Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken

Summary

We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.

Abstract

Genexpressieanalyse van menselijk nierweefsel is een belangrijk hulpmiddel om homeostase en ziektepathofysiologie te begrijpen. Het verhogen van de resolutie en diepte van deze technologie en het uitbreiden ervan tot het niveau van cellen in het weefsel is nodig. Hoewel het gebruik van single nuclear en single cell RNA sequencing wijdverspreid is geworden, behouden de expressiehandtekeningen van cellen verkregen uit weefseldissociatie geen ruimtelijke context. Lasermicrodissectie (LMD) op basis van specifieke fluorescerende markers zou de isolatie van specifieke structuren en celgroepen van belang met bekende lokalisatie mogelijk maken, waardoor ruimtelijk verankerde transcriptomische handtekeningen in nierweefsel kunnen worden verwerving. We hebben een LMD-methodologie geoptimaliseerd, geleid door een op fluorescentie gebaseerde vlek, om vijf verschillende compartimenten in de menselijke nier te isoleren en daaropvolgende RNA-sequencing uit waardevolle menselijke nierweefselmonsters te geleiden. We presenteren ook kwaliteitscontroleparameters om de toereikendheid van de verzamelde specimens te kunnen beoordelen. De workflow die in dit manuscript wordt beschreven, toont de haalbaarheid van deze aanpak om subsegmentale transcriptomische handtekeningen met veel vertrouwen te isoleren. De hier gepresenteerde methodologische benadering kan ook worden toegepast op andere weefseltypen met vervanging van relevante antilichaammarkers.

Introduction

Technologische vooruitgang bij het bestuderen van weefselmonsters heeft het begrip van de gezondheidstoestand en ziekte in verschillende organen verbeterd. Dergelijke vooruitgang heeft onderstreept dat pathologie kan beginnen in beperkte regio's of in specifieke celtypen, maar toch belangrijke implicaties heeft voor het hele orgaan. Daarom is het in het huidige tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde belangrijk om de biologie op zowel cel- als regionaal niveau te begrijpen en niet alleen wereldwijd¹. Dit geldt met name voor de nier, die bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen en structuren die differentieel initiëren en/of reageren op pathologische stress. De pathogenese van verschillende soorten menselijke nierziekte is nog steeds niet goed begrepen. Het genereren van een methodologie om veranderingen in genexpressie in specifieke buisvormige segmenten, structuren of gebieden van het interstitium in de menselijke nier te bestuderen, zal het vermogen vergroten om regiospecifieke veranderingen te ontdekken die kunnen informeren over de pathogenese van ziekte.

Menselijke nierbiopsie-exemplaren zijn een beperkte en kostbare hulpbron. Daarom moeten technologieën die transcriptomics in nierweefsel ondervragen, worden geoptimaliseerd om weefsel te bezuinigen. De beschikbare methoden om transcriptomics op cel- en regionaal niveau te bestuderen omvatten single cell RNA sequencing (scRNaseq), single nuclear RNaseq (snRNaseq), in situ spatial hybridization en laser microdissection (LMD). Dit laatste is zeer geschikt voor een nauwkeurige isolatie van regio 's of structuren die van belang zijn binnen weefselsecties , voor downstream RNA-sequencing en -analyse^2,3,4,5. LMD kan worden gebruikt om te vertrouwen op identificatie van specifieke celtypen of structuren op basis van gevalideerde markers met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming tijdens dissectie.

De unieke kenmerken van lasermicrodissectie ondersteunde regionale transcriptomics omvatten: 1) het behoud van de ruimtelijke context van cellen en structuren, die eenmalige celtechnologieën aanvult waar cellen worden geïdentificeerd door expressie in plaats van histologisch; 2) de technologie informeert en wordt geïnformeerd door andere beeldvormingstechnologieën omdat een antilichaammarker expressiehandtekeningen definieert; 3) het vermogen om structuren te identificeren, zelfs wanneer markers veranderen in ziekte; 4) detectie van laag uitgedrukte transcripties in ongeveer 20.000 genen; en 5) opmerkelijke weefseleconomie. De technologie is schaalbaar voor een nierbiopsie met een dikte van minder dan 100 μm van een kern die nodig is voor voldoende RNA-acquisitie en maakt het gebruik van gearchiveerd bevroren weefsel mogelijk, dat algemeen beschikbaar is in grote repositories of academische centra⁶.

