Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Samenvatting

Dit protocol beschrijft benaderingen voor detectie en kwantificering van grote geaggregeerde en/of organelle extrusies (~4 μm) geproduceerd door C. elegans cellen in de vorm van membraangebonden exofofen. We beschrijven stammen, groeiomstandigheden, scorecriteria, timing en microscopie overwegingen die nodig zijn om dissectie van dit puin uitzetting mechanisme te vergemakkelijken.

Samenvatting

Toxiciteit van verkeerd gevouwen eiwitten en mitochondriale disfunctie zijn cruciale factoren die de leeftijd geassocieerde functionele neuronale achteruitgang en neurodegeneratieve ziekte tussen soorten bevorderen. Hoewel deze neurotoxische uitdagingen al lang worden beschouwd als cel-intrinsiek, ondersteunt aanzienlijk bewijs nu dat verkeerd gevouwen menselijke ziekte-eiwitten afkomstig uit één neuron kunnen verschijnen in naburige cellen, een fenomeen dat wordt voorgesteld om pathologie te bevorderen die zich verspreidt bij menselijke neurodegeneratieve ziekte.

C. elegans volwassen neuronen die aggregerende eiwitten uitdrukken, kunnen grote (~4 μm) met mem be omgeven vesicles extruderen die het geaggregeerde eiwit, mitochondriën en lysoosoom kunnen omvatten. Deze grote akels worden "exophers" genoemd en onderscheiden zich van exosomen (die ongeveer 100x kleiner zijn en verschillende biogenese hebben). Het weggooien van cellulair puin in exophers kan optreden door een bewaard mechanisme dat een fundamenteel, maar voorheen niet-herkende, tak van neuronale proteostase en mitochondriale kwaliteitscontrole vormt, relevant voor processen waarbij aggregaten zich verspreiden in menselijke neurodegeneratieve ziekten.

Terwijl exophers zijn meestal bestudeerd bij dieren die hoge kopie transgene mCherry uitdrukken binnen aanraking neuronen, deze protocollen zijn even nuttig in de studie van exophergenesis met behulp van fluorescerende getagde organellen of andere eiwitten van belang in verschillende klassen van neuronen.

Hier beschreven zijn de fysieke kenmerken van C. elegans exophers, strategieën voor hun detectie, identificatiecriteria, optimale timing voor kwantificering, en dierlijke groei protocollen die controle voor spanningen die kunnen moduleren exopher productieniveaus. Samen moeten details van de hier beschreven protocollen dienen om een standaard vast te stellen voor kwantitatieve analyse van exophers in laboratoria. Dit document beoogt als middel in het gebied voor laboratoria te dienen die moleculaire mechanismen proberen uit te werken waardoor exophers worden geproduceerd en waarmee exophers worden gereageerd door naburige en verre cellen.

Inleiding

De neurotoxische uitdagingen van aggregaten en disfunctionele mitochondriën worden al lang beschouwd als celon intrinsiek, maar meer recentelijk is duidelijk geworden dat verkeerd gevouwen menselijke ziekte-eiwitten afkomstig van één neuron zich ook kunnen verspreiden naar naburige cellen, waardoor pathologie¹wordt bevorderd. Ook zoogdier mitochondriën kan worden verzonden uit de cel van hun oorspronkelijke productie voor transcellulaire afbraak² of voor de redding van mitochondriale populaties in uitgedaagd naburige cellen³. Vesicles van verschillende grootte zijn over het algemeen waargenomen om cellulaire materialen over te dragen aan naburige cellen of naar vloeibare omgeving⁴. Sommige geëxtrudeerde akeltjes benaderen de grootte van de gemiddelde neuronale soma (gemiddelde touch neuron soma ~ 6 μm) en is geschikt voor grote aggregaten en organellen.

Een treffend voorbeeld van grote vesicle extrusie die eiwitaggregaten en organellen kan dragen komt voor in C. elegans touch receptor neuronen die een hoog kopieernummer verslaggever construeren codering een schadelijke aggregatie-gevoelige, degradatie-resistente mCherry⁵. Extrusies van de aanraakneuronen, exophers genaamd, zijn ~4 μm gemiddelde diameter, selectief omvatten mCherry of andere aggregaten, en worden rechtstreeks geleverd in de naburige hypodermis, die normaal gesproken omringt de touch receptor neuronen. De hypodermis probeert lyssome-gebaseerde afbraak, maar sommige niet-verteerbare inhoud zoals mCherry aggregaten kunnen opnieuw worden geëxtrudeerd door de hypodermis in de vloeistof gevulde pseudokoelom van het dier, waaruit de mCherry kan worden opgenomen door afgelegen aaseters cellen genaamd coelomocyten voor langdurige opslag (Figuur 1, Figuur 2)⁵.

De grote geëxtrudeerde exopher vesicles verlaten de cel omringd door touch receptor plasmamembraan en kunnen geaggregeerde menselijke ziekte-eiwitten, mitochondriën en lysosomen bevatten. Het proces van exopher productie lijkt te betrekken sorteren van potentieel giftige soorten (bijvoorbeeld een aggregatie-gevoelige uitgedrukte mCherry is gescheiden van oplosbare, onoffensieve eiwitten zoals GFP die meestal in de neuronale soma blijft). Op deze manier wordt gerichte uitzetting van de bedreigende entiteiten bereikt door het neuron^5. Een proteostase uitdaging, zoals stress veroorzaakt door autofagie knockdown, MG132-gemedieerde proteasome remming, of transgene expressie van menselijke ziekte eiwitten zoals de ziekte van Huntington-geassocieerde uitgebreide polyglutamine Q128 of de ziekte van Alzheimer-betrokken fragment Aβ_1-42, kan het aantal neuronen die exophers⁵produceren verhogen.

Zoals exophers zijn pas onlangs gedocumenteerd, wat bekend is van hun biologie verdiensten beschrijving. Exophers werden ontdekt in, en zijn de meest goed bestudeerd in, C. elegans touch receptor neuronen. Er zijn zes C. elegans mechanosensorische touch neuronen die cellichamen verspreid over het lichaam(Figuur 3A)en worden genoemd microtubuli cellen, omdat hun ultrastructuur beschikt over onderscheidende 15 protofilament microtubuli. De touch receptor neuronen zijn de voorste AVM (voorste ventrale microtubule neuron), ALMR, en ALML (voorste laterale microtubuli neuronen rechts en links), de meer centrale PVM (achterste ventrale microtubule neuron), en het achterste PLMR en PLML (achterste laterale microtubuli neuronen rechts en links) in de staart. Interessant is dat de zes touch receptor neuronen produceren exophers in verschillende snelheden, ondanks het uitdrukken van dezelfde offensieve transgene (Figuur 3C). Van de zes mechanosensorische touch receptor neuronen, de ALMR neuron ondergaat exophergenesis vaker dan de andere touch neuronen. Kwantificering van exopher nummers van touch neuronen wordt dus meestal vastgesteld door zich te concentreren op de ALMR.

Exophergenesis is een dynamisch proces dat meestal begint met zwelling van het neuronale cytoplasma(figuur 1A-B). Cellulaire inhoud, organellen of eiwit aggregaten worden verzameld aan de ene kant van de neuronale soma, meestal in de richting van het achterste uiteinde van de ALMR neuron (uit de buurt van de projecterende neurite), de vorming van een pre-exopher domein (PED) (Figuur 1B). Het vroege uitsteeksel wordt waargenomen als de PED naar buiten begint te projecteren, waardoor een herkenbare uitstekende knop ontstaat. De late knop wordt gedefinieerd wanneer de breedste diameter van het pre-exopher domein ongeveer 1/3 groter is dan de diameter van de vernauwing van de soma-exopher hals(figuur 1C). Exophers kunnen worden uitgeworpen in bijna elke richting van de soma, maar de meeste exophers verlaten posteriorly uit het cellichaam en blijven in ongeveer hetzelfde brandpuntsvlak als de oorsprong soma.

De exopher kan zich van de oorspronge soma bewegen aangezien de hals van de knop in een dunne gloeidraad vernauwt. Exophers kunnen via deze gloeidraad aan de soma blijven vastzitten(figuur 1D, pijl)en kunnen later losraken. Cellulaire inhoud zoals calcium, aggregaten en mitochondriën kan via deze gloeidraad worden overgebracht naar de bijgevoegde exopher^5,hoewel het grootste deel van geëxtrudeerd materiaal in het exophercompartiment wordt geplaatst door de massale ontluikende gebeurtenis. Exophers worden als volwassen beschouwd wanneer er geen zichtbare verbindingsbuis of dunne gloeidraad is en de exopher volledig gescheiden is van de verzendende soma(figuur 1E).

