Kwantificering van onoplosbare eiwitaggregatie in Caenorhabditis elegans tijdens veroudering met een nieuwe data-onafhankelijke acquisitieworkflow

Samenvatting

Deze nieuwe workflow extraheert en isoleert op efficiënte wijze SDS-onoplosbare eiwitten (insolubloom) uit Caenorhabditis elegans met minimaal uitgangsmateriaal voor kwantitatieve differentiële proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van een uitgebreide data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie-analyse om de insolublome en bio-informatica-analyse te kwantificeren om biologische inzichten te verkrijgen in verouderingsmechanismen en pathologieën.

Samenvatting

Wij en anderen hebben aangetoond dat het verouderingsproces resulteert in een proteoombrede ophoping van onoplosbare eiwitten. Het uitschakelen van genen die coderen voor de onoplosbare eiwitten gedurende 40% van de tijd resulteert in een verlenging van de levensduur in C. elegans, wat suggereert dat veel van deze eiwitten de belangrijkste determinanten zijn van het verouderingsproces. Isolatie en kwantitatieve identificatie van deze onoplosbare eiwitten zijn cruciaal om de belangrijkste biologische processen te begrijpen die optreden tijdens het ouder worden. Hier presenteren we een aangepast en verbeterd protocol dat beschrijft hoe de SDS-onoplosbare eiwitten (insolublome) uit C. elegans efficiënter kunnen worden geëxtraheerd en geïsoleerd om massaspectrometrische workflows te stroomlijnen via een nieuwe labelvrije kwantitatieve proteomics-analyse. Dit verbeterde protocol maakt gebruik van een zeer efficiënte sonicator voor wormlysis die de efficiëntie voor eiwitextractie aanzienlijk verhoogt en ons in staat stelt aanzienlijk minder uitgangsmateriaal te gebruiken (ongeveer 3.000 wormen) dan in eerdere protocollen (meestal met ten minste 40.000 wormen). Daaropvolgende kwantitatieve proteomische analyse van het insolubloom werd uitgevoerd met behulp van data-afhankelijke acquisitie (DDA) voor eiwitontdekking en -identificatie en data-onafhankelijke acquisitie (DIA) voor uitgebreide en nauwkeurigere eiwitkwantificering. Bio-informatica-analyse van gekwantificeerde eiwitten biedt potentiële kandidaten die gemakkelijk kunnen worden opgevolgd met andere moleculaire methoden in C. elegans. Met deze workflow identificeren we routinematig meer dan 1000 eiwitten en kwantificeren we meer dan 500 eiwitten. Dit nieuwe protocol maakt een efficiënte screening van verbindingen met C. elegans mogelijk. Hier hebben we dit verbeterde protocol gevalideerd en toegepast op wildtype C. elegans N2-Bristol-stam en bevestigd dat N2-wormen op dag 10 een grotere accumulatie van de insolublome vertoonden dan jonge wormen op dag 2.

Inleiding

Eiwithomeostase neemt geleidelijk af bij veroudering en resulteert in een verhoogde eiwitaggregatie ^1,2,3. Eiwitaggregatie wordt in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en amyotrofische laterale sclerose⁴. Veroudering wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor het ontstaan van neurodegeneratieve aandoeningen die verband houden met eiwitaggregatie. Eiwitten die vatbaar zijn voor het vormen van onoplosbare aggregaten worden vaak in verband gebracht met cellulaire toxiciteit en weefseldisfunctie, wat de aggregatie van andere eiwitten verder zou kunnen versnellen ^5,6,7. Als alternatief kunnen onoplosbare eiwitaggregaten cellulaire afweermechanismen activeren om de toxische oligomere vormen van het eiwit uit het systeem te verwijderen. Het uitschakelen van geselecteerde genen die coderen voor onoplosbare eiwitten moduleert de levensduur van Caenorhabditis elegans (C. elegans) in de context van zowel ouderdomsziekten als normale veroudering ^5,8,9. Het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van eiwitaggregatie is dus cruciaal voor het begrijpen van veroudering en kan uiteindelijk leiden tot benaderingen voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten.

De nematode C. elegans is een van de meest gebruikte modelorganismen geworden om eiwitaggregatie bij veroudering en ouderdomsziekten te bestuderen vanwege zijn unieke kenmerken, zoals een relatief korte levensduur (ongeveer 2 weken), kweekgemak en genetische manipulatie.

Het vermogen om onoplosbare eiwitten te extraheren en te karakteriseren heeft een cruciale rol gespeeld bij het bepalen van de leeftijdsgebonden veranderingen die verband houden met eiwitaggregatie in C. elegans-modellen. Om de bijdrage van eiwitaggregatie aan normale verouderingsprocessen te onderzoeken, hebben we⁵ en anderen² eerder het insolubloom van jonge versus oude C. elegans geëxtraheerd en proteolytisch verteerd, chemisch gelabeld met behulp van iTRAW-reagentia ('isobarische tagging voor relatieve en absolute kwantificering'), en vervolgens gekwantificeerd met behulp van MS-gebaseerde methoden. Met behulp van een isobare etiketteringsmethode en 120 mg natte wormen (ongeveer 40.000 wormen), waren we in staat om een aanzienlijke eiwitinolubloomdiepte en -dekking te verkrijgen⁵. Kwantitatieve analyse toonde aan dat 203 van de 1200 geïdentificeerde eiwitten significant verrijkt waren in het insolubloom van oude C. elegans in vergelijking met vergelijkbare insolubloomfracties van jonge wormen⁵. Onafhankelijk van elkaar gebruikten David et al. ook een iTRAQ LC-MS/MS-workflow om veranderingen in eiwitaggregaten bij normale veroudering te onderzoeken². Beginnend met ongeveer 300 mg wormen, identificeerden ze ~1000 onoplosbare eiwitten met behulp van twee biologische replicaten en bepaalden dat ~700 van de ongeveer 1000 eiwitten zich 1,5 keer of meer ophoopten met de leeftijd in vergelijking met jonge wormen². Over het algemeen geven deze onafhankelijke resultaten aan dat wijdverbreide eiwitoplosbaarheid en -aggregatie een inherent onderdeel zijn van normale veroudering en zowel de levensduur als de incidentie van neurodegeneratieve ziekten kunnen beïnvloeden ^2,5.