In het daaropvolgende werk beschrijven we de regionale en bulk transcriptomics-technologie in detail, geoptimaliseerd met een nieuw protocol voor snelle fluorescentiekleuring voor gebruik met menselijk nierweefsel. Deze aanpak verbetert klassieke LMD-verkenningen omdat het afzonderlijke expressiegegevens biedt voor de subsegmenten interstitium en nephron in tegenstelling tot geaggregeerde tubulo-interstitiële expressie. Inbegrepen zijn de kwaliteitsborgings- en controlemaatregelen die zijn genomen om strengheid en reproduceerbaarheid te waarborgen. Het protocol maakt visualisatie van cellen en interessegebieden mogelijk, wat resulteert in een bevredigende verwerving van RNA uit deze geïsoleerde gebieden om downstream RNA-sequencing mogelijk te maken.

Protocol

De studie werd goedgekeurd voor gebruik door de Institutional Review Board (IRB) van de Indiana University.

OPMERKING: Gebruik dit protocol met niernefrectomieweefsel (tot 2 cm in zowel de X- als de Y-afmetingen) dat bewaard is gebleven in de optimal cutting temperature (OCT) verbinding en bewaard bij -80 °C. Voer al het werk uit op een manier die RNA-vervuiling beperkt, gebruik schone wegwerphandschoenen en een gezichtsmasker. Zorg voor de netheid van alle oppervlakken. De apparatuur waarvoor dit protocol is geoptimaliseerd, is een lasermicrodissectiesysteem met gepulseerde UV-laser.

1. Cryosectioning

1. Stel 1,2 μm LMD PPS-membraan (poly(p-fenyleensulfide) dia's gedurende 30 minuten bloot aan UV-licht (in een weefselkweek laminaire stroomkap), vlak voor cryosectioning. Bewaar de dia's op kamertemperatuur voor optimale weefselaanh hechting.
2. Koel de cryostaat tot -20 °C. Reinig de werkoppervlakken en installeer een nieuw snijblad.
3. Plaats een kleine schuifdoos (gereinigd met RNase oppervlaktedecontaminatieoplossing) in de cryostatkamer om dia's met vers gesneden weefsel op te slaan.
4. Bevestig het monster in OCT aan een weefselhouder en laat het enkele minuten in evenwicht zijn om de kamertemperatuur te bereiken en de hechting tussen het OCT-blok en de houder te versterken. Help het proces met behulp van een warmteafzuiger.
5. Snijd het monster tot een dikte van 12 μm en breng het aan op de gespecialiseerde LMD-dia met behulp van de schuifadapter. Elke dia bevat één nefrectomiesectie per dia of maximaal twee nierbiopsiesecties per dia. Bewaar de glijbanen op -80 °C met een droogmiddelpatroon en in een goed gesloten plastic zak om te voorkomen dat overtollig vocht zich ophoopt in de schuifdoos.
6. Label elke dia met een voorbeeld-ID, datum en dianummer.
7. Gebruik de dia's met monsters binnen 10 dagen na de begindatum van cryosectioning.

2. Laser microdissectie

1. Bereid vlak voor de kleuring de Antilichaammix (Ab-Mix) in 10% BSA in RNase-vrije PBS door het volgende toe te voegen: 4 μL FITC-Phalloidine, 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antilichaam direct geconjugeerd naar Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitor en 89,2 μL van 10% BSA in PBS (om een volume van 100 μL te bereiken).
   OPMERKING: Alternatieve antilichamen kunnen worden gebruikt in plaats van het THP-antilichaam. Bijvoorbeeld, 2 μL megalin/LRP2 antilichaam, direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 568, kan worden gebruikt om de proximale tubule te labelen. De Ab-Mix bevat LRP2- of THP-antilichamen (om respectievelijk proximale tubuli of dikke opgaande ledematen te visualiseren). Andere antilichamen kunnen worden gevalideerd op basis van de behoeften van de gebruiker.
2. Was de glijbaan in ijskoud (-20 °C) 100% aceton gedurende 1 minuut en verplaats deze naar de vochtigheidskamer.
3. Was de bovenkant van de glijbaan met RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
4. Was de bovenkant van de glijbaan met 10% BSA in RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
5. Breng de Ab-Mix 5 min aan.
6. Was de bovenkant van de glijbaan met 10% BSA in RNase-vrije PBS gedurende 30 s. Herhaal dit.
7. Droog de glijbaan 5 minuten aan de lucht en laad deze op het laser microdissectie snijplatform.
8. Installeer de opvangbuizen (autoclaved 0,5 ml microcentrifugebuizen) die geschikt zijn voor PCR-werk en die 50 μL extractiebuffer uit de RNA-isolatiekit bevatten.
9. Ga verder met LMD. Voltooi elke LMD-sessie binnen ten hoogste 2 uur.
   1. Verzamel pre- en post-LMD-immunofluorescentiebeelden, met behulp van de microscoopcamera om de dissectie te valideren voor interoperatorvariabiliteit, evenals archiefdoeleinden, training en kwaliteitsbeoordeling van het uitgevoerde protocol. Om 0,5 – 1 ng RNA te verkrijgen, is een minimum van 500.000^{μm 2-gebied} vereist. Dit vereist vaak het gebruik van maximaal 8 x12 μm dikke secties om een voldoende hoeveelheid materiaal te verkrijgen voor alle subsegmenten van belang.
   2. Identificeer interessegebieden door kleuring, morfologie en locatie en verwijder ze met laservermogen groter dan 40.
      OPMERKING: Hier zijn de dissectiecriteria. De proximale tubule wordt gedefinieerd door FITC-Phalloidin en LRP2-etikettering. Het dikke oplopende ledemaat wordt gedefinieerd door THP-etikettering. Het verzamelkanaal wordt gedefinieerd door nucleaire morfologie (DAPI) en afwezigheid van andere vlekken. De glomerulus wordt gedefinieerd door FITC-Phalloidin en morfologie. Het interstitium wordt gedefinieerd als het gebied tussen bevlekte tubuli.
10. Verkrijg een bulk transversale expressiehandtekening door twee secties van 12 μm op een LMD-dia aan te brengen en de hele secties in extractiebuffer te ontleden.
11. Na voltooiing van het LMD-proces sluit u de verzamelmicrocentrifugebuizen en veegt u deze krachtig om ervoor te zorgen dat de inhoud van de dop naar de onderkant van de buis wordt verplaatst
12. Centrifugeer de buizen op 3.000 x g gedurende 30 s.
13. Incubeer de buizen gedurende 30 minuten in een waterbad van 42 °C.
14. Centrifugeer de buizen gedurende 2 minuten op 3.000 x g.
15. Breng de supernatant over in een nieuwe buis van 0,5 ml en bewaar deze in -80 °C.