Exophers geproduceerd door C. elegans aanraken neuronen onmiddellijk tegenkomen de hypodermis, het weefsel dat de aanraking neuron omringt. Meestal lijkt de exopher vesicle te reizen binnen de hypodermis naar achteren naar de staart, en kan vrij ver van de soma voordat exopher inhoud lijken gericht op afbraak (bijvoorbeeld, de afstand kan ~ 100 μm uit de buurt van de soma (Figuur 1F)). De fluorescerende blaasje breekt in veel kleinere blaasjes binnen de hypodermis, het nemen van een verschijning aangeduid als "sterrennacht" (Figuur 1G en figuur 2). In de "sterrenhemel nacht" stadium, punctate fluorescerend materiaal kan worden waargenomen verspreid over de hypodermale syncytium in vele kleinere punten van fluorescentie in vergelijking met de oorspronkelijke eenzame exopher. Starry nacht kan kijken punctate onder lage vergroting en met een hogere vergroting, kan kijken punctate en / of netwerk in de hypodermis. Het fluorescerende signaal van de sterrennacht is meestal dimmer dan de exopher en de neuronaal uitgedrukte fluorescentie(figuur 2B-C). De verspreiding van mCherry in vele punctate vikjes wordt verondersteld om fagogsome rijping en fusie met het endosomale/lysosomale netwerk van de hypodermale cel te impliceren. Sommige exopher materialen zijn waarschijnlijk afgebroken in het hypodermale lysosomale netwerk, maar restsoorten die bestand zijn tegen afbraak (zoals mCherry aggregaten) worden uit de hypodermis gegooid in het pseudocoelom, een vloeistofcompartiment dat cellulair puin kan bevatten. Het fluorescerende materiaal wordt later ingenomen door afgelegen aaseters cellen genaamd coelomocyten (Figuur 2C), die zich kunnen concentreren, opslaan, en opnieuw poging degradatie van mCherry.

Het fenomeen van geaggregeerde extrusie en overdracht lijkt bewaard over phyla, die is gemeld in genetische modellen zoals C. elegans^5,,6,7 en D. melanogaster^{8,9 en} in meerdere zoogdiermodellen. Exopher-achtige extrusies zijn gemeld voor zoogdiercellen¹⁰, een observatie die suggereert dat geconserveerde mechanismen kunnen liggen bij geaggregeerde en organelle uitzetting. Exopher productie kan dus een bewaard mechanisme van cellulair puin beheer dat een fundamentele, maar voorheen niet-erkende, tak van neuronale proteostase en mitochondriale kwaliteitscontrole vormt, die, wanneer onevenwichtig, actief zou kunnen bijdragen aan neurodegeneratieve ziekte. Identificatie van de moleculen die betrokken zijn bij puin discriminatie en sorteren, vervoer naar een duidelijke subcellulaire locale, extrusie, vorming / splitsing van de buisvormige verbinding die de soma en late exopher, en erkenning van de grote geëxtrudeerde blaasje voor afbraak op afstand door een naburige cel blijven voor toekomstige werkzaamheden. Studies in nematode- en vliegmodellen zullen van cruciaal belang zijn voor het definiëren van mechanismen van verzameling en overdracht van geaggregeerde organen en organellen, waarbij gebruik wordt gemaakt van onbevooroordeelde genetische benaderingen en krachtige celbiologische instrumenten die door deze modellen worden aangeboden om deelnemende moleculen in fysiologische context te identificeren.

Kritische eerste stappen in het ontcijferen van mechanismen die werkzaam zijn in de exopherbiologie omvatten het definiëren van protocollen voor reproduceerbare in vivo exopher kwantificering. De C. elegans model biedt een bijzonder voordeel voor dergelijke inspanningen, omdat het lichaam transparant is en exophers gemakkelijk kunnen worden waargenomen wanneer ze fluorescerend gelabelde eiwitten of organellen bevatten. Exophers zijn gemeld te worden gegenereerd door C. elegans dopaminerge neuronen PDE en CEP, ASE en ASER sensorische neuronen, en kleurstof-vullende amphid neuronen⁵. Omdat exophers geproduceerd door touch receptor neuronen zijn het best gekarakteriseerd, de focus hier ligt op het gebruik van touch neuronen voor exopher analyse. De basisbenadering kan echter worden toegepast om de exopherproductie vanuit elke cel te meten. Protocollen voor het detecteren en kwantificeren van exophers geproduceerd door C. elegans touch receptor neuronen die transgenisch uitdrukken mCherry eiwit worden geschetst, met een nadruk op ladingen die kunnen worden gecontroleerd en temporele beperkingen in scoren. Dit artikel definieert benaderingen in de richting van in vivo exopher identificatie, en de kwantificering van milieu-en genetische voorwaarden die exopher productie moduleren. Protocollen benadrukken kritische aandacht voor constante niet-stressomstandigheden voor de bepaling van de productie van basisexopher en voor vergelijkingen tussen genotypen.

Protocol

1. Stammen die nuttig zijn voor exopher detectie

1. Selecteer een stam die fluorescerende ladingen uitdrukt in de neuronen van C. elegans om exophers gemakkelijk te visualiseren.
   OPMERKING: Tabel 1 bevat stammen die zijn gebruikt om exophers te visualiseren die zijn geproduceerd in aanraakreceptorneuronen^5,11,12. In principe kan elk cel- of neuronale type worden getest op exopherproductie met behulp van een cel- of weefselspecifieke promotor om expressie van een fluorescerend eiwit aan te jagen dat aggregaten of anderszins is geselecteerd voor extrusie.
2. U ook een kleurstofvullende test gebruiken om exophers in de amphid-hoofdneuronen te visualiseren, die open staan voor het milieu en vatbaar zijn voor het bijvullen van^5,13.

2. Groeimedia

1. Bereid standaard nematode groeimedia (NGM) voor op cultuurstammen volgens standaardmethoden^14,15.
   OPMERKING: Gebrek aan voedsel, of fluor-deoxyuridine (FuDR), vaak gebruikt om de productie van nakomelingen te blokkeren, en kan de exopherproductie drastisch beïnvloeden. Houd de bevolking continu gevoed (vermijd zelfs korte perioden van bacteriële uitputting van het voedsel) en houd dieren op een constante temperatuur.

3. Veeteelt cruciaal voor consistente exopher productie

1. Voed dieren op consistente media en met consistente bacteriële voedselbronnen. Dieren mogen niet zonder bacteriële voeding komen te zitten, zelfs niet voor korte tijd, omdat voedselbeperking de exopherproductie drastisch kan veranderen.
2. Houd mediarecepten en voorbereidingsuniform gedurende een studie.
   OPMERKING: Veranderende media kunnen van invloed zijn op basale niveaus van exopher productie. Agar batches kunnen invloed hebben op baseline exopher niveaus, dus wanneer het aanbod partijen veranderen, maak een notitie van de datum. Gooi voorraad platen na twee weken om gezonde bacteriële voeding te garanderen en om gedroogde agar, die veranderingen in agar osmolarity die exopher niveaus beïnvloeden veroorzaken.
3. Houd dieren bij een constante temperatuur van 20 °C bij basale omstandigheden. Het fokken van dieren bij variabele temperaturen (zelfs tijdelijke temperatuurveranderingen) kan leiden tot variaties in de timing van maximale exopherproductie.
   LET OP: Temperatuurvariabiliteit is niet beperkt tot cultuuromstandigheden. Temperatuurvariaties tijdens experimenten of op de labbank kunnen impactvol zijn. De temperaturen in een microscoopkamer mogen bijvoorbeeld niet sterk verschillen van de kweekincubator of labbank.
4. Gebruik geen farmacologische antivruchtbaarheidsinterventies omdat bevruchte eieren van cruciaal belang zijn voor de vroege volwassen productie van exophers.
   OPMERKING: Het gebruik van Fluoro-deoxyuridine (FuDR)¹⁶ of C22¹⁷moet worden vermeden. Bij het uitvoeren van levensloop of oude dierproeven, leeftijd-gesynchroniseerde populaties moeten worden gehandhaafd door fysiek verwijderen van volwassenen uit hun kleinere nageslacht door ze te plukken op verse platen verspreid met bacteriën in plaats van het gebruik van gemeenschappelijke farmacologische anti-vruchtbaarheid interventies.
5. Gebruik geen verontreinigde culturen; experimenten opnieuw in te voeren in het geval van biologisch compromis van de populatie of de plaat. Bacteriële of schimmelverontreiniging kan spanningen en metabolische veranderingen bij dieren veroorzaken en moet afwezig zijn bij experimentele populaties.
   1. Om reproduceerbare resultaten te maximaliseren, moet u culturen onderhouden voor ten minste twee gezonde, goed gevoede, contaminatievrije generaties bij 20 °C voordat u experimenteert om potentiële door het milieu veroorzaakte epigenetische veranderingen te voorkomen.