Het bestuderen van de insolublome had ons in staat gesteld om te bepalen hoe omgevingsinvloeden het verouderingsproces kunnen versnellen of vertragen. Klang et al. hebben labelvrije proteomische workflows opgesteld in C. elegans om de rol van metallostase bij een lang leven te onderzoeken¹⁰. In deze studie werden minstens 40.000 wormen gebruikt om het insolublome¹⁰ te extraheren. Gegevens toonden aan dat het ijzer-, koper-, calcium- en mangaangehalte toeneemt met het ouder worden en dat het voeren van wormen met een dieet met verhoogd ijzer de leeftijdsgebonden accumulatie van onoplosbare eiwitten aanzienlijk versnelde¹⁰. Met behulp van dezelfde workflow om de effecten van vitamine D op de insolublome van C. elegans te onderzoeken, werden 38 eiwitten gekwantificeerd in jonge wormen (dag 2) en 721 eiwitten in oude wormen (dag 8). Vitamine D-voeding verminderde de insolubloom van oude wormen aanzienlijk van 721 naar 371 eiwitten¹¹. Verder onderzoek toonde aan dat het voeren van vitamine D de onoplosbaarheid van eiwitten met de leeftijd onderdrukte, de eiwithomeostase bevorderde en de levensduur verlengde bij C.elegans N2 wildtype wormen¹¹. Het bestuderen van het insolublome kan dus helpen bij het identificeren van nieuwe modulatoren van veroudering en ouderdomsziekten.

Hoewel het bestuderen van de insolublome van onschatbare waarde is geweest voor het bevorderen van het begrip van het verouderingsproces, werd het gehinderd door de vereiste om grote hoeveelheden startmonstermateriaal te verzamelen. Groh et al. introduceerde onlangs een labelvrije proteomische kwantificeringsworkflow om inherente eiwitaggregatieveranderingen in C. elegans bij veroudering te bestuderen; Er waren echter grote hoeveelheden uitgangsmateriaal voor nodig (350 mg gemalen wormen)¹². In dit rapport hebben we een verbeterd nieuw extractie- en isolatieprotocol opgesteld (Figuur 1). Het gebruik van de zeer efficiënte sonicator tijdens wormlysis verbeterde de extractie-efficiëntie aanzienlijk en verminderde vervolgens de benodigde hoeveelheid uitgangsmateriaal, van 40.000 naar 3.000 wormen. Door dit nieuwe insolublome-isolatieprotocol te combineren met een labelvrije data-onafhankelijke acquisitie (DIA) massaspectrometrische workflow, is de eiwitdiepte en -dekking aanzienlijk verbeterd. Het hier gepresenteerde protocol is kosteneffectief en kan gemakkelijk worden aangepast om de uitvoering van insolublome-analyses in andere modelsystemen mogelijk te maken.

Protocol

OPMERKING: Voor een beter begrip van de experimentele procedure, zie Figuur 1 voor een schema van de workflow.

1. Massacultuur van gesynchroniseerd ouder wordende C. elegans

1. Plaat voorbereiding
   1. Giet 30 ml NGM-agar met of zonder 50 mM fluorodeoxyuridine (FUdR) in elke plaat van 90 mm en laat de platen 2 dagen drogen in kweekkappen.
   2. Inoculeer op de dag voor het zaaien van de NGM-agarplaat een aliquoot van 50 μl bevroren glycerolvoorraad van de OP50-bacteriestam in 1 l voorgeautoclaveerd LB-medium in een kolf van 2 l.
   3. Kweek de bacteriën bij 37 °C in een schudbroedmachine bij 250 tpm gedurende 16 uur.
   4. Centrifugeer de bacterieculturen na 16 uur gedurende 10 minuten met een snelheid van 5.000 x g .
   5. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de bacteriële pellet volledig opnieuw in 40 ml geautoclaveerde S-basale oplossing (met 50 mM K₃PO₄, 100 mM NaCl in water) om de 25x geconcentreerde OP50 E. coli-cultuur te genereren.
   6. Doseer 2 ml van de 25x geconcentreerde bacteriecultuur op elke NGM-agarplaat en verdeel gelijkmatig zodat de bacteriecultuur het hele agaroppervlak bedekt.
   7. Verwijder de deksels van de platen in een bacteriecultuurkap gedurende 2-3 uur totdat de platen goed gedroogd zijn.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de bacteriën gelijkmatig verdeelt door de platen elke 15 minuten rond te draaien. Dit is belangrijk omdat bacteriën de neiging hebben zich aan één kant van de plaat te concentreren, wat resulteert in gebieden met een lage bacteriedichtheid.
   8. Nadat de platen zijn gedroogd, sluit u de deksels en laat u de platen 48 uur op kamertemperatuur staan om ervoor te zorgen dat de OP50 E. coli-voedselbron volledig droog is.
      LET OP: Platen kunnen 2 weken van tevoren worden klaargemaakt en voor gebruik bij 4 °C worden bewaard.
2. Onderhoud en voorbereiding van gesynchroniseerde cohorten van C. elegans
   1. Om de vereiste input van eiwitlysaat (1,0-1,5 mg) te verkrijgen voor de isolatie van de SDS-onoplosbare fractie, gebruikt u ongeveer 3.000 gesynchroniseerde wormen per monster.
   2. Breng ~100 N2 wildtype drachtige volwassen wormen over naar een NGM 25x OP50 E. coli-geplaatste plaat en houd de wormen gedurende ~72 uur op 20 °C totdat de plaat vol is met drachtige volwassen wormen.
   3. Pipetteer ~10 ml S-basale oplossing op elke plaat en verzamel alle wormen in een buis van 15 ml.
      OPMERKING: Het is belangrijk om tijdens deze en alle toekomstige stappen met het verzamelen van wormen tips met een lage retentie of pasteurpipetten te gebruiken om te voorkomen dat wormen verloren gaan als gevolg van bevestiging aan tipoppervlakken.
   4. Draai het monster gedurende 30 s op 520 x g . Verwijder het bovenstaande na het centrifugeren. Om eventuele OP50 E. coli te elimineren, voegt u 10 ml S-basale oplossing toe aan de pellet en draait u opnieuw, gevolgd door verwijdering van de supernatant. Herhaal deze stap.
   5. Voeg 10 ml natriumhypochlorietbleekoplossing (met 0,5 M KOH en 0,48% natriumhypochloriet in water) toe aan de wormpellet in een conische buis van 15 ml en draai krachtig gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Centrifugeer bij 520 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om onvolledig opgeloste wormlichamen en eieren te centrifugeren. Verwijder vervolgens de supernatant.
   7. Herhaal stap 1.2.5 en 1.2.6 om ervoor te zorgen dat alle wormlichamen volledig zijn verwijderd en dat de eieren vrijkomen (bekijk de buis onder de microscoop om er zeker van te zijn).
   8. Was de eierpellet minstens 4 keer met 10 ml S-basale oplossing om ervoor te zorgen dat de bleekoplossing volledig wordt verwijderd.
      OPMERKING: Volledige verwijdering van bleekmiddel is belangrijk omdat achtergebleven bleekmiddel het uitkomen van eieren kan belemmeren.
   9. Laat de eieren geresuspendeerd in 5 ml S-basale media in een buis van 15 ml en plaats ze gedurende 24 uur in de rotor bij 20 °C om de eieren uit te laten komen.
   10. Neem na 24 uur 10 μL S-basale larvenoplossing om het aantal wormen erin te tellen. Gebruik ten minste drie afzonderlijke aliquots van 10 μl S-basale larvenoplossing voor de replicatie van het aantal wormen. Bereken het gemiddelde van de drie larvale concentraties. Verdun op basis van de gemiddelde concentratie de wormoplossing om ~3.000 larven per 200 μL oplossing te verkrijgen.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat u de buis voorzichtig schudt door deze om te keren, aangezien de larven de neiging hebben zich te nestelen als ze niet worden gestoord en dat kan het aantal larven beïnvloeden.
   11. Meng goed en voeg 200 μL S-basale larvenoplossing toe aan elk van de 90 mm NGM-bacteriegezaaide platen.
       OPMERKING: Voeg druppels S-basale larvenoplossing toe over de hele plaat voor een gelijkmatige verdeling van de larven om bacteriële uitputting op bepaalde plekken te voorkomen.
   12. Laat de S-basale oplossing drogen en plaats de platen omgekeerd in een incubator van 20 °C gedurende 48 uur.
   13. Verzamel na 48 uur de wormen van de plaat in S-basale oplossing en breng ze over naar een verse plaat met NGM-zaden met 50 mM FUDR en incubeer platen bij 20 °C.
       OPMERKING: Het is belangrijk om wormen vroeg in de L4-fase over te brengen om de efficiëntie van de FUDR te garanderen.
   14. Verzamel monsters voor jonge volwassenen op dag 2 na 48 uur door 10 ml S-basale oplossing op de plaat toe te voegen en de oplossing over te brengen in een tube van 15 ml. Laat wormen door de zwaartekracht bezinken en verwijder de S-basale oplossing nadat deze helder is geworden.
   15. Was de wormenkorrel 2-3x in 5 ml S-basale oplossing om eventuele aangehechte bacteriën te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk S-basale oplossing en vries de wormenkorrel (in buisjes van 15 ml) in een droogijs/ethanolbad. Bevroren monsters worden bewaard bij -80 °C.
   16. Breng het monster van de wormen over naar een verse NGM OP50 E. coli-plaat met FUDR om de dag tot dag 10. Verzamel en vries wormen in zoals beschreven in de stappen 1.2.14 en 1.2.15.
       OPMERKING: Begin met een hoger aantal wormen voor monsters op dag 10 om rekening te houden met eventueel verlies in wormaantal als gevolg van overdracht en graven.