3. RNA-isolatie

OPMERKING: Voor dit RNA-isolatieprotocol hebben we een protocol aangepast van een commerciële RNA-isolatiekit. Het protocol van de fabrikant is aangepast om te voldoen aan de kwaliteitscontrolevereisten voor het project.

1. Voeg 250 μL geconditioneerde buffer (CB) toe aan elke RNA-zuiveringskolom (PC) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Centrifugeer alle pc's gedurende 1 min bij 16.000 x g.
3. Voeg 50 μL 70% ethanol (meegeleverd in de Kit) toe aan de buizen met weefselmonsters. Meng de monsters goed door op en neer te spuiten. Niet vortex. Niet centrifugeren.
4. Breng het mengsel over in geconditioneerde pc's en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 100 x g (om RNA te binden), volg snel met centrifugeren gedurende 30 s bij 16.000 x g (om de stroom erdoorheen te verwijderen). Herhaal deze stap als er meer dan 1 buis met weefselmonsters beschikbaar is voor een bepaald subsegment.
5. Voeg 100 μL Wash Buffer 1 (WB1) toe aan de pc's en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g.
6. Bereid 40 μL DNase per monster voor (Voeg 5 μL DNase toe aan 35 μL RDD-buffer). Voeg vervolgens 40 μL van het mengsel direct toe aan het membraan van de pc en incub gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
7. Voeg 40 μL WB1 toe aan het membraan van de pc en centrifugeer gedurende 15 s bij 8.000 x g.
8. Voeg 100 μL Wash Buffer 2 (WB2) toe aan het pc-membraan en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 8.000 x g.
9. Voeg 100 μL WB2 toe aan het membraan van pc, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 x g, onmiddellijk gevolgd door centrifugeren gedurende 1 min bij 16.000 x g.
10. Breng de pc over naar een nieuwe buis van 0,5 ml.
11. Voeg 12 μL Elution Buffer (EB) toe aan het membraan en incub gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke volume van alle samengevoegde ontlede weefselmonsters is dus 12 μL per subsegment.
12. Centrifugeer de monsters gedurende 1 min bij 1.000 x g en vervolgens gedurende 2 minuten bij 16.000 x g.
13. Breng 2 μL over in een verse buis voor Bioanalyzer-analyse (om vriesdooigebeurtenissen te voorkomen).
14. Bewaar alle buizen in -80 °C tot ze klaar zijn voor verdere verwerking.