4. Leeftijdssynchronisatie voor exopher scoren door bleken, sacharose flotatie, of L4 larven plukken

1. Houd experimentele populaties dezelfde biologische leeftijd, omdat exopher detectiepatronen variëren met de leeftijd van volwassenen en vergelijking van dieren van gemengde leeftijdsgroepen resultaten kan verstoren. Zorg altijd voor een succesvolle synchronisatie van experimentele dierenpopulaties door te controleren op de "witte halve maan" vulva morfologie in het L4-stadium.
   OPMERKING: Over het algemeen, piek exopher productie voor C. elegans mechanosensorische ALMR neuronen vindt plaats op volwassen dag 2-3 (Figuur 3D), zoals gemeten vanaf dagen na L4 stadium. Volwassen dag 1 is 24 uur na de L4 larven stadium dat zich onderscheidt door "witte halve maan" vulva morfologie (Figuur 5E).
2. Bereid gesynchroniseerde eipopulaties door het bleken van gravid volwassenen.
   1. Verzamel gravid volwassenen gevuld met eieren door het wassen van dieren groeien op een NGM plaat. Om te wassen, overspoelen de plaat met 1 mL M9 buffer, pipet op en neer om vloeistof te verzamelen met zwevende dieren en pipet in een 1,5 mL microcentrifuge buis. Pelletdieren door gravitationele bezinking of zachte centrifugatie met een minicentrifuge en verwijder de supernatant.
   2. Voeg 150 μL 5M NaOH en 150 μL van 6% natriumhypochloriet (bleekmiddel) toe in 1 mL in H₂O en meng door inversie gedurende ongeveer 5 minuten.
      OPMERKING: Verse bleekoplossing zorgt ervoor dat de dierlijke nagelriem kan worden verstoord voor de eieroogst. De voortgang bij het verstoren van de nagelriem kan worden gevolgd onder een ontledenmicroscoop; volwassenen moeten breken en laat eieren op het punt dat bleken moet worden gestopt.
   3. Voorzichtig centrifuge met een minicentrifuge buis voor 20 s en verwijder de supernatant. Voeg 1 mL M9 buffer en centrifuge weer toe, waardoor er ongeveer 100 μL bovenop de pellet komt.
   4. Herhaal stap 4.2.3 twee maal om sporen van bleekmiddeloplossing te verwijderen.
   5. Resuspend de eieren in het resterende volume en breng over op een vers gezaaide NGM-plaat. Volwassenen zullen worden lysed, maar veel levensvatbare eieren moeten worden in de voorbereiding.
3. Bereid gesynchroniseerde populaties voor door getimede eierleggen.
   1. Kies 20 aangetrokken volwassenen op een gezaaide NGM-plaat met behulp van standaard overdracht protocollen¹⁴.
   2. Laat dieren vrij kruipen en eieren leggen voor 1,5 uur (gemuteerde stammen met een lage broedmaten kunnen de introductie van meer volwassen dieren vereisen).
   3. Verwijder alle volwassen dieren van de plaat door te plukken, waardoor de gesynchroniseerde eipopulatie achterblijft. Controleer platen een paar uur later om te controleren of er geen levensvatbare volwassenen zijn gemist tijdens de verwijdering van volwassenen.
4. Bereid gesynchroniseerde eipopulaties door sacharose flotatie selectie van eieren.
   1. Verzamel dieren en eieren van vijf NGM-platen waarop de aangetrokken dieren ten minste 24 uur eieren leggen door platen met M9-oplossing met 0,1% wasmiddel (zoals Tween 20 of Triton X-100) te overspoelen en in een buis van 15 mL te verzamelen. Pelletvolwassenen door zachte centrifugatie bij kamertemperatuur (2.000 x g voor 30 s).
   2. Verwijder supernatant en was dieren in 15 mL verse M9 drie keer, het weggooien van de supernatant na elke wasbeurt, zeker om de pellet verrijkt in dieren en eieren te houden.
   3. Bewaar 2 mL supernatant en resuspend de pellet. Voeg 2 mL van 60% volume gewicht sucrose.
   4. Centrifuge op 2000 x g gedurende 5 minuten. De oplossing zal nu een bovenste fase sterk verrijkt in eieren.
   5. Breng ongeveer 2,5 mL van de bovenste fase over naar een nieuwe 15 mL-buis en voeg 10 mL M9 toe.
   6. Meng door inversie gedurende 1 min, en dan centrifuge 2000 x g gedurende 1 min.
   7. Verwijder de supernatant en was de met eieren verrijkte pellet in M9. 10-15 μL van de eipellet kan worden verdeeld over een verse OP50-gezaaide NGM-plaat.
      OPMERKING: Deze methode bereidt een groot aantal eieren; niet toestaan dat verzamelde dieren opraken van OP50 E. coli voedsel.
5. Bereid gesynchroniseerde populaties voor door dieren te plukken in het L4-ontwikkelingsstadium.
   1. Kweek dieren op gezaaide NGM-platen zoals hierboven beschreven.
      LET OP: C. elegans ontwikkelen zich in vier discrete stadia. Bij 20 °C duurt het ongeveer 9 uur om een nieuw gelegd ei uit te komen(figuur 5A). Na het luik gaat een dier door larval stadium 1 (L1) naar larval stadium 4 (L4), waarbij elke fase 8-12 uur duurt tussen elke molt (figuur 5A-F). Daarom moet een bord bereid door het inenten met eieren hebben veel L4 dieren te plukken ongeveer 40 uur na eieren worden geïntroduceerd.
   2. Identificeer L4-geënsceneerde dieren door het lokaliseren van de witte halve maan halve maan vorm van de zich ontwikkelende vulva (Figuur 5E).
      OPMERKING: Dieren in het L4-stadium zijn uniform in grootte en in lichaamspigmentatie. Kies dieren met de witte halve maan tot een verse groeiplaat voor onderzoek van geënsceneerde dieren. De volgende dag (~ 24 uur later) moet worden geteld als volwassen dag 1.
   3. Scoor dagelijks een populatie dieren op volwassen dag 2.
      OPMERKING: Exophers worden meestal gescoord op dag 2 van de volwassenheid, dat is de piek exopher productie onder basale omstandigheden. Echter, omdat de exophergenesis piek en timing kan worden verschoven door milieu-of genetische veranderingen die worden bestudeerd, is het raadzaam om een populatie van volwassen dieren dagelijks score over vier dagen om de meest uitgebreide beeld(Figuur 3D).

5. Detectie van exophers met behulp van een fluorescerende microscoop

1. Observeer exophers met behulp van een hoge vergroting pseudo-stereo ontleden microscoop die is uitgerust voor fluorescentie microscopie.
2. Immobiliseer dieren op NGM-platen door 100-200 μL van 10-100 mM levamisole/tetramisole oplossing op het NGM agarplaatoppervlak te pipetten. Na 2-4 minuten raken de dieren verlamd en kunnen ze direct op de agarplaat worden waargenomen.
   OPMERKING: Immobilisatiebehandelingen zijn niet absoluut vereist, zodanig dat met een getraind oog, neuronale identificatie en exopher aanwezigheid kan worden gescoord door kruipende dieren visueel te volgen onder de microscoop op de plaat bij het bepalen of een exopher is geproduceerd.
3. Observeer fluorescerende neuronen met behulp van een totale vergroting van 100x te bereiken ontleden microscoop detectie van exophers.
   OPMERKING: Het scoren van exopher gebeurtenissen met behulp van dissectie microscopie zorgt voor de observatie van grote aantallen dieren met relatief gemak direct op de agar platen waarop ze worden gefokt.
4. Live imaging en montage reporter stammen voor exopher studies met behulp van confocale microscopie
   1. Gebruik een confocale microscoop om intracellulaire dynamiek en kenmerken van exofergenese live-beeld.
      OPMERKING: Live imaging is een voordelige benadering voor het observeren van subtiele details van exopher productie, omdat exopher productie is een dynamisch proces.
   2. Beperk de verplaatsing van dieren voor levende beeldvorming met hoge resolutie met behulp van handige methoden, waaronder het gebruik van levamisole of tetramisole bij 10-100 mM of de toepassing van hydrogel polystyreenmicrobeads (met diameters van 15 μm, 30 μm of 40 μm)¹⁸.
5. Diavoorbereiding voor samengestelde en confocale microscopie
   1. Monteer 20-50 dieren in een immobiliserend middel op een microscoopplaat. Herbruikbare geringde cytologieplaten met 13 mm verhoogde ringen met een diameter van 13 mm zijn handig voor montage.
   2. Kies levende dieren in 5-20 μL van een verlammende zoals 10-100 mM levamisole of tetramisole binnen de geschilderde cirkel of op het agarpad.
   3. Wacht 4 minuten op verlamming en bedek de glijbaan met een coverslip (aanraden nr. 11/2 (0,16 – 0,19 mm) of nr. 2 (0,17 - 0,25 mm).
6. Montage van kleine aantallen dieren
   1. Verpletter gemonteerde dieren niet; bij het observeren van slechts enkele (minder dan 20) dieren per glijbaan bestaat het risico dat sommige dieren worden verpletterd als gevolg van ongelijke druk van de coverslip. Dit risico kan worden geminimaliseerd door het gebruik van een laag percentage agarose pad voor montage.
   2. Maak een 2-4% agarose pad dia, en voeg vervolgens 2-15 μL van de analytische oplossing aan de pad. Houd in gedachten levamisole en tetramisole diffuus in het pad, het verminderen van hun effectieve concentratie.
   3. Monteer door dieren te plukken in een 2-15 μL druppel van verlammende oplossing of microbeads rustend op de agar pad. Leg de hoezen lip erop en controleer of de dieren intact zijn¹⁸.
7. Agar pad voorbereiding
   1. Om 2% agar pads voor te bereiden, verwarm 2% agarose in M9 oplossing en magnetron totdat de agarose is in een homogene en gesmolten staat.
   2. Om een agar pad van voldoende kwaliteit te bereiken, afwisselend mengen en microwaving op een laag vermogen voor minder dan 20 seconden. Vermijd de opname van luchtbellen in het pad door het plaatsen van kokende agar op een verwarmingsblok en waardoor de bellen te stijgen naar het oppervlak.
   3. Gebruik een Pasteur pipet om agar te trekken uit diep in de gesmolten oplossing onder de gestegen bubbels.
   4. Bereid twee afgeplakte dia's en plaats aan weerszijden van een schone glazen microscoop dia op een vlakke ondergrond. Voor het maken van de afgeplakte dia's plaats twee stroken van 5 cm laboratoriumtape op elke dia(figuur 6A).
   5. Met behulp van een Pasteur pipet, plaats een enkele druppel agar op de schone microscoop dia ingeklemd tussen de afgeplakte dia's (Figuur 6B).
   6. Bedek voorzichtig en snel de druppel gesmolten agar met een vierde schone schuif door over de afgeplakte dia's te plaatsen(figuur 6cc).
      OPMERKING: De schuif moet de gesmolten agar voorzichtig in een afgeplatte cirkel van ongeveer 0,4 mm dik (de dikte van de tape)(figuur 6D)drukken. De agar moet snel afkoelen.
   7. Verwijder de bovenste dia door deze eraf te schuiven (Figuur 6E). Agar pads drogen snel en worden het best binnen enkele minuten gebruikt. Zodra de bovenste dia is verwijderd, gebruik de gel pad onmiddellijk voor de montage van dieren. Vermijd het gebruik van pads met luchtbellen.
   8. Bewaar agarpads tot 30 minuten ingekapseld tussen de twee glazen platen. Gedroogde agar zorgt ervoor dat dieren samenklonteren en uitdroden. Stel dieren op binnen 2-15 μL van paralytische oplossing of microbeads en bedek met coverslip; de dia binnen 20 minuten na verlamming en montage(figuur 6)te screenen.
      OPMERKING: Omdat stressomstandigheden exopher rates kunnen veranderen, vermijd dan verlammende die oxidatieve stress kunnen veroorzaken (bijvoorbeeld natriumaboïde) bij het screenen op exophers.
8. Detectie van exophers met behulp van een spinnen-schijf confocale microscoop
   1. Observeer celbiologische kenmerken zoals organellen en andere inhoud met 1,4 numerieke diafragmadoelstellingen bij 63x en 100x.
   2. Gebruik software die geschikt is voor stage-control en beeldacquisitie met behulp van de multidimensionale acquisitie. Microscopen en beeldverwerkingssoftware moeten ook geschikt zijn voor beeldvorming en het verzamelen van gegevens, aangezien deze stappen standaard beeldvormingsbenaderingen omvatten.