2. Extractie van SDS-onoplosbare fractie uit wormen

1. Ontdooi de bevroren wormpellet op ijs in aanwezigheid van 900 μL ijskoude wormlysisbuffercocktail met 20 mM Tris-base, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ en EDTA-vrije proteaseremmer. Draaikolken kort monsters om volledige resuspensie van wormpellet in de lysisbuffer te garanderen.
2. Plaats de buizen van 15 ml in het sonicatiebad en stel ze in voor 10 sonicatiecycli (30 s aan en 30 s uit voor elke cyclus) met hoge intensiteit. Herhaal dit gedurende maximaal vijf cycli (zorg ervoor dat de wormen volledig zijn gelyseerd).
3. Draai het lysaat gedurende 4 minuten op 3.000 x g in de koelcel. Gooi na het centrifugeren de pellet met wormresten weg en breng het bovenstaande voorzichtig over in verse voorgekoelde centrifugebuizen van 1,5 ml op ijs.
4. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-test. Breng lysaataliquots, die gewoonlijk ongeveer 1 mg eiwit bevatten, over in verse voorgekoelde centrifugebuizen van 1,5 ml.
5. Centrifugeer het eiwitlysaat gedurende 15 minuten op 20.000 x g in de koelcel.
6. Breng het bovenstaande over, zonder de pellet te verstoren, over in een verse centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze als de in water oplosbare eiwitfractie.
7. Was de pellet van de vorige stap in 500 μL wormlysisbuffer met 1% SDS bij kamertemperatuur en centrifugeer op 20.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het bovenstaande en sla op als de SDS-oplosbare fractie. Herhaal deze wasstap twee keer om eventuele SDS-oplosbare fractie te verwijderen. De resterende korrel na de derde wasronde wordt gedefinieerd als de 1% SDS-onoplosbare eiwitfractie.
8. Resuspendeer de SDS-onoplosbare eiwitpellet in 60 μL 70% mierenzuur en draai krachtig om de eiwitten op te lossen. Herhaal krachtige vortex zo vaak als nodig is om de pellet op te lossen.
9. Sonificeer de pellet gedurende 30 minuten in een ultrasoonwaterbad bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De SDS-onoplosbare pellet is meestal moeilijk op te lossen in de buffer. Uiteindelijk moet echter de hele korrel in deze stap worden opgelost.
10. Droog de monsters gedurende 1 uur in een vacuümconcentrator om de mierenzuuroplossing volledig te verwijderen.
11. Voeg 40 μL 1x LDS-monstergelbuffer toe aan de gedroogde pellet en verwarm het monster gedurende 10 minuten tot 95 °C. Draai en draai de samples kort naar beneden. Laad 13 μL op een 4-12% NUPAGE Bis-Tris gel en laat de gel lopen. Kleur de gel met een fluorescerende eiwitkleuring voor beeldvorming. Bewaar de rest van het monster voor analyse van massaspectrometrie (MS).
12. Laad het resterende monster in een 4-12% Bis-Tris-gel en laat ongeveer 20 minuten draaien voor MS-in-gel spijsvertering.

