 37 °C.
   2. Plaats alle apparatuur (dissectiemicroscoop, weefselhelikopter, ontleedlamp, ontledingsgereedschap, elektroden, platen, inzetstukken en filterpapier) in de biologische veiligheidskast en steriliseer gedurende 15 minuten onder UV-licht.
   3. Pas de dikte van de plak aan op 350 μm.
   4. Haal de GBSS uit de koelkast. Voeg 5 ml GBSS toe aan zes petrischalen. Per dier zijn zes Petrischalen nodig.
   5. Euthanaseer de ratten pup. Voer onthoofding uit met behulp van een scherpe schaar aan de basis van de hersenstam van het dier.
   6. Was de dierenkop drie keer in koude GBSS en neem deze mee in de veiligheidskast.
3. Weefselisolatie en bereiding van plakjes
   1. Steek de scherpe tang stevig in de oogkassen om het hoofd vast te houden.
   2. Knip met een dunne schaar de huid/hoofdhuid langs de middellijn vanaf de wervels naar de frontale kwabben en leg deze opzij.
   3. Snijd op dezelfde manier de schedel en langs de cerebrale transversale spleet (ruimte tussen hersenen en cerebellum). Met gebogen lange tang, verplaats het uit elkaar.
   4. Gooi de olfactorische bollen weg met een spatel. Verwijder de hersenen van het hoofd en plaats het in ijskoude GBSS met het dorsale oppervlak naar boven (Figuur 1A).
   5. Steek de fijne tang in het cerebellum en ga langs de middellijn met de spatel die elke hemisfeer heel voorzichtig opent (Figuur 1B).
   6. Verwijder met korte curve forceps voorzichtig het overtollige weefsel dat de hippocampi bedekt, zonder de hippocampale structuur aan te raken. Snijd vervolgens met een spatel onder elke hippocampus (figuur 1C).
   7. Pak een hemisfeer en plaats deze, met hippocampus naar boven, op een filterpapier. Herhaal de procedure met de andere hemisfeer en plaats deze parallel aan de eerste, in het filterpapier. Leg het filterpapier op de weefselhelikopter, met de hemisferen loodrecht op het mes, en snijd de hemisferen in plakjes van 350 μm (figuur 1D).
   8. Doe het gesneden weefsel in een petrischaaltje met koude GBSS (figuur 1E).
   9. Scheid de plakjes voorzichtig met behulp van de elektroden met ronde punt (Afbeelding 1F). Bewaar alleen de plakjes met een structureel intacte rhinale cortex en hippocampus. DG- en CA-gebieden moeten perfect worden gedefinieerd, evenals de entorhinale en perirhinale cortex (figuur 1G).
   10. Plaats elk plakje op het inzetstuk (afbeelding 1H-I), met een spatel en een ronde tipelektrode. Verwijder het overtollige dissectiemedium rond elk segment met een P20-pipet (figuur 1J). Vier rhinale cortex-hippocampus plakjes kunnen worden gekweekt in een enkele insert (Figuur 1K).
4. Cultuuronderhoud
   1. Verander het medium om de andere dag.
   2. Warm het medium op bij 37 °C.
   3. Haal de platen uit de couveuse. Pak elk inzetstuk op door de plastic rand met een tang vast te houden (figuur 1L).
   4. Gebruik een vrije hand om het medium uit de put te aspireren. Plaats het inzetstuk terug in de put en voeg 1 ml, met een P1000 pipet, van vers opgewarmd medium toe (Afbeelding 1M). Herhaal dit voor alle wisselplaten. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het membraan en het medium zitten.

OPMERKING: Epileptische plakjes ondergaan een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum in het medium. Vanaf 9 Days In Vitro (DIV) worden slices onderhouden in NBA zonder HS¹⁴.