6. Identificeren van aanraakneuronen en scoren voor exofers met gemonteerde dieren

1. Paralyseerd volwassen dier monteren (figuur 6).
2. Identificeer het gewenste Z-vlak. Gebruik een laag vergrotingsveld (10-40x) om het geschikte Z-vlak van het dier te identificeren, rekening houdend met de positionering van het dier, de oriëntatie van de kop-staart en de locatie van de vulva - die oriëntatiepunten zijn voor latere neuronale en exopher-identificatie(figuur 3A & figuur 5E).
3. Focus op het fluorescentiesignaal van de gekozen verslaggever. Verblijf in hetzelfde Z-vliegtuig, overschakelen naar widefield fluorescentie bekijken op 10-40x voor de gekozen cytosolic verslaggever.
   OPMERKING: In dit voorbeeld fluorescerende expressie wordt aangedreven door de mec-4 mechanosensorische touch neuron-specifieke promotor. Hoge kopieerarrays en verschillende fluoroforen hebben variabiliteit in expressie en dus variabele fluorescerende intensiteit. Indien nodig aanpassen.
4. Scroll binnen de Z-as om de diepte van het dier en fluorescerende expressie in het brandpuntsvlak te observeren. Bevestig daarbij de kop-staartoriëntatie; de kop/keelholte zal de fluorescerende zenuwring hebben en in dit geval zal de staart 1-2 zichtbare PLM-somas(figuur 3A)bevatten.
5. Aanraakneuronen identificeren
   1. Bepaal of het dier links of rechts is gemonteerd(figuur 3A).
      OPMERKING: Gezien de 3-dimensionaliteit van het dier, wordt de beste beeldvormingsresolutie bereikt aan de kant die het dichtst bij de optica ligt.
   2. Identificeer de soma (ALM, ALMR, AVM) door te observeren - begin bij het hoofd om de zenuwring en laterale neuronale processen te identificeren.
   3. Bij 10-40x vergroting scroll je langzaam door de Z-as om het bijgevoegde proces te identificeren.
   4. Zodra het proces is geïdentificeerd, volg het lateraal in de achterste richting naar de vulva, waar de soma zal worden duidelijk, gekenmerkt door een ronde cel lichaam aan het einde van het proces. Zodra de meest in-focus neuronale soma is gevonden, kan worden geïdentificeerd met behulp van andere neuronale oriëntatiepunten als volgt:
   5. Gebruik de AVM, een nabijgelegen ventrale neuron, om te helpen bij het toewijzen van dierlijke oriëntatie. Als de AVM neuron is in hetzelfde vlak als de ALM dan is het dier rust op zijn kant en het neuron buiten dat vlak is de ALMR . Als het AVM-neuron zich niet in hetzelfde vlak bevindt als de ALM in kwestie, is het dichtstbijzijnde aanraakneuron bij het brandpuntsvlak ALML.
   6. Identificeer de PVM neuron, een andere ventrale touch neuron gelegen in de buurt van de staart, om aan te geven of de voorste aanraking neuron is in hetzelfde vlak. Als dat zo is, de touch neuron waargenomen is ALML.
   7. Krijg een gevoel van de positie van andere soma lichamen, in de buurt van het gebied van belang (fluorescerende neuronen gelegen aan weerszijden van de soma), en in alle Z-vlakken, zelfs als het niet mogelijk is om het diepste neuron in duidelijke focus.
      OPMERKING: De identificatie van alle touch neuron soma's is belangrijk omdat out-of-focus soma kan worden verward met exophers.