4. RNA-sequencing

1. Beoordeel elk monster, bedoeld voor sequencing, op kwaliteit met behulp van een commerciële Bioanalyzer en een chip die is gewijd aan het meten van kleine hoeveelheden RNA.
2. De volgende parameters voor kwaliteitscontrole (QC) voorafgaand aan de voorbereiding en sequencing van de bibliotheek zijn vereist: hoeveelheid RNA groter dan 4 ng voor bulk en groter dan 0,5 – 1 ng voor elk subsegment; Het percentage transcripties langer dan 200 nucleotiden (DV200) moet groter zijn dan 25% voor LMD-specimens (optimaal > 75%).
3. Voer de voorbereiding van de bibliotheek uit met een commerciële cDNA-bibliotheekvoorbereidingskit die bedoeld is voor kleine hoeveelheden gedegradeerd RNA. Voor de commerciële kit vermeld in het supplement, raden wij het gebruik van Optie 2, die een minimum DV200 van 25% en geen fragmentatie vereist. Sommige sequencingtechnologieën vereisen mogelijk hogere minimale DV200-drempels, zoals 30%⁷.
4. Voeg cDNA-adapters en indexen toe.
5. Zuiver de RNAseq-bibliotheken met behulp van magnetische kraaltechnologie.
6. Put de ribosomale cDNA uit met behulp van een commerciële rRNA-verwijderingskit voordat de RNAseq-bibliotheekversterkingsstap wordt uitgevoerd.
7. Zuiver de uiteindelijke RNAseq-bibliotheek met behulp van magnetische kraaltechnologie bij een cDNA-bibliotheekconcentratie van 2 ng/μL.
8. Voer RNA-sequencing uit van 75 bp gekoppeld uiteinde op een commercieel sequencingsysteem met 30 miljoen reads/sample voor bulk en 100 miljoen reads/sample voor subsegmentale secties.
9. Gebruik een referentie-RNA (25 μg) bij elke sequencingrun om het batch-effect te regelen. De initiële concentratie van ons referentie-RNA is 1 μg/μL, terwijl de uiteindelijke concentratie die in sequencing wordt gebruikt 25 ng/μL is. Voer het referentie-RNA uit als een afzonderlijk monster tijdens de bibliotheekvoorbereiding en voer elke keer met alle LMD-specimens uit.
10. Voer gegevensanalyse uit met behulp van de FastQC-applicatie om de kwaliteit van sequencing, intergene en mitochondriale reads te beoordelen en om leesbewerkingen te bepalen die aan een gen worden toegeschreven.
11. Gebruik Integrative Genomics Viewer (IGV) voor uitlijning en edgeR/rbamtools voor transcriptieexpressiemetingen.
12. Verwijder monsters met minder dan 100.000 leesbewerkingen. Quantile normaliseert de ruwe waarden in de gegevensset na het filteren van laag uitgedrukte genen op een door de gebruiker gedefinieerde drempelwaarde.
13. Kwantificeer de expressie als een verhouding tussen het subsegment van belang en het gemiddelde van alle andere subsegmenten en log2-transformatie. De relatieve expressie van hetzelfde gen kan worden vergeleken in subsegmenten en monsters; het is echter niet ideaal om relatieve expressie tussen twee verschillende genen te vergelijken vanwege mogelijke verschillen in afbraak tussen genen en RNA-soorten.
14. Voer een verrijkingsanalyse uit om genexpressie te vergelijken voor een reeks makers die specifiek zijn voor elk nephron-subsegment, terwijl referentie-RNA-monsters in batches worden vergeleken. Een batch-effect binnen 1 standaardafwijking van gemiddelde expressie met R-waarde > 0,9 wordt als acceptabel beschouwd. Extra normalisatie is vereist voor een hogere batch-effectscore. Elke uitvoering die afwijkt van het geaccepteerde batch-effect kan worden gemarkeerd. De Q30 moet groter zijn dan >90% voor elke sequencingrun.

Results

Monsters

We presenteren gegevens van negen referentie nefrectomieën (3 exemplaren verkregen aan de Indiana University en 6 specimens verkregen via Kidney Precision Medicine Project), gebruikmakend van het rapid fluorescence kleuringsprotocol om niernefronsegmenten en interstitiële gebieden te isoleren. De secties die in dit proces werden gebruikt, werden verkregen van overleden nierdonoren of niet-aangetaste tumornectectomie. Deze monsters hadden geen pathologisch bewijs van z...

Discussion

Transcriptomics op basis van LMD is een nuttige technologie die genexpressie verankert naar specifieke gebieden in het weefsel. De basis van deze technologie en de mogelijke toepassing ervan in de nier is eerder beschreven⁸. Optimalisatie, modernisering en stroomlijning van fluorescentie-gebaseerde dissectie specifiek gericht op hoge nauwkeurigheid dissectie voor downstream RNA sequencing is echter minder alomtegenwoordig. Omdat deze methodologie ruimtelijk geaard is in het weefsel, heeft het het ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD-buffer is inbegrepen in het pakket
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antilichaam	Abcam	ab76969	Direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 568
Microcentrifuge buizen	ThermoFisher	AB-0350
Microscoop camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Vrij)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolatie Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membraan slides	Leica	11505268
qPCR Human Referentie Totaal RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Totaal RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq of NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Totaal RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Eiwit Antilichaam	R&D Systems	AF5144	Direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583