3. In-gel digestie met trypsineprotease om eiwitten te isoleren voor MS-analyse

1. Bereid de volgende oplossingen (vers): 25 mM NH₄HCO₃ (pH 7-8), 25 mM NH₄HCO₃ in 50% acetonitril (ACN, pH 7-8) en 50% ACN in 5% mierenzuur.
2. Snijd elke plakje gel in kleine stukjes (meestal <1 mm²) en plaats deze in gesiliconiseerde tubes van 0,65 ml.
3. Voeg ongeveer 100 μL (of genoeg om te bedekken) van een 25 mM NH₄HCO₃/50% ACN-oplossing toe en vortex gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Extraheer het bovenstaande en breng het over in een aparte buis (weg te gooien). Herhaal deze stap nog twee keer.
4. Droog de gelstukjes volledig af in een vacuümconcentrator (~20 min).
5. Bereid verse oplossingen en voeg ~100 μL (of genoeg om te dekken) 10 mM DTT in 25 mM NH₄HCO₃ toe aan de gedroogde gelstukjes (gebruik vers bereide NH₄HCO₃). Draaikolk en draai kort. Laat de reactie 1 uur lang bij 56 °C verlopen en schud bij 1400 tpm op een mixer.
6. Verwijder het bovenstaande en voeg 100 μL 55 mM jodoacetamide (IAZ) in 25 mM NH₄HCO₃ toe aan de gelstukjes. Draaikolk en draai kort. Laat de reactie 45 minuten in het donker doorgaan bij RT.
7. Verwijder het bovenstaande en gooi het weg. Was de gelstukjes door ~100 μL 25mM NH₄HCO₃ toe te voegen en gedurende 10 minuten te vortexen. Draai kort en verwijder de supernatant, gooi de laatste weg.
8. Dehydrateer de gelstukjes door ~100 μL (of genoeg om te bedekken) van 25 mM NH₄HCO₃ in 50% ACN toe te voegen aan de gelstukjes en vortex gedurende 10 min. Draai vervolgens kort om het supernatant te verwijderen en weg te gooien. Herhaal deze stap twee keer of zelfs een derde keer als de gelstukjes niet helemaal droog zijn, zoals aangegeven door de kleinere grootte van de gelstukjes en de troebele witte kleur.
9. Droog de gelstukjes volledig af in een vacuümconcentrator (~20 min).
10. Voeg eerst 15 μL trypsineoplossing (250 ng trypsine) toe aan elk monster en voeg vervolgens voldoende 25 mM NH₄HCO₃ toe om de gelstukjes te bedekken (~100 μL). Vortex gedurende 10 min. Centrifugeer vervolgens kort en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in de koelcel zonder te mengen.
11. Voeg indien nodig 25 mM NH₄HCO₃ toe om de gelstukken volledig te bedekken. Centrifugeer en incubeer 's nachts bij 37 °C gedurende 16-20 uur bij 1400 tpm op een mixer.
12. De volgende dag draai en draai de spijsvertering kortstondig. Voeg ongeveer 100 μl water van HPLC-kwaliteit toe, centrifugeer, parafilm de buis en sonificeer continu gedurende 10 minuten. Draai kort na sonicatie.
13. Breng de digestieoplossing, die de waterige extractie vertegenwoordigt, over in een schone gesiliconiseerde buis van 0,65 ml.
14. Voeg ~100 μL 50% ACN/5% mierenzuur toe aan de gelstukjes (genoeg om ze te bedekken), vortex 10 minuten bij kamertemperatuur, draai kort en vang de oplossing op, en herhaal een keer. Voeg alle oplossingen met de geëxtraheerde peptiden uit deze stap en de vorige stap 3.13 samen in een enkele buis.
15. Draai de geëxtraheerde verteringsmiddelen. Droog de peptiden volledig in een vacuümconcentrator (~2 uur).
16. Voeg 30 μL 0,2% mierenzuur toe om de peptiden gedurende 10 minuten op een mixer in de koelcel te suspenderen.
17. Draai de monsters 5 minuten op 1850 x g bij kamertemperatuur. Zuig de peptideoplossing op en verplaats deze in een nieuwe, schone gesiliconiseerde buis van 0,65 ml. Ontzout vervolgens de peptidenoplossing met behulp van C18 ontzouttips (zie hieronder).

4. Ontzouten van verteerde peptiden met C18 ontziltingstip

1. Stel de pipet in op 10 μL en bevestig de C18 ontziltingstip. Maak de ontziltingstip nat door 10 μL 100% ACN te pipetteren en vervolgens weg te gooien. Herhaal deze stap 2x.
2. Was de C18 ontziltingstip door 10 μL 50% ACN, 49,8% water en 0,2% FA te pipetteren en vervolgens weg te gooien. Herhaal deze stap 2x.
3. Breng de C18-ontziltingstip in evenwicht door 10 μl 0,2% FA in water te pipetteren en vervolgens weg te gooien. Herhaal deze stap 2x.
4. Stel het pipet in op 10 μL en laad de peptiden van de oplossing naar de hars door de verteerde peptiden 15x op en neer door de hars te pipetteren.
   OPMERKING: De herhaalde actie zorgt ervoor dat alle peptiden worden gebonden aan de hars van de ontziltingsuiteinden.
5. Ontzout de verteerde peptiden die aan de hars zijn gebonden door 10 μL 0,2% FA in water te pipetteren en vervolgens weg te gooien. Herhaal deze stap 4x om de ontziltingsstap te voltooien.
6. Elueer de peptiden in een nieuwe buis met 10 μl 50% ACN, 49,8% water en 0,2% FA door 10x op en neer te pipetteren. Herhaal deze stap een keer om het eiwitdigestaat voor de tweede keer in dezelfde buis te elueren.
7. Droog de ontzoute peptiden volledig in een vacuümconcentrator (~20 min).
8. Resuspendeer peptiden in 15 μL 0,2% FA + 1 μL iRT (geïndexeerde retentietijd) peptiden. Voxtex gedurende 10 minuten, centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 2 minuten en vervolgens overbrengen naar een autosampler-injectieflacon voor MS-analyse (zie hieronder).

5. Massaspectrometrie-analyse van verteerde peptiden met behulp van DDA en DIA

OPMERKING: Monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van DDA- of DIA LC-MS/MS-methoden. In deze studie werden de monsters geanalyseerd met behulp van een nano-LC 2D HPLC-systeem gekoppeld aan een massaspectrometer met hoge resolutie.