7. Identificeren en scoren voor exophers

1. Zodra een touch neuron is gevonden, inspecteren op grote uitsteeksels (exopher domeinen) groot genoeg om te worden beschouwd als een knop exopher, (het bereiken van ten minste 1/ 5^e de grootte van de oorsprong soma) (Figuur 1C).
   OPMERKING: De gemiddelde exopher meet ongeveer 2-8 μm in diameter, terwijl de gemiddelde soma van een (ZB4065 bzIs166[Pmec-4::mCherry]) dier maatregelen 6-10 μm in dag 2 volwassenen (Figuur 7B).
2. Als er geen knop of exopher domein wordt waargenomen, inspecteer de neuronale soma op een bijgevoegde dunne gloeidraad afkomstig van de soma. Bijgevoegde exophers hebben de neiging om dichter bij de oorsprong soma en in een soortgelijke Z-vlak.
   LET OP: Exophers blijven niet altijd gehecht aan de soma. De detectie van een bijgevoegde gloeidraad is een definitieve indicatie dat het object een exopher is.
3. Om een ongebonden exopher te identificeren, zoek naar de inhoud van een exopher. Exophers kunnen zich concentreren verdreven fluorescerende eiwitten en zijn daarom vaak helderder dan de soma.
   OPMERKING: De inhoud van exophers is heterogeen en variabel. Cellulaire organellen zoals lysosomen en mitochondriën kunnen ook worden geëxtrudeerd binnen exophers (Figuur 4C-E).
4. Zoek naar ongebonden exophers in verschillende brandvlakken dan het vlak waarin de oorsprong soma werd gevonden. Hoewel exophers zijn gezien om uit te steken van de ALM soma in elke richting, is het typisch dat exophers uitsteken uit de buurt van de soma, in een achterste richting van het neuronale proces.
5. Controleer op grote, bolvormige objecten die niet zijn gepositioneerd en geïdentificeerd als neuronale soma's. Exophers kunnen onregelmatig worden gevormd, maar zijn meestal bolvormige structuren. Exophers worden afgebroken na verloop van tijd, dus oudere exophers hebben de neiging om een meer onregelmatige vorm te hebben.
   OPMERKING: Volwassen of oudere exophers onderscheiden zich van het verspreide "sterrennacht"-stadium via de helderdere fluorescentieintensiteit van exophers en hun bolvormige vorm.
6. Onderzoek het "sterrennacht" fenotype als bewijs van eerdere exophergenesis. Exophers vooruitgang “in een "sterrenhemel nacht" stadium als de exopher breekt in kleinere eikjes en de omliggende hypodermis pogingen om de exopher inhoud te degraderen (Figuur 1G, 2B, 3B & 7A).
   OPMERKING: De sterrenhemel nacht stadium wordt gekenmerkt door gefragmenteerde en verspreide (soms genetwerkte) fluorescerende entiteiten die structurele integriteit hebben verloren en toont een schemerige fluorescentie in vergelijking met de aanraking neuronen en exopher structuren.
7. Kijk voor voorbeelden van "meerdere exopher gebeurtenissen". Exophers worden meestal geproduceerd als een enkelvoudige gebeurtenis (1 exopher afkomstig van 1 soma), maar onder sommige omstandigheden meer dan een exopher kan worden vrijgegeven van een enkele soma(Figuur 7D).
   OPMERKING: Volwassen exophers kunnen degraderen tot meerdere vesicles als ze worden afgebroken in de hypodermis. Onderscheid maken of elke exopher is gegenereerd door een onafhankelijke exofergenese gebeurtenis of dat een originele exopher split om een extra blaasje te maken kan alleen worden bepaald door time-lapse observatie.
8. Houd er rekening mee dat niet alle morfologische afwijkingen rijpen tot exophers.
   1. Scoor niet een verzwaard soma als een exopher. Een uitgebreide of puntige soma kan soms worden waargenomen (vooral met leeftijd of onder stress), maar een uitbreiding zonder een duidelijke vernauwingsplaats wordt niet gescoord als een exopher.
   2. Verwerp kleine opgeloste knoppen die niet 1/5^e de grootte van de soma bereiken in exopher event quantification.
   3. Tel niet neurite uitwassen als exophers. Volwassen neurites kunnen zich dramatisch uitbreiden met de leeftijd (meestal in de tegenovergestelde richting van het neuronale proces) en fluorescerend eiwit kan migreren naar het distale uiteinde van dergelijke structuren¹⁹.
      OPMERKING: Deze neurite uitwassen zijn niet exophers als ze een duidelijk ontwikkelingspatroon over dagen en weken, vormen geen knoppen, en niet los te maken(Figuur 7E).
9. Identificeer fluorescerende entiteiten die geen exopher zijn.
   OPMERKING: Het is belangrijk om een idee te krijgen van de achtergrond fluorescentie om een correcte identificatie van de geëxtrudeerde fluorescerende entiteit vs autofluorescentie te garanderen.
   1. Transgene fluorescerende expressie vs autofluorescentie. Vergis je niet autofluorescentie voor transgene expressie. De ware exopher signaal zal niet in de darm of darm (DIC bevestiging kan worden gebruikt om deze weefsels te identificeren) en exopher signaal zal aanzienlijk helderder dan achtergrond autofluorescentie.
      OPMERKING: Autofluorescentie wordt veroorzaakt door darmkorrels met fluorescerende pigmentatie en accumuleert met de leeftijd. Het is heterogeen, vooral zoals bekeken met verschillende golflengten.
   2. Signaal van embryo's. Vergis embryo-signaal niet in exophergenese. Bevestig vermoedens van embryosignaal door over te schakelen van fluorescentie naar brightfield-verlichting en controleer op signaalkoppelingen met eieren in de baarmoeder.
   3. Uit het vliegtuig of in de buurt van soma lichamen. Vermijd het verwarren van een out of plane soma voor een exopher door het identificeren van alle nabijgelegen soma lichamen, zelfs out-of-focus soma's aan het begin van de observatie.
      OPMERKING: Als u scoort voor exophers van ALMR, identificeert en accountt u de locatie van AVM- en ALMR-soma's. Meer details over de identificatie van het soma-lichaam zijn beschreven in figuur 3A.

8. Scoren en statistieken

1. Score exophers als binaire (ja, er is een exopher / nee, er is geen exopher).
2. Beschouw exopher detectie als een "exopher-event" voor een bepaald neuron. Een exopher gebeurtenis kan vormen observatie van een enkele exopher in de buurt van een soma of meerdere exophers.
   OPMERKING: Om aantallen individuele exofergenesis-gebeurtenissen te kwantificeren, gebruikt u time-lapse-observatie.
3. Tel exopher gebeurtenissen per bepaalde geïdentificeerde cel omdat verschillende cellen geen exophers produceren in hetzelfde tempo (zie bijvoorbeeld figuur 3C). ALMR neuronen produceren de meest baseline exophers in de hierin beschreven stammen en dus vaak is dit de cel geselecteerd voor exopher kwantificering van touch receptor neuronen.
4. Voor statistieken, in het algemeen, voeren ten minste 3 biologische proeven, van ten minste 30 dieren gescoord per proef met het overeenkomstige aantal waarnemingen die nodig zijn voor de analyse van de verstoring.
   1. Voor meerdere proeven met één of twee mutanten/behandelingen in vergelijking met controle is de Cochran-Mantel-Haenszel-test geschikt om p-waarden te bepalen.
   2. Voor studies met meer dan twee mutanten van behandelingen in vergelijking met controle, is het ook aangewezen om een binaire logistieke regressieanalyse te gebruiken om de betekenis voor een willekeurig aantal categorische voorspellers te evalueren.

Resultaten

Meerdere tl-verslaggevers kunnen worden gebruikt om exophers te meten. Touch neuron exophers worden gemakkelijk gevisualiseerd in vivo via fluorescerende tagging van eiwitten die kunnen worden geselecteerd voor extrusie, door etikettering van organellen die kunnen worden geëxtrudeerd, of door het taggen van celmembranen. Tabel 1 identificeert touch neuron uitgedrukt fluorescerende verslaggevers die zijn gebruikt om exophers te controleren, met representatieve voorbeelden opgenomen in figuur 4. Ladingen waarvan bekend is dat ze worden geëxtrudeerd in exophers omvatten een fusie van het N-terminale domein van menselijk huntingtine tot uitgebreide polyglutamine (Figuur4B),lysosomen die GFP-tagged met lysosomale geassocieerde membraan (LMP-1) (Figuur 4C), en mitochondria gelabeld met matrix-gelokaliseerde GFP(4D). Cytoplasmatische GFP wordt niet sterk verdreven en wordt bij voorkeur behouden in de soma⁵, hoewel GFP exophers zwak kan visualiseren (figuur 4A). Wanneer GFP is gesmolten tot eiwitten die worden verdreven, kan deze tag worden gebruikt om exophers te visualiseren. Een belangrijk punt is dat door het taggen van verschillende eiwitten een breed scala aan vragen over de uitzetting van specifieke ladingen en organellen, evenals op de eiwitten en membranen die deel uitmaken van exophers, kan worden aangepakt.

Een pseudo-stereomicroscoop setup is een effectief hulpmiddel voor het bekijken van exophers bij dieren op agar platen. Deze setup is een hybride van samengestelde en stereoscopische technologie die hoge numerieke diafragma optica op elke vergroting, pseudo-stereo-technologie (discrete doelstellingen over een stereoscopische basis) en een zoom operationele schakelaar voor het bekijken bij vergrotingen tussenbedoelde tot geïnstalleerde doelstellingen omvat. Een microscoop als deze moet worden uitgerust met 10x oculairs en doelstellingen krachtig genoeg voor het observeren van neuronale morfologie en exopher productie voor high-throughput scoring (2x doelstelling gebruikt voor scannen / plukken, 10x doelstelling gebruikt voor het identificeren en scoren).

Terwijl vergroting mogelijkheden van standaard stereomicroscopen hebben meestal hoog genoeg resolutie om het netwerk van touch neuronen uitdrukken van fluorescerende eiwitten te zien, standaard ontleden microscopen zijn niet voldoende voor het observeren van subcellulaire details van exophers zoals de buisvormige verbindingen van soma te exopher. Dergelijke waarnemingen vereisen confocale microscopie (zie de tabel van materialen voor apparatuur details).

Exopher quantitation studies vereisen strenge controles om experimentele spanningen te elimineren. Het oplettende onderhoud van consistente groeiomstandigheden is vereist voor reproduceerbare exopherproductie. Meer specifiek, exopher productie is stress-responsief zodanig dat consistente voeding, constante temperatuur, en besmetting-vrije groei over generaties zijn van cruciaal belang voor reproduceerbaarheid. Onder basale groeiomstandigheden met een hoge neuronale expressie van mCherry, exopher productie is relatief laag (5-25% van de ALMRs produceren exophers), maar sommige spanningen, waaronder osmotische en oxidatieve stress, kan verhogen exopher tarieven. Terwijl mCherry expressie kan worden gezien als stress, een uitvloeisel van de stress-gevoeligheid van exopher niveaus is dat, indien goed gecontroleerd, experimentele stress introductie kan een strategie om gemakkelijker induceren en observeren exofergenese.

Timing en verwachte exopher productie niveaus. Exophers zijn vrijwel afwezig tijdens de ontwikkeling van larven. De periode van piek exopher productie in jong volwassen leven lijkt zeer beperkt tot tijdens volwassen dagen 1-4, meestal duidelijk op volwassen dag 2 of 3. Omdat de piek kan verschuiven vooruit of terug een beetje, de meest complete evaluatie van een exopher productie profiel is om meerdere proeven dagelijks te scoren over volwassen dagen 1-4. In het algemeen produceert een ALMR één belangrijke exopher, waarbij de blaas ten minste 24 uur voortduurt. De exopher kan vrij snel worden geproduceerd (in de volgorde van minuten op zijn snelst). Meestal wordt slechts één belangrijke exopher geproduceerd per neuron in het vroege volwassen leven, maar de productie van meerdere exophers is mogelijk.