Figuur 1: Gedetailleerde procedure voor de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. (A) Verwijder de hersenen van het hoofd en plaats het in ijskoude GBSS met het dorsale oppervlak naar boven. (B) Steek de tang in het cerebellum. Open de hersenen door de middellijn en verwijder het overtollige weefsel over de hippocampus. (C) Met een spatel onder de hippocampus gesneden, zoals aangegeven door de pijlen. (D) Plaats beide hippocampi naar boven en evenwijdig aan elkaar op het filterpapier en snijd 350 plakjes van μm op de tissue chopper. (E) Plaats de gesneden hippocampus in ijskoude GBSS. (F) Scheid de plakjes met behulp van ronde glaselektroden. (G) Kies alleen de plakjes die een intacte rhinale cortex en hippocampus weergeven. (H, I) Duw met behulp van een ronde glazen elektrode elk plakje naar de spatel en plaats het op het inzetstuk. (J) Verwijder de GBSS rondom het segment. (K) Plaats vier plakjes per inzetstuk. (L) Om het medium te vervangen, tilt u het inzetstuk op en aspireert u het medium met een glazen pipet. (M) Voeg een vers medium toe door de pipet tussen het inzetstuk en de wanden van de 6-wells plaat te plaatsen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de plakjes zitten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Elektrofysiologische opnames

OPMERKING: Elektrofysiologische opnames werden uitgevoerd in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes op 7, 14 en 21 DIV in een interface-achtige kamer. Opnames werden verkregen met een versterker, gedigitaliseerd en geanalyseerd met software. Alle opnamen werden band-pass gefilterd (achtpolig Bessel-filter bij 60 Hz en Gaussiaans filter bij 600 Hz).

1. Voorbereiding van de installatie
   1. Bereid 50 ml NBA-medium voor met 1 ml B27 en 250 μL L-Glutamine. Opwarmen bij 37 °C.
   2. Stel de elektrofysiologie-instelling in een nauw circuit in. Controleer of het debiet 2 ml/min is.
   3. Open de carbox (5% CO₂/95% O₂₎klep en controleer het waterniveau in het systeem.
   4. Plaats het filterpapier in de interface-opnamekamer om overtollig medium af te tappen en het lensreinigingspapier onder het frame om medium naar het segment te leveren.
   5. Schakel de temperatuurregelaar, de versterkers en de micromanipulator in.
   6. Laat de temperatuur in de interfacekamer stabiliseren bij 37 °C voordat u de opnames start.
   7. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH₂PO_4,25 mM NaHCO_3,10 mM glucose, 2 mM CaCl_2,1 mM MgSO₄ met pH 7,4) en gebruik het om de glaselektrode met een spuit te vullen. Plaats het in de ontvangende elektrode.
2. Opnames van spontane activiteit
   1. Zodra de temperatuur stabiel is, verwijdert u de plaat uit de incubator en snijdt u een plak uit het inzetstuk met een zeer scherp mes. Plaats het in een plaat van 60 mm met een druppel medium. Breng het naar de interface opnamekamer.
   2. Plaats het plakje in de interfacekamer met de hippocampus rechtsonder. Plaats de ontvangende elektrode in de CA3-piramidevormige cellaag.
   3. Ga verder met het continue acquisitieprotocol en noteer gedurende 30 minuten.

3. PI-opnametest

OPMERKING: Celdood werd beoordeeld door de cellulaire opname van de fluorescerende kleurstof propidiumjodide (PI) te controleren. PI is een polaire verbinding, die cellen met beschadigde celmembranen binnendringt en interageert met DNA dat rode fluorescentie uitzendt (absorptie 493 nm, emissie 630 nm). Omdat PI niet permeant is voor levende cellen, wordt het gebruikt om dode cellen in een populatie te detecteren.