1. Gebruik een HPLC-systeem in combinatie met een op chips gebaseerd HPLC-systeem dat rechtstreeks is aangesloten op een quadrupool time-of-flight massaspectrometer (andere LC-MS-configuraties en -systemen kunnen ook worden gebruikt).
2. Analyseer monsters met behulp van reverse-phase HPLC-ESI-MS/MS.
   1. Bouw het chromatografieprotocol om peptidenmonsters op een C18-prekolomchip te laden. Was en ontzout de geladen peptiden met laadoplosmiddel (0,1% mierenzuur) gedurende 10 minuten bij een debiet van 2 μL/min.
   2. Breng de peptiden over naar een analytische kolom C18-chip en elueer met een stroomsnelheid van 300 nL/min met een gradiënt van 3 uur met behulp van mobiele fase A (2% acetonitril, 0,1% mierenzuur) en B (98% acetonitril, 0,1% mierenzuur). De eerste elutiestap bestaat uit een lineaire gradiënt van 5% B naar 35% B over een periode van 80 minuten.
   3. Verhoog de mobiele fase B naar 80% gedurende 5 minuten en houd vervolgens de mobiele fase B gedurende 8 minuten op 80% voordat u overschakelt naar 5% B om de kolom gedurende 25 minuten opnieuw in evenwicht te brengen.
3. Stel een MS-instrumentmethode in voor DDA en definieer de instrumentparameters als volgt.
   1. Gebruik de volgende parameters voor Experiment 1:MS1 precursor-ionenscan van m/z 400-1500 (accumulatietijd van 250 ms); stel de intensiteitsdrempel in om MS/MS-scans te activeren voor ionen met laadtoestanden van 2-5 tot 200 tellen; Stel de dynamische uitsluiting van voorloperionen in op 60 s).
   2. Gebruik de volgende parameters voor experiment 2: MS/MS-productionenscans met een MS2-scan variëren van m/z 100-1500 (accumulatietijd van 100 ms per elk van de 30 productionenscans per cyclus); stel de botsingsenergiespreiding in op CES=5 en vink 'zeer gevoelige productionenscanmodus' aan.
      OPMERKING: De DDA-acquisitiemethode wordt gebruikt om spectrale bibliotheken op te bouwen, zoals beschreven in stap 6.3 (zie hieronder). Hier zal het MS/MS-spectra verkrijgen voor de 30 meest voorkomende voorloperionen na elke MS1-scan per cyclus; De totale cyclustijd is ongeveer 3,3 s.
4. Verkrijg DIA. Stel een MS-instrumentmethode in voor DIA en definieer de instrumentele parameters als volgt.
   1. Gebruik de volgende parameters voor experiment 1: MS1 precursor-ionenscan van m/z 400-1250 (accumulatietijd van 250 ms).
   2. Gebruik de volgende parameters voor experiment 2: MS/MS-productionenscans voor 64 variabele SWATH-segmenten met een MS2-scanbereik van m/z 100-1500 (accumulatietijd van 45 msec per elk van de 64 productionenscans per cyclus); stel de botsingsenergiespreiding in op CES=10, vink 'ZEER GEVOELIGE PRODUCT-IONENSCANMODUS' aan.
      OPMERKING: Gebruik de DIA/SWATH-acquisitiemethode met 64 variabelen, zoals beschreven door Schilling et ^al.13 , om labelvrije kwantificering uit te voeren met een totale cyclustijd van ongeveer 3,2 s. Voor DDA-acquisitie wordt in plaats van de Q1-quadrupool te gebruiken om voorloperion van een smal massabereik naar de botsingscel te verzenden, een bereik met variabele vensterbreedte (bijvoorbeeld m/z 5-90) gebruikt om stapsgewijs over het volledige m/z-bereik (m/z 400-1250) te stappen met 64 SWATH-segmenten, 45 ms accumulatietijd voor elk segment, wat resulteert in een cyclustijd van 3,2 sec, inclusief één MS1-scan met een accumulatietijd van 250 ms. De breedte van het variabele venster wordt aangepast aan de complexiteit van de typische MS1-ionenstroom die binnen een bepaald m/z-bereik wordt waargenomen met behulp van een SCIEX 'variable window calculator'-algoritme¹³ (smallere vensters worden toegepast op 'drukke' m/z-bereiken, bredere vensters worden toegepast op m/z-bereiken met weinig afgevende voorloperionen). Op andere platforms van de lidstaten kunnen ook alternatieve strategieën voor de selectie van DIA-vensters worden toegepast.

6. Gegevensanalyse

OPMERKING: Bepaalde instellingen voor gegevensanalyse moeten worden afgestemd op specifieke experimentele omstandigheden. De geselecteerde eiwitdatabase (fasta-bestand) is bijvoorbeeld afhankelijk van de soort waaruit het monster is bereid (in dit protocol hebben we C. elegans gebruikt).