In het algemeen exopher productie door ALMRs uitdrukken mCherry onder basale omstandigheden varieert van 5-25% van de ALMRs onderzocht binnen het optimale tijdsbestek van volwassen dag 2-3 (Figuur 3D). Proteostase crises^{5, evenals}blootstelling aan andere spanningen kan moduleren exopher niveau. Stress of genetische verstoringen kunnen verhogen exopher productie tot detectie tarieven zo hoog als 90% van almr neuronen produceren exopher extrusies.

RNAi op basis van voeding voor het testen van rollen van specifieke genen in exofergenese. De nematode C. elegans wordt vaak onderworpen aan RNAi knock down door het voeden van dieren getransformeerd E. coli stam HT115 die een dubbel gestrande RNA (dsRNA) gericht op een gen van belang²⁰uit te drukken . HT115 bacteriën kunnen worden gebruikt bij het scoren voor exophers in het voeden van RNAi⁵. Terwijl transcripties in de meeste weefsels kan worden gericht door RNAi met behulp van deze techniek, neuronen zijn meer vuurvast. Gevoeligheid voor RNAi kan worden gekalibreerd met behulp van dieren die de transgene dsRNA transporter SID-1 uitdrukken onder een neuron-specifieke promotor. Op deze manier kan neuronaal weefsel worden gesensibiliseerd tot RNAi²¹.

Weefselspecifieke knockdown van een gen van belang kan worden bereikt door een component van endogene RNAi metabolisme uit te drukken binnen een mutant die tekort is aan die component. Bijvoorbeeld: het Argonaute eiwit RDE-1 kan specifiek worden uitgedrukt in de neuronen van rde-1 gemuteerde dieren om een gen dat alleen in neuronen van belang is, te kunnen uitschakelen wanneer dieren worden blootgesteld aan een RNAi-interventie gericht op dat gen.

Met behulp van standaard nematode RNAi protocollen^20,22, blootstelling van de ouders in het L4-stadium aan de RNAi en waardoor hun nakomelingen te ontwikkelen consumeren getransformeerde HT115 bacteriën tot volwassenheid genereert de sterke genetische knock-down, maar wees attent op potentiële ontwikkelingsachterstanden veroorzaakt door RNAi als experimentele dieren kunnen anders groeien dan een lege vector controle. Het is belangrijk om altijd de lege vectorcontrole voor negatieve controlevergelijking op te nemen. HT115 bacteriën kunnen worden gebruikt bij het scoren voor exophers in het voeden van RNAi. Houd er echter rekening mee dat sommige genen effectief zijn bij het veranderen van exofergenese tarieven, zelfs tijdens kortere perioden van RNAi-blootstelling⁵. Als het richten van bepaalde genen leidt tot ontwikkelingsfalen, voorkomen dat dieren worden blootgesteld aan levenslange knockdown, kunnen dieren gewoon worden geplukt in het L4-stadium op RNAi-platen voor blootstelling van L4 aan volwassen D2 of D3.

Stamnaam	Genotype	Beschrijving	Exopher percentage	Verwijzing
SK4005	zdIs5[Pmec-4GFP]	Cytosolische expressie van GFP in touch neuronen.	1-8% ALM	Figuur 4A, Melentijevic 2017
ZB4065 ZB4065	bzIs166[Pmec-4::mCherry]	Overexpressie van mCherry (bzIs166) in touch neuronen, produceert zowel cytosolic signaal en mCherry aggregaten. bzIs166 is een exopher inducer. mCherry aggregaten zijn voorspellers van exophergenese en worden bij voorkeur geëxtrudeerd in exophers.	3-20% ALM (normale omstandigheden). 20-80% ALM (vasten voorwaarden).	Figuur 4B, Melentijevic 2017
ZB4067 ZB4067	bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+];	YFP cytosolically labels mec-7 touch neuronen. Co-uitgedrukte Q128::GVB aggregaten en induceert exophers. GVB zwijgt bij voorkeur.	~25%	Figuur 4C, Meletijevic 2017
ZB4509 ZB4509	bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]	bzIs168 LMP-1::GFP labelt plasmamembranen en lysosomale membranen. bzIs168 kan worden gebruikt om neuronale membranen, exophers (zoals ze zijn membraan gebonden), en lysosomale-membraan structuren te identificeren.	3-20% ALM	Figuur 4D, Melentijevic 2017
ZB4528 ZB4528	bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]	Allele zhsEx17 is een mitochondriaal gelokaliseerde verslaggever die zijn piekexcitatiegolflengte verandert van 405nm (geoxideerd) naar 476nm (verminderd) volgens de lokale oxidatieve omgeving. Het wordt uitgedrukt in de aanraking neuronen en kan worden gebruikt op zijn eigen te identificeren mitochondriën in aanraking neuronen en in mito-exophers.	3-20% ALM proteo-exopher. % ALM mito-exopher quantitation in progress.	Figuur 4E, Melentijevic 2017, Kanon 2008, Ghose 2013

Tabel 1. Stammen die zijn gebruikt voor visualisatie van touch neuronen, touch neuron-exophers, en exopher inhoud.