1. PI incubatie
   1. Bereid in kweekmedium een verse 1:10 verdunning van PI-bouillon.
   2. Verwijder voor pi-opnametest de plaat uit de incubator en til de inzet voorzichtig op. Voeg 13 μL PI toe aan het medium, met een P20 pipet, met een eindconcentratie van 2 μM.  Roer de plaat langzaam voordat u de inzet weer op zijn plaats zet. Zorg ervoor dat er geen bubbels onder de plakjes zitten.
   3. Doe de plakjes 2 uur terug in de incubator van 37 °C.
   4. Ga verder met het immunohistochchemieprotocol, zoals beschreven in de volgende sectie. Bedek de platen met aluminium, omdat PI lichtgevoelig is.

4. Immunohistochie

OPMERKING: In de immunohistochie werden een neuronspecifiek antilichaam, evenals antilichamen die rust- en reactieve fenotypen van microglia en astrocyten kunnen discrimineren, gebruikt om de uitbreiding van neuronale dood en gliose in rhinale cortex-hippocampus epileptische organotypische plakjes te evalueren.

1. Weefselfixatie
   1. Haal de plaat uit de incubator en aspireer het medium. Bevestig de plakjes met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur bij RT, door 1 ml PFA onder en boven de plakjes toe te voegen, met een P1000 pipet.
   2. Verwijder de PFA en voeg 1 ml PBS toe. Voeg ook PBS toe onder en boven de segmenten.
   3. Bewaar de plakjes op 4 °C, in PBS, tot verder gebruik. Plaats altijd parafilm rond de platen om uitdroging te voorkomen.
2. Immunostaining stappen
   1. Was tweemaal, telkens 10 min, met 1 ml PBS.
   2. Bereid permeabilisatie/blokkeeroplossing voor met 1% Triton-X100, 10% HS en 10% BSA in PBS. Bereid 5% BSA-oplossing voor.
   3. Teken twee rechthoeken met de hydrofobe pen (Figuur 2A). Snijd de plakjes uit de wisselplaat (afbeelding 2B) met een zeer scherp mes. Leg twee plakjes per dia (figuur 2C) en voeg 140 μL permeabilisatie/blokkeeroplossing toe aan de bovenkant van elk segment, met behulp van een P200 pipet. Incubeer gedurende 3 uur bij RT.
   4. Verdun de primaire antilichamen tegen de werkverdunning in 5% BSA in PBS. Incubeer 's nachts met de primaire antilichamen bij 4 °C.
   5. Incubeer met de secundaire antilichamen gedurende 4 uur bij RT. Bescherm vanaf deze stap de plaat tegen licht, omdat er met fluoroforen wordt gewerkt.
   6. Leg een druppel Van Hoechst van 50 μL op de bovenkant van elke plak en incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
   7. Wassen tussen incubaties. Was altijd drie keer, telkens 10 minuten, met PBS-T.
   8. Verwijder Hoechst en was zoals aanbevolen.
   9. Voeg 50 μL montagemedium toe aan de bovenkant van elk plakje. Dek af met een glazen hoeslip en omring met nagellak (Afbeelding 2D).
   10. Laat het 24 uur drogen bij RT.
   11. Visualiseer de immunostaining onder een confocale microscoop. Bewaar de bevlekte plakjes op -20 °C.

Figuur 2: Specifieke procedure voor de immunohistochistry assay. (A) Teken met de hydrofobe pen twee vierkanten in de glijbaan. (B) Snijd het stuk inzetstuk dat het segment bevat. (C) Plaats elk plakje in de vierkanten getekend met de hydrofobe pen en start de permeabilisatie/blokkeerstap. (D) Na het afsluiten van het protocol, eindig door de plakjes in montagemedium te monteren, af te dekken met een glazen afdeklip en deze te omringen met nagellak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Resultaten

Op basis van eerdere beschrijvingen van epileptische signaalanalyse in organotypische hippocampale segmenten, worden interictale epileptiforme ontladingen hier gedefinieerd als paroxysmale ontladingen die duidelijk worden onderscheiden van achtergrondactiviteit, met een abrupte verandering in polariteit en optredend bij lage frequentie (<2 Hz). Paroxysmale afscheidingen die meer dan 10 s duren en bij een hogere frequentie (≥2 Hz) optreden, worden gekenmerkt als ictale epileptiforme activiteit. Als een ictal-gebeurtenis plaatsvindt binnen 10 s na de vorige, worden deze twee gebeurtenissen beschouwd als slechts één ictal-gebeurtenis.

Rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes bij 7 DIV (Figuur 3A) verbeelden gemengde interictale en ictal-achtige activiteit. Bij 14 DIV (figuur 3B) wordt spontane activiteit gekenmerkt door ictal discharges, die evolueren naar een overweldigende ictal activiteit bij 21 DIV, met ictal events die >1 min duren (Figuur 3C).

Figuur 3: Spontane epileptiforme activiteit van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Representatieve electrografische inbeslagname-achtige gebeurtenissen, geregistreerd vanuit CA3-gebied in een interface-achtige kamer, na (A) 7 DIV, (B) 14 DIV en (C) 21 DIV. Inbeslagnemingsgegevens worden weergegeven in lagere sporen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

PI-opnametest gevolgd door immunohistochie tegen de neuronale marker NeuN gericht op het identificeren van neuronale dood. PI-opname door korrelige en piramidale neuronen werd waargenomen in 7 DIV-segmenten (pijlen in figuur 4A),maar het aantal PI⁺ neuronen nam toe bij 14 DIV (pijlen in figuur 4B),wat een verhoogde neuronale dood met epileptogeneseprogressie bevestigt.

Figuur 4: Representatieve afbeeldingen van NeuN en PI bevlekte rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Beelden van NeuN bevlekte volwassen neuronen en PI-positieve cellen werden verkregen op (A) 7 DIV en (B) 14 DIV, op een confocale lasermicroscoop met een 20x objectief. Er worden vergrote afbeeldingen van de onderbroken gebieden weergegeven. Pijlen wijzen naar doodsneuronen (in oranje). Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Een dubbele kleuring van Iba1, samen met CD68, werd gebruikt om microglia fenotype te evalueren. Iba1 is een microglia/macrofagen marker, terwijl CD68 een lysosomaal eiwit is uitgedrukt in hoge niveaus door reactieve microglia en in lage niveaus door het rusten van microglia. Bij 7 DIV-segmenten zijn geramde microglia met een lage CD68-expressie (pijlen in figuur 5A)overvloediger dan Iba1⁺/CD68⁺ reactieve microglia (pijlpunten in figuur 5A),terwijl bij 14 DIV in alle gebieden van de hippocampus Iba1⁺/CD68⁺ bossige/amoebe M1 microglia (pijlpunten in figuur 5B) microglia met een lage CD68-expressie overschrijden . Bij 14 DIV kunnen enkele Iba1⁺/CD68⁺ cellen met een hypervertakkingsverschijnsel worden vastgesteld (open pijlpunten in figuur 5B),wat zou kunnen wijzen op het optreden van het M2-ontstekingsremmende fenotype van microglia. Deze kwestie moet echter verder worden bestudeerd.

Recente studies toonden aan dat verschillende initiërende CZS-verwondingen ten minste twee soorten reactieve astrocyten kunnen oproepen, A1 en A2, waarbij A1-astrocyten neurotoxisch^{zijn 16}. A1 subtype van astrocyten wordt gekenmerkt door een verhoogde expressie van Complement C3^16,17,18. Complement C3, dat een centrale rol speelt bij de activering van het complementsysteem, genereert C3b, dat verder wordt gedegradeerd tot iC3b, C3dg en C3d¹⁹. Zo werd een dubbele kleuring van GFAP en C3d gebruikt om astrogliose te beoordelen. Bij 7 DIV is de expressie van C3d nauwelijks detecteerbaar (figuur 6A), terwijl in 14 DIV-segmenten hypertrofische GFAP⁺/C3d⁺ astrocyten kunnen worden waargenomen (pijlpunten in figuur 6B), wat wijst op een progressieve activering van A1-astrocyten.