1. Gebruik een MS-databasezoekmachine om DDA-acquisities te analyseren en eiwitten te identificeren. Genereer als volgt een darabase zoekmachine methode:
   1. Selecteer Identificatie voor Sample Description Parameters; selecteer onder Monstertype de optie Jodoazijnzuur; selecteer onder cysteïne-alkylering de optie Trypsine; selecteer onder Spijsvertering (uitgaande van C-terminale splitsing bij lysine en arginine) de naam van de massaspectrometer onder Instrument; en selecteer Caenorhabditis elegans onder Soort.
   2. Voor specifieke verwerkingsparameters, zie Biologische modificaties; selecteer onder ID Focus de optie SwissProt; vink onder Database het vinkje aan voor Grondige ID; selecteer onder Zoekinspanning 0,05 (10%) onder Gedetecteerde eiwitdrempel; en vink Analyse van valse ontdekkingspercentages uitvoeren aan onder Kwaliteit van resultaten. Sla de zoekmachinemethode op en verzend de MS-onbewerkte bestanden naar de databasezoekmachine voor verwerking, met behulp van de gegenereerde methode.
      OPMERKING: In een iteratief proces werden alle MS- en MS/MS-scans automatisch opnieuw gekalibreerd door de zoekmachine op basis van de eerste annotaties en resultaten.
2. Klik op Peptide Samenvatting exporteren na voltooiing van de zoekopdracht en filter alle peptide-identificatieresultaten op de betrouwbaarheidsdrempel van 99 in Excel (false discovery rate (FDR) = 1%).
3. Bouw MS/MS-spectrale bibliotheken voor verdere verwerking van het DIA-bestand met onbewerkte gegevens en voor verdere kwantificering van relatieve gegevens.
   1. Open de DIA kwantitatieve analysesoftware. Selecteer het tabblad Bibliotheek en klik vervolgens (onder aan de pagina) op Spectrale bibliotheek genereren vanuit "Database Search Engine" en open een "Database Search Engine" FDR-rapport (het *FDR.xlsx spreadsheetbestand) dat automatisch is gegenereerd als onderdeel van het zoekproces in de database van DDA-onbewerkte gegevensbestanden.
   2. Klik op volgende, selecteer het schema voor bibliotheekinstellingen en klik op Volgende. Selecteer Uniprot_Caenorhabditis elegans _proteome als de database en klik vervolgens op Voltooien, de spectrale bibliotheek wordt gegenereerd.
4. Gebruik de DIA Quantitative Analysis Software om DIA-acquisities te analyseren voor uitgebreide kwantificering van relatieve eiwitten. De pijplijn voor DIA-gegevensanalyse wordt als volgt beschreven.
   1. Om peptiden te analyseren en te kwantificeren, opent u de DIA Quantitative Analysis Software om een analyseschema op te zetten met behulp van het sjabloonschema. Het sjabloonschema is beschikbaar in de software door te klikken op Instellingen, vervolgens op DIA-analyse en ten slotte op BGS-fabrieksinstellingen.
   2. Stel de parameters in het sjabloonschema als volgt in:
      1) selecteer onder identificatie PTM-lokalisatie (waarschijnlijkheidsgrens = 0,75).
      2) selecteer onder kwantificering de hoeveelheid van de hoofdgroep als de hoeveelheid som van peptiden, stel hoofdgroep N in als Max 7 en Min 1, selecteer de hoeveelheid van de kleine groep als de hoeveelheid van de som van de voorloper en stel Minor Group N in als Max 10 en Min 1, en selecteer Gegevensfiltering als Q-waarde schaars en selecteer Cross Run Normalization niet.
5. Voer relatieve kwantificeringsanalyse uit.
   1. Selecteer het tabblad Pijplijn , klik op Een DIA-analyse instellen op basis van bestand, open de MS DIA-onbewerkte bestanden die van belang zijn (bijvoorbeeld: monster en besturingselement), klik op Spectrale bibliotheek toewijzen, selecteer de bibliotheek die is gegenereerd in 6.3, klik op Laden en klik ten slotte op Volgende.
   2. Selecteer het analyseschema dat is ingesteld in 6.5.1 en klik op Volgende. Selecteer het juiste database-fasta-bestand (in dit protocol: Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) en klik op Volgende. Definieer de voorwaarde-instelling en wijs de verschillende voorwaarden toe op basis van de voorbeelden en klik op Volgende.
   3. Bekijk het analyseoverzicht (samenvatting van de opzet van het experiment) en blader naar de uitvoermap en klik op Voltooien. Klik ten slotte op Pijplijn uitvoeren om de labelvrije kwantitatieve analyse uit te voeren.
      OPMERKING: Statistische modules in de 'DIA Quantitative Analysis Software' voeren automatisch FDR-analyse uit, genereren heatmaps en vulkaandiagrammen die de verschillende omstandigheden vergelijken, genereren lijsten van geïdentificeerde en gekwantificeerde peptiden en eiwitten en bieden Q-waarden samen met relatieve vouwveranderingen die verschillende omstandigheden vergelijken. Hier waren de opstelling van de voorbeeldomstandigheden onder meer dag 10 oude wormen met twee biologische replicaten en dag 2 jonge wormen met twee biologische replicaten als controle.

Resultaten

Traditionele wormlysismethoden hebben verschillende nadelen. Op sondes gebaseerde sonicatie- en kralenkloppermethoden produceren bijvoorbeeld overmatige hitte door contact van de metalen punt of kralen rechtstreeks met de monsters toe te staan, wat resulteert in variabele eiwitterugwinning en eiwitdenaturisatie. Het malen van vloeibare stikstof gevolgd door sonicatie in lysisbuffer kan tijdrovend zijn en vereist een groot aantal wormen. Vanwege de beperkingen van traditionele wormlysismethoden vereisen eerdere MS-workflows, zoals de labelmethoden iTRAQ of labelvrije methoden die in het verleden zijn gebruikt in het C. elegans-modelsysteem om kwantitatieve informatie over het insolubloom te verkrijgen, een grote input van uitgangsmateriaal (minstens 40.000 wormen). Er is moeizaam wormkweekwerk nodig om deze aantallen wormen te verkrijgen. Bovendien vereisen de etiketteringsmethoden dure isobare chemische etiketten. Labelvrije kwantificeringsmethoden zijn kosteneffectief en hebben eenvoudigere en eenvoudigere monstervoorbereidings- en etiketteringsmethoden, maar vereisen aanzienlijk grote aantallen wormen om voldoende MS-analysedekking te bereiken.

De sonicator die we hebben gebruikt, verhoogt de efficiëntie en reproduceerbaarheid van wormlysis aanzienlijk door meerdere wormmonsters tegelijk te lyseren in een temperatuurgecontroleerde waterbadsonicator zonder kruisbesmetting¹⁴, waardoor de benodigde hoeveelheid startwormmateriaal aanzienlijk wordt verminderd. Door de zeer efficiënte sonicatiemethode en de kwantitatieve DIA-labelvrije MS-benadering te combineren, waren we in staat om de onoplosbaarheid van oude en jonge wormen robuust te kwantificeren met behulp van ~3.000 wormen. Hier hebben we de efficiëntie van het protocol getest en gevalideerd en de insolubloom van oude en jonge wormen van een wild-type wormstam, N2-Bristol C. elegans, vergeleken. We hebben dit protocol toegepast om het insolubloom te extraheren en te isoleren van ~3.000 oude en jonge N2 C. elegans (twee biologische replicaten voor elke aandoening), gevolgd door MS-analyse met een quadrupool time-of-flight massaspectrometer of andere MS-systemen met behulp van een combinatie van data-afhankelijke acquisitie (DDA) en data-onafhankelijke acquisities (DIA/SWATH) voor eiwitidentificatie en kwantificering. De onoplosbare eiwitten werden eerst geanalyseerd op een Bis-Tris 4-12% gradiëntgel om de hoeveelheid eiwit in elk insolubloommonster te bepalen. Zoals aangetoond in figuur 2, bevat het insolubloommonster van N2-oude wormen (banen 2 en 3, biologische replicatie-experimenten) significant meer eiwit dan monsters van de N2-jonge wormen (banen 1 en 4, biologische replicatie-experimenten).