Figuur 1: Stadia van exophergenesis. Het proces van het maken en uitwerpen van een exopher wordt 'exopher-genesis' genoemd. Het dynamische proces van exopher vorming kan enkele minuten tot enkele uren duren. Afgebeeld zijn voorbeelden van soma en exopher morfologie in specifieke stappen tijdens het dynamische exophergenesis proces in een hoog-exopher producerende stam, ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]. Alle beelden zijn van dag 2 volwassen ALM neuronen genomen met een 100x doelstelling. (A) Normale soma. Volwassen mechanosensorische touch neuron ALM transgenisch uitdrukken P_mec-4mCherry. De afgebeelde somamorfologie is typerend voor jongvolwassen neuronen in deze stam, met mCherry-concentraties in het cytoplasma. (B) Vroege knopfase. De eerste waarneembare stap van exophergenesis omvat polarisatie van geselecteerd cytoplasmatisch materiaal aan de rand van het somamebraan. Deze stap gaat vaak gepaard met een uitzetting of zwelling van de soma. In het geval van de aanraakneuronen strekt het pre-exopher domein (PED) zich uit tot in de omringende hypodermis (hier niet zichtbaar). Let op de grotere concentratie van mCherry materiaal in de vroege knop domein. (C) Late knopfase. Bij verdere cellulaire polarisatie en een uitbreiding van het pre-exopher domein, wordt een vernauwing tussen de soma en exopher (pijl) duidelijk. Deze gebeurtenis signaleert de overgang naar de late bud fase. Hoewel in de late knop stadium van de cel vertoont een duidelijke vernauwing site en scheiden soma en exopher domeinen, is het nog niet volledig afgeknepen van de soma; de ontluikende exopher kan worden bevestigd door een dikke stengel (pijl). Het ontluikende domein wordt beschouwd als een vroege exopher wanneer de diameter van het exopher domein in kwestie ongeveer 1/3 groter is dan de diameter van de bouwplaats/stengel. (D) Vroege exopher fase. Vroege exophers kunnen worden bevestigd door een stengel van de vertrekkende soma-de diameter van deze verbinding kan dun als de exopher beweegt uit de buurt van de soma. Cytoplasmatisch materiaal kan via deze buis van de soma naar de exopher worden overgebracht, hoewel het meeste materiaal wordt geladen tijdens het proces van ontluiken. Exophers kunnen loskomen van de soma zoals afgebeeld in (E), gescheiden exophers worden beschouwd als volwassen exophers (F). De volwassen exopher kan door het omringende hypodermale weefsel gaan, weg van de vertrekkende soma. (G) Uitsplitsing van de exopher met mCherry-label in kleinere akeltjes in de hypodermis resulteert in een verspreid accentueren van het mCherry-materiaal, waarschijnlijk wanneer het het hypodermale endolysososomale netwerk binnenkomt. Het verspreide punctaatsignaal wordt de "sterrennacht" fase genoemd. Afbraak van sommige exopher inhoud wordt waarschijnlijk bereikt door hypodermale lysosomen, maar sommige materiaal is niet volledig afgebroken en wordt vaak opnieuw geëxtrudeerd door de hypodermis in de pseudocoelom. De post-exophergenesis mCherry transit wordt meer in detail beschreven in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: mCherry geëxtrudeerd uit touch neuronen in exophers betrekt het omringende hypodermale lysosomale netwerk, maar kan later worden geëxtrudeerd in de pseudocoelom waar coelomocyten kunnen opslaan / degraderen de mCherry. (A) Cartoon samenvatting van hoe mCherry geëxtrudeerd in exophers transits het lichaam na uitzetting door neuronen. Tijdens exophergenesis geselecteerde cellulaire inhoud zoals mCherry worden gelokaliseerd en bud off van de verzendende neuronale soma in een onafhankelijke blaasje omgeven door de neuronale en hypodermale plasma membranen. Aangezien de aanraking neuronen zijn ingebed in het hypodermale weefsel, als de exopher domein knoppen naar buiten beweegt het verder in de hypodermis. De exopher kan de hypodermis passeren, en na uren tot dagen kan exopher inhoud fragment binnen het endolysososomale netwerk van de hypodermis. De mCherry kan verschijnen als verspreid puncta in de hypodermis, een podium genaamd "sterrennacht". Na een paar dagen, kan een deel van de mCherry passeren van de hypodermis in de omliggende pseudocoelom, waar aaseters cellen genaamd coelomocyten toegang kunnen krijgen tot, en nemen, mCherry die kan worden opgeslagen. (B) Voorbeeld van het uiterlijk van de sterrenhemel nacht mCherry vesicles. Beeld van een ALM soma die met mCherry met grote exopherfragmenten en starry nachtblasels wordt getagd. Stam is ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]. (C) Voorbeeld van mCherry concentratie in verre coelomocyten. Zijaanzicht van een volwassen dier dag 10 van stam ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry] met mCherry geconcentreerd in coelomocyten (pijlen). Sommige sterrenhemel nacht vikjes zijn ook duidelijk. In het algemeen coelomocyte concentratie wordt duidelijk na ongeveer volwassen dag 5 van het leven. (B bodem) Cartoon reproductie van (B), met aanraking neuronen en processen geschetst in rood, net als helderste exopher fragmenten; verspreide kleine bloemetjes van verschillende Z-diepten worden weergegeven in lichter roze. (C bodem) De versie van het beeld van het beeld van het beeld van het beeld van het beeld van de beeldverhaal van(C),tonend neuronale proces in rood, starry nacht in roze en coelomocyten in groen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Mechanosensorische aanraakneuronen produceren exophers op verschillende niveaus met een nauwkeurig temporele profiel. (A) (Top) Cartoon afbeelding van mechanosensorische touch neuronen in ruimtelijke relatie tot de belangrijkste anatomische oriëntatiepunten van C. elegans met inbegrip van de pompende keelholte en de neuron-dichte zenuwring aan het hoofd van het dier, de vulva in het midden lichaam, en de taps toelopende staart. (Onder) Fluorescerend gelabeld touch neuronen uitdrukken GFP zoals bekeken vanaf de boven-en linkerkant (beelden aangepast van WormAtlas). De rode doos toont het gebied waar ALM exophers zich meestal bevinden. (B) Een hoge vergrotingsvisie van het middenlichaamgebied waar alm-afgeleide exophers worden geproduceerd in een stam die [P_mec-4mCherry] uitdrukt. AVM en ALMR neuron zijn afgebeeld, en getoond is een ALMR exopher samen met mCherry sterrenhemel nacht. ALMR neuronen produceren het gemakkelijkst exophers. (C) ALMR mechanosensorische touch neuronen gemakkelijker produceren exophers in vergelijking met andere touch neuronen in hermafrodieten onder basale omstandigheden. Mechanosensorische touch neuron exopher productie op volwassen dag 2, zoals gescoord voor individuele touch receptor neuronen is aangegeven. Stam: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], N>150, error bars zijn SEM. (D) ALMR touch neuronen produceren meer exophers tijdens de dagen 2 en 3 van de volwassenheid in vergelijking met de adolescente L4 stadium of met dieren op hoge leeftijd. Stam: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], N>150, error bars are SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Voorbeelden van enkele tl-verslaggevers die exopher inhoud taggen. Een eenvoudige manier om exophers te observeren is door het creëren van transgene dieren die fluoroforen uitdrukken van neuronale promotors. De fluoroforen zorgen voor visualisatie van de exopher en transgene expressie induceert aggregatie en/of proteostress die exophergenesis verhoogt. Exophers geproduceerd door amphid neuronen kunnen ook worden waargenomen onder inheemse omstandigheden, met behulp van kleurstof vullen voor visualisatie. Getoond zijn voorbeelden van veel voorkomende stammen die kunnen worden gebruikt om exophers observeren, (E) exopher, (S) soma. (A) Soma en exopher van een ALM van een volwassene van stam SK4005 zdIs5[P_mec-4GFP],100x doelstelling gebruikt voor fotografie, schaal bar 3μm. In deze stam worden exophers gemeten die oplosbare GFP bevatten, maar exopherproductie treedt zelden op. Het fuseren van GFP naar eiwitten die bij voorkeur kunnen worden geëxtrudeerd in exophers in andere studies bevestigt dat GFP-fusies kunnen worden gedetecteerd bij volwassen exophers. (B) ALM soma en exopher van een volwassene van stam ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry], die mCherry uitdrukt en de productie van aanraakneuronen induceert. 100x doelstelling gebruikt voor fotografie, schaalbalk 5 μm. (C) ALM soma en exopher van een volwassene van stam ZB4067 bzIs167[P_mec-4mitogfp P_mec-4mCherry4]; igIs1[P_mec-7YFP P_mec-3htt57Q128::cfp lin-15+]; selectief blauw kanaal dat wordt gebruikt voor afbeelding van htt57Q128::GVB. De exopher bevat htt57Q128::CFP aggregaten (pijlen), die meer geconcentreerd lijken in de exopher dan in de soma. 40x doelstelling gebruikt voor fotografie, schaalbalk 5μm. (D-E) Exophers kunnen organellen en organelle-specifieke tagging met fluorescerende eiwitten bevatten, waardoor organelle-extrusie kan worden gecontroleerd. (D) Lysosomale membraantag LMP-1::GFP schetst de soma en exopher membraan en tagt plasmamembraanen zwak (plasmamembraanlokalisatie is een handelsstap op weg naar lysosomale targeting) en labelt lysosomale organellen sterk. Getoond is een volwassen ALM soma co-uitdrukken P_mec-4mCherry en de P_mec-7LMP-1::GFP dat lokaliseert naar membranen en lysosomen. De soma heeft een bijgevoegde exopher met andere kleinere extrusies waarschijnlijk exopher fragmenten (pijlen). GFP positieve structuren zijn opgenomen in de soma en zijn aanwezig in de grote exopher, stam: ZB4509 bzIs166[P_mec-4mCherry]; bzIs168[P_mec-7LMP-1::GFP]. 100x doelstelling gebruikt voor fotografie, schaalbalk 5 μm. E) Een mitochondriale GFP marker kan worden gebruikt om mitochondriën in soma en exophers te identificeren. Getoond is een volwassen ALM soma uitdrukken P_mec-4mCherry en mito::ROGFP, die lokaliseert naar de mitochondriale matrix. mito::ROGFP alleen uitgedrukt, zonder de mCherry, kan ook gemakkelijk worden gebruikt om neuronen te identificeren en te scoren voor exophers die mitochondriën omvatten. Stam: ZB4528 bzIs166[P_mec-4mCherry]; zhsEx17 [P_mec-4mitoLS:ROGFP]. 100x doelstelling gebruikt voor fotografie; schaalbalk 5μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Ontwikkelingscyclus van C. elegans en L4-identificatie. AA) Bij 20 °C duurt het ongeveer 9 uur om een ei uit te komen zodra het door de moeder is gelegd. (B) Een nieuw uitgebroed dier bevindt zich in larvestadium 1 (L1) en vervelt na 12 uur in een L2-larve. (C) Dieren blijven ongeveer 8 uur in de L2- en de(D)Larval-fases van L3. (E) Adolescente dieren worden beschouwd als het vierde larvestadium (L4) en worden gekenmerkt door een opvallende zich ontwikkelende vulva die verschijnt als een witte halve maan in de buurt van het middenlichaam. De aanwezigheid van deze, terwijl halve maan maakt het gemakkelijk identificeren en plukken van L4 geënsceneerde dieren om gesynchroniseerde culturen die later vergemakkelijken scoren voor exophers vast te stellen. Dieren blijven in de L4 fase voor ongeveer 10 uur voordat hun laatste vervelling in gravid volwassenen, F) geïdentificeerd door het ontwikkelen van eieren, zichtbare spermatheca, en de initiatie van ei-leggen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Voorbereiding van de microscoop dia agar pad. (A) Bereid twee dia's met een enkele strook laboratoriumtape in de lengte over de bovenkant. Plaats een niet-afgeplakte microscoop dia tussen zoals afgebeeld. B) Plaats een druppel gesmolten agarose op de top van de dia. (C) Plaats een schone schuif voorzichtig op de top van de druppel, het indrukken van de agarose in een leeggelopen cirkel pad. (D) Verwijder de afgeplakte dia's, die werken om een gelijkmatige afvlakking van de agar die nodig is om een even pad te creëren te bereiken. (E) Verwijder de bovenste schuif zodra de agarose pad is gedroogd. (F) Pipet een paralytische oplossing (levamisole of tetramisole) bovenop de agar pad. (G) Kies op de juiste wijze geënsceneerde dieren in de verlammende. (H) Bedek de dieren voorzichtig met een hoezenstrookje en zorg ervoor dat de dieren in leven zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Tekens van exophers en exopher identificatiecriteria. (A) Algemene criteria die een exopher identificeren. (B) Diameter vergelijkingen tussen de verzendende soma en de geëxtrudeerde exopher, gemeten in μm. Volwassen ALM somas, N=35, stam: ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry] - 6.53 μm gemiddelde grootte van soma en 3.83 μm gemiddelde grootte van exopher. (C) Het definiëren van criteria voor het onderscheiden tussen een exopher domein en een ontluikende exopher. (D) Meestal, individuele neuronen maken een grote exopher, die later splitst of fragmenten als de hypodermis probeert te degraderen de inhoud ervan. Toch kunnen meerdere exophers worden waargenomen naast een aanraking neuron dat kan voortvloeien uit ofwel meerdere exopher gebeurtenissen uit een neuron of als alternatief, exophers kunnen ook bud of fragment zelf. De oorsprong van meerdere exopher-achtige entiteiten kan alleen worden bepaald met behulp van time lapse microscopie. Top toont een ALMR touch neuron soma met een enkele verre exopher. Bottom toont een ALMR touch neuron soma met meerdere exopher-achtige extrusies. (E)Gemeenschappelijke morfologische kenmerken in volwassen ALM touch neuron soma's die kunnen worden verward met exopher gebeurtenissen. Linksboven - Een verzoogde ALM soma, zonder duidelijke exopher domein of vernauwing site. Top midden - Neuronen kunnen kleine extracellulaire uitsteeksels die analoog kunnen zijn aan exophers, maar niet voldoen aan de grootte eis criteria worden beschouwd als een exopher. Rechtsboven – Met de leeftijd, touch neuronen kunnen ontwikkelen uitwassen langs hun kleine neurite. Vaak mCherry materiaal kan worden verzameld op het puntje van de neuriet uitgroei. Dit wordt niet gescoord als een exopher als de verzamelde mCherry niet voldoet aan exopher-to-soma grootte eisen. Bottom toont volwassen ALM neuronen die bepalende criteria voor een exopher domein of een exopher hebben. Botom links - ALM soma dat een prominente exopher domein dat selectief omvat mCherry cytosol en mCherry gelabelde aggregaten heeft. De exopher domein vernauwing site wordt gemarkeerd door pijlen en voldoet aan de grootte criteria (ten minste 1/ 5^e de grootte van de soma). De grootste diameter van het exopher domein is bijna 1/3 groter dan de diameter van de vernauwingsplaats, die voldoet aan de criteria voor een exopher-gebeurtenis. Bottom middle - ALM soma dat een prominente ontluikende exopher die voldoet aan de grootte criteria heeft. Er is een duidelijke vernauwing site. Rechtsonder - ALM soma dat een bijgevoegde mCherry-gevulde exopher heeft die voldoet aan exopher grootte eisen. De exopher wordt bevestigd door een dunne verbindende gloeidraad. Alle beelden zijn van stam ZB4065 bzIs166[P_mec-4mCherry]. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