De resultaten tonen een progressieve activering van microglia en astrocyten in de loop van epileptogenese aan, waarbij de beschreven voorvallen bij patiënten met epilepsie en in diermodellen van deze pathologie worden nagebootst.

Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van Iba1 en CD68 bevlekte rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. Afbeeldingen van Iba1 en CD68 gebeitst microglia, en Hoechst bevlekte kernen, werden verworven op (A) 7 DIV en (B) 14 DIV, op een confocale lasermicroscoop met een 20x objectief. Er worden vergrote afbeeldingen van de onderbroken gebieden weergegeven. Pijlen wijzen naar Iba1⁺/CD68^- rustende microglia, pijlpunten geven Iba1⁺/CD68⁺ bossige /amoebe microglia aan en open pijlpunten onthullen Iba1⁺/CD68⁺ hyper-ramified microglia. Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: Representatieve afbeeldingen van GFAP en C3d bevlekte rhinale cortex-hippocampus organotypic slices. Afbeeldingen van GFAP en C3d gebeitst astrocyten, en Hoechst bevlekte kernen, werden verworven op (A) 7 DIV en (B) 14 DIV, op een confocale lasermicroscoop met een 20x objectief. Er worden vergrote afbeeldingen van de onderbroken gebieden weergegeven. Pijlpunten wijzen naar GFAP⁺/C3d⁺ reactieve A1 astrocyten (in geel). Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Diermodellen van epilepsie zijn cruciaal geweest voor de ontdekking van veel AED's, maar ze vereisen veel dieren en de meeste zijn tijdrovend vanwege de latente periode voor het begin van de aanval. De laag-magnesium inductie van epileptiforme activiteit in hippocampale acute plakken is ook grondig herzien in de literatuur³, maar acute segmenten hebben een levensvatbaarheid van 6-12 uur waardoor het onmogelijk is om veranderingen op lange termijn te beoordelen. Organotypische plakjes kunnen van dagen tot weken in cultuur worden bewaard, waardoor de korte levensvatbaarheidstijd van acute plakjes kan worden overwonnen, en modellen van epileptogenese in organotypische hippocampale plakjes zijn voorgesteld^3,7,8.

Hier beschrijven we de bereiding van organotypische plakjes, bestaande uit de rhinale cortex en de hippocampus. Deze plakjes duren 15-20 minuten om per dier te bereiden, beginnend bij het offeren van dieren tot het plaatsen van plakjes op de inzetstukken, en 6-8 plakjes per halfrond kunnen worden verkregen. Extra voorzichtig moet worden genomen bij het openen van de hemisfeer om de hippocampus bloot te leggen en bij het verwijderen van het weefsel van het filterpapier na het snijden. Overtollig weefsel boven de hippocampus kan ook de integriteit van de plak tijdens het snijden in gevaar brengen.

Rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes tonen een evoluerende epileptische activiteit die lijkt op in vivo epilepsie. Na een week in cultuur verbeelden de meeste segmenten gemengde interictale en ictal-achtige activiteit, die doorgroeit naar uitsluitend ictal-achtige gebeurtenissen met tijd in cultuur. Tot nu toe hebben we weinig interictale afscheidingen geregistreerd in plakjes met 2-3 weken. In dit systeem lijkt epileptische activiteit zich sneller te ontwikkelen dan in organotypische hippocampale plakjes. Dit kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van de rhinale cortex, die het grootste deel van de functionele input voor de hippocampus behoudt. Om dit probleem volledig aan te pakken, wordt momenteel een volledige karakterisering uitgevoerd van de epileptische signalen die door deze segmenten in de loop van de tijd in cultuur worden weergegeven, zoals het aantal en de duur van ictale gebeurtenissen, samen met hun amplitude en frequentie.