Na in-gel digestie werden de eiwitprofielen van het insolubloom geanalyseerd door HPLC-MS. Met behulp van deze workflow kunnen we over het algemeen 1000-1500 eiwitten identificeren en 500-1.000 eiwitten kwantificeren uit de SDS-onoplosbare fractie met een hoge reproduceerbaarheid (niet-gepubliceerde gegevens). Hier waren we in staat om 989 eiwitten uit het insolubloom van N2-Bristol C. elegans te kwantificeren door de DIA-gegevens te analyseren en redundantie te verwijderen: 768 eiwitten waren significant verrijkt en 27 eiwitten waren significant verminderd in het insolubloom van oude N2-worm (dag 10) in vergelijking met jonge (dag 2) met behulp van een vouwverandering van ten minste 1,5 en een Q-waarde van minder dan 0,01 (Figuur 3A). Zoals te zien is op de histogramgrafiek (Figuur 3B), vertoont de vouwverandering van significant veranderde eiwitten een normale verdeling. Van oude wormen werd aangetoond dat ze significant verrijkt waren voor het insolubloom: de grootste waargenomen verandering toonde aan dat de relatieve eiwitovervloed in het insolubloom 592 keer hoger was bij de oude versus jonge wormen; En voor 32 eiwitten was de relatieve eiwitovervloed in het insolublome >250 keer hoger bij de oude versus jonge wormen, wat wijst op dramatische insolubloomveranderingen met de leeftijd.

Na het extraheren van de lijst van onoplosbare eiwitten die significant verhoogd zijn in de oude wormen en geïdentificeerd door de wormbase (WS271), werden KEGG-route en genontologie (GO) -analyse uitgevoerd om de routes te bepalen die zijn verrijkt in de verouderde insolubloom om biologische inzichten te verkrijgen in hoe deze verband houden met veroudering. De KEGG-routeanalyse van eiwitten die in deze studie zijn geïdentificeerd, toont verrijking van verschillende routes waarbij ribosomen, mitochondriën, proteasoom en spliceosoom betrokken zijn (Figuur 4A). De genontologische analyse toont aan dat het insolubloom van oude wormen vele eiwitten omvat in bepaalde categorieën, waaronder mitochondriale, ontwikkelings-, determinanten van de volwassen levensduur en ribosomale eiwitten (Figuur 4B en aanvullende tabel 1A). Vervolgens vergeleken we de lijst van eiwitten die in deze studie zijn geïdentificeerd met eerder gepubliceerd werk van David et ^al.2 en Mark et ^al.11 zoals aangetoond in Venn-diagrammen (Figuur 5A,5B). De vergelijking toonde een significante overlap van geïdentificeerde eiwitten 394/721 en 444/721 met respectievelijk de studie van David et al (Figuur 5A) en Mark et al. (Figuur 5B). De biologische routes die uit deze studie door de KEGG-analyse van insolublome aan het licht zijn gekomen, zijn in het verleden ook geïdentificeerd, waardoor onze methodologie is gevalideerd (aanvullende tabel 1B). Identificatie van deze routes en eiwitten suggereert dat ze kunnen dienen als kandidaten voor verder biologisch onderzoek met betrekking tot hun functie in de context van veroudering.

Samenvattend maakt het gebruik van de efficiënte sonicatiemethode het mogelijk om meerdere wormmonsters tegelijkertijd te lyseren in een omgeving met goed gecontroleerde temperaturen en verminderde kruisbesmetting om een hoge eiwitdekking te bereiken met aanzienlijk minder startmateriaal van de worm. De combinatie van de efficiënte sonicatiemethode met een DIA-labelvrije eiwitkwantificeringsworkflow heeft betrouwbare en reproduceerbare resultaten opgeleverd voor de kwantificering van onoplosbare wormeiwitten.

Figuur 1. Experimentele workflow van het protocol. C. elegans werden op verschillende dagen gekweekt en verzameld. Na wormlysis met een sonicator werd de 1% SDS-onoplosbare eiwitfractie (insolubloom) geëxtraheerd en geïsoleerd uit het lysaat. Het insolubloom werd vervolgens verteerd via in-gel trypsine-digestie en gekwantificeerd via DIA-massaspectrometrie, gevolgd door bio-informatica-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. SDS-PAGE gel van de insolublome isoleerde jonge versus oude wormen van de N2-Bristol stam. De insolumen van jonge versus oude wormen van de N2-Bristol-stam werden door SDS-PAGE geanalyseerd om de hoeveelheid aanwezig eiwit te bepalen. De SDS-PAGE-gel werd gekleurd met een fluorescerende eiwitkleuring om eiwitbanden te visualiseren. Banen 1 en 4: Insolublome van twee biologische replicatie-experimenten van jonge N2-wormen (dag 2). Banen 2 en 3: Insolublome van twee biologische replicatie-experimenten van oude N2-wormen (dag 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Eiwitkandidaten geïdentificeerd als significante verandering in het oude versus jonge insolubloom en hun vouwveranderingsverdelingen. (A) Vulkaanplot voor kwantificering van de insolubloom van oude versus jonge N2-Bristol-wormen. Kandidaten met een absolute vouwverandering >=1,5 en Q-waarde <0,01 worden weergegeven als rode stippen. (B) Histogramplot voor vouwveranderingsverdeling van significant verrijkte SDS-onoplosbare eiwitten in oude versus jonge wormmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. KEGG-route en analyse van genontologie (GO). (A) KEGG-routeanalyse van de dag-10 insolublome, gerangschikt volgens p-waarde met een zeer significante route bovenaan weergegeven. (B) Genontologie-analyse toont aan dat insolubloom van oude wormen verrijkt is voor veel eiwitten in bepaalde categorieën, waaronder mitochondriale, ontwikkelings-, determinanten van de volwassen levensduur en ribosomale eiwitten. De spreidingsdiagramweergave visualiseert de GO-termen in een "semantische ruimte" waar de meer vergelijkbare termen dichter bij elkaar zijn geplaatst. De kleur van de bel weerspiegelt de p-waarde die is verkregen in de STRING-analyse, terwijl de grootte de algemeenheid van de GO-term in de UniProt-GOA-database weerspiegelt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Overlap van insolubloom-eiwit geïdentificeerd in insolloom op dag 10, waarbij deze studie werd vergeleken met (A) David et ^al.2 en (B) Mark et ^al.11 studies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1 (gerelateerd aan figuur 4 en figuur 5). (A) Genontologie (biologisch proces) geanalyseerd met STRING-database. (B) Gedetailleerde lijst van eiwitten en KEGG-routes die in deze studie zijn geïdentificeerd met kleurcodes die hun overlap met het gepubliceerde werk weergeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In dit protocol rapporteren we een verbeterde monstervoorbereidingsmethode voor de extractie van onoplosbare eiwitten uit C. elegans. Door de traditionele wormlysis (bijv. sondesonicatie of kralenkloppertechnieken) te vervangen door de efficiënte sonicator, verhoogden we de opbrengst van de onoplosbare eiwitextractie en verminderden we het aantal wormen dat nodig was voor labelvrije MS-analyse van 40.000 wormen naar 3.000 wormen. Een database-zoekmachine werd gebruikt voor eiwitidentificatie op basis van DDA-gegevens en de spectrale bibliotheek van C. elegans werd gebouwd met behulp van de 'DIA Quantitative Analysis Software' en de bijbehorende zoekresultaten van de DDA-database (het importeren van FDR-bestandsrapporten die door de database-zoekmachine zijn gegenereerd). Relatieve kwantificering van oude en jonge C. elegans insolublome-gegevens werd uitgevoerd met behulp van de 'DIA Quantitative Analysis Software' om de nieuwe DIA-dataset en de gegenereerde spectrale bibliotheek te verwerken.