De karakterisering van de in vivo moleculaire mechanismen van aggregaat en organelle eliminatie in de vorm van grote exophers staat nog in de kinderschoenen. Vragen over de aanwijzing van ladingen voor uitzetting, de gepolariseerde verzameling van deze ladingen in de cel, de regulering van het besluit om exophers te genereren, de machines die extrusies bemiddelen, en de interactie van exophers met de degradatieve machines in een naburige cel moeten allemaal worden aangepakt. Bovendien is de in vivo visualisatie van buisverbindingen die biologische materialen kunnen passeren die calcium, aggregaten en mitochondriën omvatten, op zichzelf interessant en ondergestudied. Vragen van waarom bepaalde cellen zijn meer vatbaar voor exopher productie dan anderen zijn ook onopgelost, maar kan beginnen te worden genetisch ontleed met de benaderingen beschreven in dit protocol.

Beschreven in detail in dit protocol zijn de benaderingen voor het bereiken van reproduceerbare scoren van exopher productie, met aandacht voor het onderscheiden van exophers van nabijgelegen cel soma's, timing van analyses om piek van exopher productie vast te leggen, en strikte controle van de groeiomstandigheden om onbedoelde spanningen die exopher niveaus kunnen moduleren elimineren. Zowel onderscheid van de grote vroege exopher, of de "sterrennacht' dispersie in de omliggende hypodermis kan worden gekwantificeerd als bewijs van exopher productie. Dat gezegd zijnde, neuronen uitdrukken mCherry onder basale omstandigheden worden meestal geassocieerd met 5-25% van de neuronen van een specifiek type produceren van een exopher. Gecontroleerde invoering van stress voorwaarden kunnen worden toegepast om exopher productie te verhogen tot detectie zo hoog als 90% van de neuronen produceren extrusies, met name nuttig voor genetische of farmacologische schermen voor modifiers.

Bij menselijke neurodegeneratieve ziekte kunnen grote aggregaten overgaan van zieke neuronen naar naburige cellen om de verspreiding van pathologie te bevorderen. Het exopher mechanisme kan transpireren via een geconserveerd mechanisme dat wordt gebruikt voor geaggregeerde extrusie over phyla. Het definiëren van de in vivo moleculen die ofwel de efficiëntie van dit proces te verbeteren (beschouwd als meer effectieve proteostase controle) of blokkeren kan worden gebruikt om het ontwerp van nieuwe strategieën voor de bestrijding van meerdere neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden. Als zodanig kan het hier beschreven protocol worden gebruikt voor klassieke genetische mutagenesisschermen, genoombrede RNAi-schermen die systematisch genen afbreken om versterkers en suppressors te identificeren, of voor medicijninterventiestudies die kandidaat-farmacologische modifiers van dit proces identificeren. De aanpak is eenvoudig, hoewel enigszins moeizaam. Exophers zijn zo groot dat ze kunnen worden bekeken met een hoge vergroting ontleden microscoop. Nog steeds, C. elegans neuronen zijn relatief klein en kijken naar hun organellen of hun membranen vereisen een hogere macht confocale beelden en is een langzaam proces. Opties voor een hogere doorvoer kunnen gepaard gaan met hoge gehalte imaging benaderingen in multi-well plaat formaat.

De toepassing van een gestandaardiseerde benadering van exopher scoren moet ten grondslag liggen aan een gecoördineerde genetische dissectie van het proces waardoor neuronen cellulaire puin kunnen organiseren en elimineren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
95B Scientific CMOS camera	Photometrics Prime
1,000 µL low retention tips	Sarstedt
10 mL serologische pipette	Appleton Woods	CC214
10 µL low retention tips	Sarstedt	70.1130.105
13% natriumhypochloriet	Acros Organics	AC219255000
15 mL centrifugeerbuisjes	Fisher Scientific	05-539-12
2 L erlenmeyerkolven	Scientific Laboratory Supplies	FLA4036
25 mL serologische pipette	Appleton Woods	CC216
300 µL low retention tips	Sarstedt	70.765.105
50 mL serologische pipette	Appleton Woods	CC117
5-Fluoro-2′-deoxyuridine 98%	Alfa Aesar	L16497.ME
9 cm steriele Petri-schalen	Fisher Scientific	11309283
absoluut ethanol	Vwr	20821.33
Agar	Sigma Aldrich	A1296
C. elegans stam wild type	Geleeverd door CGC	N2	C. elegans stam
calciumchloride dihydraat	Sigma Aldrich	C3881
cholesterol	Acros	110190250
dinatriumfosfaat	Sigma Aldrich	S3264
E. coli stam OP50	Geleeverd door CGC	Op50	E coli stam
FBS10 Standard microscoop	Meyer Instruments	KSC 410-1-100-1	FBS10 Standard met platenbasis, 100/100 trinoculaire kop en Flip zoom
glaspipet 270 mm	Fisherbrand	FB50255
Heraeus Multifuge X3R	Thermofisher scientific	75004515
Inoculating Spreaders	Fisher Scientific	11821741
LB-medium capsules	MP biomedicals	3002-031
LDI - Laser Diode Illuminator	89 North
levamisol	Sigma Aldrich	16595-80-5
M4 multipette	Eppendorf	4982000012
magnesiumsulfaat	Sigma Aldrich	M7506
monokaliumfosfaat	Sigma Aldrich	P0662
Multitron Standard schuddende incubator	Infors HT	INFO28573
Nalgene 1 L Centrifuge potten	Fisher Scientific	3120-1000
P10 pipette	Eppendorf Research Plus	3123000020
P1000 pipette	Eppendorf Research Plus
P200 pipette	Eppendorf Research Plus	3123000055
pipeteboy 2	VWR	612-0927
Polystyreen microbeads	Sigma Aldrich	MFCD00131491
RC5C plus vloer gemonteerde centrifuge	Sorvall	9900884
Herbruikbare ringvormige cytologieslides	ThermoFisher Scientific	22037242
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]	contract Driscoll lab		GFP uitgedrukt in aanraakneuronen
natriumchloride	Sigma Aldrich	13422
Natriumhydroxide	Fisher Chemical	S/4880/53
Tactrol 2 Autoclaaf	Priorclave
Triton-X	Thermofisher scientific	28313
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit	CrestOptics
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]	contract Driscoll lab		mCherry uitgedrukt in aanraakneuronen
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]	contract Driscoll lab		Q128 uitgedrukt in aanraakneuronen
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]	contract Driscoll lab		mitoROGFP uitgedrukt in aanraakneuronen
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]	contract Driscoll lab		autofagiemarker uitgedrukt in aanraakneuronen
ZEISS Axio Vert.A1	Zeiss