Dit systeem kan meer dan drie weken in cultuur worden gehouden en bootst veel moleculaire correlaten van epilepsie na, zoals neuronale dood, activering van microglia en astrocyten en verhoogde productie van pro-inflammatoire cytokinen¹⁴, waardoor een langdurige karakterisering van deze aspecten mogelijk is. Het vertegenwoordigt ook een eenvoudig te gebruiken screeningplatform, waar farmacologische interventies gericht op specifieke cellulaire trajecten kunnen worden geïmplementeerd en potentiële therapeutische doelen kunnen worden getest. Ongetwijfeld kan het hierin gepresenteerde systeem helpen om de mechanismen van epileptogenese verder te verlichten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom	Corning	430829
70% Ethanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 900A
Amplifier	Axon Instruments	Digidata 1440A
Anti-C3d (goat)	R&D Systems	AF2655	Verdunnen in een verhouding 1:1000
Anti-CD68 (mouse)	Abcam	ab31630-125ug	Verdunnen in een verhouding 1:250
Anti-GFAP (mouse)	Millipore SAS	MAB360	Verdunnen in een verhouding 1:500
Anti-Iba1 (rabbit)	Abcam	ab108539	Verdunnen in een verhouding 1:600
Anti-NeuN (rabbit)	Werfen	16712943S	Verdunnen in een verhouding 1:500
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF)			Thuisgemaakt
B-27™ Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Blades for scalpel handle	Fine Science Tools	10011-00
Bovine Serum Albumin (BSA)	NZYTech	MB04602	5% BSA wordt gebruikt om de primaire antilichamen te verdunnen. Voeg 0,5 g BSA toe aan 10 mL PBS.
Brain/Tissue Slice Chamber System	Warner Instruments
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore	1.02382.0500
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE	Millipore SAS	PICM03050
Cold light source	SCHOTT	KL 300 LED
Confocal laser microscope	Zeiss	LSM 710
Conventional incubator	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Function Line	Instellen op 37 °C en 5% CO2
D(+)-Glucose monohydrate	Merck Millipore	1.08342.1000
D-(+)-Glucose solution, 45% in water	Sigma	G8769
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate	Merck Milipore	1.06580.1000
Dissecting microscope/magnifier	MEIJI TECHNO CO. LTD	122285
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11057	Verdunnen in een verhouding 1:200
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202	Verdunnen in een verhouding 1:200
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037	Verdunnen in een verhouding 1:200
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	Verdunnen in een verhouding 1:500
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Verdunnen in een verhouding 1:500
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5 Forceps Standard Inox	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel	Fine Science Tools	11271-30
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox	Fine Science Tools	11273-22
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS)	Biological Industries	01-919-1A
Glass Electrodes	Science Products	GB150F-10	Rond uiteinden, zelfgemaakt
Glass Pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	24020-091
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Stock oplossing bij 2 mg/mL in PBS
Horse Serum, Heat Inactivated (HS)	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Hydrochloric acid	Merck Milipore	1.09057.1000
Hydrophobic Pen	Dako	S200230-2
INCU-Line IL10	VWR	390-0384
Interface chamber	Warner Instruments	BSC-HT Haas Top
Iris Spatula Curved	Fine Science Tools	10092-12
Labculture Class II Biological Safety Cabinet	HERASafe	HS 12
Lens Cleaning Paper	TIFFEN
L-Glutamine solution 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck Millipore	1.05886.0500
Micro tube 0.5 mL, PP	SARSTEDT	72,699
Micro tube 1.5 mL, PP	SARSTEDT	72.690.001
Micro tube 2.0 mL, PP	SARSTEDT	72.691
Micromanipulators	Sutter Instrument	MP-285
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm	Marienfeld	102242
Nail polish	Cliché
Neurobasal-A Medium (NBA)	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-047
Paraformaldehyde, powder	VWR Chemicals	2,87,94,295
Peristaltic pump	Gilson	M312
Phosphate saline buffer (PBS)			Thuisgemaakt. PBS met 0,5% Tween-20 (PBS-T) wordt gebruikt om plakken te wassen tijdens de immunohistologie test.
Phosphate standard solutions, PO43- in water	BDH ARISTAR	452232