Verschillende stappen zijn van cruciaal belang in het protocol. De korte levensduur van C. elegans maakt het een ideaal systeem om veroudering te bestuderen, vergeleken met andere eukaryoten zoals zoogdiercellen, maar het is van cruciaal belang om een homogene populatie wormen te isoleren bij het bestuderen van verouderingsgerelateerde fenomenen. FUDR werd in dit protocol gebruikt om gesynchroniseerde verouderingswormen te verkrijgen. Het is belangrijk om wormen vroeg in hun L4-stadium over te brengen naar de NGM-gezaaide plaat die FUDR bevat om de effectiviteit ervan te garanderen. Tijdens de wormlysis met behulp van de efficiënte sonicator moet de temperatuur van het waterbad worden ingesteld op 4 °C en de sonicatie op 30 s AAN en 30 s UIT om oververhitting van de monsters te voorkomen. Na de eerste sonicatieronde gedurende 10 cycli (10 min) is het belangrijk om onder de microscoop te controleren of alle wormen efficiënt zijn gelyseerd. Zo niet, dan zijn er meer cycli van sonicatie nodig. Tijdens het proces van in-gel digestie moet elke plak gel in stukjes van de juiste grootte (<1 mm²) worden gesneden - als ze te klein zijn, kunnen ze verloren gaan tijdens het monstervoorbereidingsproces, en als ze te groot zijn, kan de spijsvertering ontoereikend zijn.

De behoefte aan veel minder uitgangsmateriaal vermindert aanzienlijk het moeizame werk dat gepaard gaat met wormenkweek om monsters te verkrijgen voor insoluboloomanalyses. De extractie en isolatie van de 1% SDS-onoplosbare eiwitfractie omvat echter meerdere wasstappen en een zorgvuldige behandeling van het monster is vereist om monsterverlies te voorkomen en reproduceerbare resultaten te garanderen. De hoeveelheid materiaal die wordt gegenereerd voor MS-analyse is voldoende voor ~3 injecties voor daaropvolgende DDA- en DIA-analyse, maar niet om te bewaren voor toekomstige experimenten. Bovendien hebben we, ondanks de mogelijk verstorende effecten¹⁵, de laagst mogelijke concentratie FUdR gebruikt om wormen te steriliseren tijdens het verouderingsproces. Toekomstige studies kunnen het gebruik van FUdR omzeilen door steriele mutanten te gebruiken of door handmatig wormen over te brengen en te verzamelen.

Het gebruik van de zeer efficiënte sonicator voor wormlysis maakt een efficiënte extractie van het insolubloom mogelijk, waardoor een goede eiwitdekking en kosteneffectieve labelvrije DIA MS-analyse mogelijk zijn om het insolubloom te kwantificeren met behulp van een sterk verminderd aantal wormen. Het vermindert de werklast aanzienlijk, waardoor er per experiment op meer voorwaarden kan worden gescreend. Bovendien is de labelvrije MS DIA-workflow kosteneffectief en biedt het eiwitdiepte en -dekking op vergelijkbare niveaus als etiketteringsmethoden, waaronder iTRAQ, TMT of SILAC. Het C. elegans-model is een snel screeningssysteem voor verouderingsonderzoek. De workflow kan eenvoudig worden aangepast en toegepast om veroudering en leeftijdsgebonden ziekteonderzoek in dit en andere organismen te bestuderen. In lopende studies passen we deze workflow bijvoorbeeld toe om eiwitprofielen van insolublome en proteostase te onderzoeken in verschillende C. elegans-modellen voor de ziekte van Alzheimer (AD), waaronder Abeta-, tau- en dubbele Abeta/tau-wormen met of zonder verschillende geneesmiddelinterventies voor toekomstige high-throughput geneesmiddelenscreening.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Strains gebruikt
Esherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (Bristol)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Buffer/Oplossing
NGM (Nematode Growth Media)			Recept: 3 g/L NaCl, 23 g/L agar; 2.5 g/L peptone; 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4
S-basisoplossing			Recept: 5.85 g/L NaCl, 1g/L K2HPO4, 6 g/L KH2PO4, H2O tot 1 L
Natriumhypochloriet bleekoplossing			Recept: Meng 0,5 mL 5 N NaOH met 1 ml natriumhypochloriet (5%) en breng volume tot 5 mL met H20.
Materiaal/ Uitrusting
Agar	Difco Granulated Agar, BD Biosciences	90000-782
Bioruptor Plus sonicatie apparaat	Diagenode, USA	B01020001
Cholesterol	Sigma	c8503
2'-deoxy-5-fluorouridine	VWR	TCD2235
Glycerol	Millipore Sigma	356350-1000ML
LB bouillon, Miller	Millipore Sigma	60801-450
Natriumdodecylsulfaat (SDS?	Sigma	L4509-250G
Natriumchloride	Sigma	59888
M880 Ultrasoon bad, 117 V, houdt 5,5 gallons	VWR, USA	89375-458
Magnesiumsulfaat	Sigma	M506
Magnesiumchloride	Sigma	208337
NGM agarplaat	VWR wegwerpbare petrischalen	25384-342
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE eiwitgels, 4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
Protease remmercocktail (PIC)	Roche	11836170001
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Natriumhypochloriet 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S12000
MS Sectie
Acetonitril, Burdick en Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 kolom	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Ammoniumbicarbonaat	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	9830 (1 kg)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland	T1317-1EA
Formaldehyde	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Indexed retentietijd (iRT) normalisatie peptide standaard	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Zwitserland	Ki-3002-2
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
Methanol, HPLC graad	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	34885
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (pre-kolom chip) (200 um x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 300 A)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 um bij 15cm, C18-CL, 3 um, 120 A (analytische kolom chip)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001
Orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOP 6600 massaspectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Per quote
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Sequencing-grade gelyofiliseerd trypsine	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Zwitserland	Sw-3001
SWATH 2.0 plugin naar PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC systeem	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	Model # 845
Water, Burdick en Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	600-30-76
Waters 1525 binaire HPLC pomp systeem	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878