Levering van antilichamen in de hersenen met behulp van gerichte scanning echografie

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de bloed-hersenbarrière (BBB) tijdelijk te openen, hetzij focale of door een muizenbrein om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren en microglia te activeren. Ook gepresenteerd is een methode om de afgifte van antilichamen en microglia-activering door histologie te detecteren.

Samenvatting

Slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt door de hersenen opgenomen. Gerichte echografie biedt een mogelijkheid om de opname van antilichamen en betrokkenheid te verhogen door tijdelijke opening van de bloed-hersenbarrière (BBB). In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten over de BBB wordt afgeleverd met behulp van microbubbels, gelijktijdig met gerichte echografietoepassing door de schedel gericht op meerdere plekken, een benadering die we scanning ultrasound (SUS) noemen. De mechanische effecten van microbubbels en echografie op bloedvaten verhogen het paracellulaire transport over de BBB door het tijdelijk scheiden van tight junctions en verbeteren vesikel-gemedieerde transcytose, waardoor antilichamen en therapeutische middelen effectief kunnen kruisen. Bovendien vergemakkelijkt echografie ook de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen zoals neuronen waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen verspreidt. In onze studies worden fluorescerend gelabelde antilichamen bereid, gemengd met in-house bereide lipide-gebaseerde microbubbels en geïnjecteerd in muizen onmiddellijk voordat SUS op de hersenen wordt aangebracht. De verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen wordt vervolgens gekwantificeerd. Om rekening te houden met veranderingen in de normale homeostase van de hersenen, kan microgliale fagocytose worden gebruikt als een cellulaire marker. De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen.

Inleiding

Therapeutische echografie is een opkomende technologie gericht op de behandeling van hersenziekten op een niet-invasieve manier, deels door de toegang van therapeutische middelen tot de hersenen te ^{vergemakkelijken1,2,3}. Aangezien slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt opgenomen door en vastgehouden in de ^hersenen4, biedt therapeutische echografie de mogelijkheid om hun opname en doelbetrokkenheid te ^verhogen5,6.

In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten wordt afgeleverd over de bloed-hersenbarrière (BBB) met behulp van microbubbels. Om dit te bereiken, wordt echografie via de schedel in de hersenen op meerdere plekken toegepast met behulp van een scanmodus die we scanning ultrasound (SUS) noemen ⁷. De mechanische interactie tussen de ultrasone energie, de intraveneus geïnjecteerde microbubbels en de vasculatuur van de hersenen scheidt tijdelijk de tight junctions van de BBB in een bepaald ultrasoonapparaat, waardoor antilichamen en andere ladingen, waaronder therapeutische middelen, deze barrière effectief kunnen ^{passeren7,8,9} . Bovendien is aangetoond dat echografie de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen, zoals neuronen, vergemakkelijkt, waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen ^verdeelt5,10.

De ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door een amyloïde-β en ^{tau-pathologie11}, en een groot aantal diermodellen is beschikbaar om pathogene mechanismen te ontleden en therapeutische strategieën te valideren. Een SUS-benadering, waarbij echografie wordt toegepast in een sequentieel patroon over de hele hersenen, wanneer herhaald gedurende verschillende behandelingssessies, kan amyloïde plaquepathologie in de hersenen van amyloïde-β-deponerende amyloïde precursor eiwit (APP) mutante muizen verminderen en microglia activeren die het amyloïde opnemen, wat leidt tot verbetering van de cognitieve ^functie7. BBB-opening met echografie en microbubbels vermindert ook tau-pathologie in pR5, K3 en rTg4510 tau transgene muizen5,12,13. Belangrijk is dat, terwijl microglia extracellulaire eiwitafzettingen verwijderen, een van de onderliggende klaringsmechanismen voor intraneuronale pathologieën geïnduceerd door SUS de activering van neuronale ^autofagie12 is.

Hier schetsen we een experimenteel proces, waarbij fluorescerend gelabelde antilichamen worden bereid en vervolgens worden gemengd met in-house lipide-gebaseerde microbubbels, gevolgd door retroorbitale injectie in verdoofde muizen. Retroorbitale injectie is een alternatief voor staartaderinjectie waarvan we hebben vastgesteld dat het even effectief en eenvoudiger is om herhaaldelijk uit te voeren. Dit wordt onmiddellijk gevolgd door het aanbrengen van SUS op de hersenen. Om de therapeutische antilichaamopname te bepalen, worden muizen opgeofferd en wordt de verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen vervolgens gekwantificeerd. Als proxy van de verandering in de homeostase van de hersenen wordt microgliale fagocytische activiteit bepaald door histologie en volumetrische 3D-reconstructie.

De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een potentieel aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen. Het protocol kan op dezelfde manier worden toegepast op andere kandidaat-geneesmiddelen, evenals modelladingen zoals fluorescerend gelabelde dextrans van gedefinieerde ^afmetingen14.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de dierethiekcommissie van de Universiteit van Queensland.

1. In-house microbubbelbereiding

1. Weeg een molaire verhouding van 9:1 af van 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[amino(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout). 0,5 mg lipidenmengsel is vereist per 1 ml microbubbeloplossing. Als alternatief kunnen lipiden al in chloroform worden gekocht, als u voorgeïsoleerde lipiden gebruikt, gaat u verder met stap 1.3.
2. Los het lipide op in een klein volume chloroform in een glazen bekerglas.
3. Verdamp de chloroform met een verdamper of een stikstofstroom.
4. Rehydrateer de gedroogde lipidenfilm met 10 ml PBS + 10% glycerol + 10% propyleenglycoloplossing die is gefilterd door een filter van 0,22 μm.
5. Plaats de gerehydrateerde lipide-oplossing in een waterbad sonicator ingesteld op 55 °C (boven de smelttemperatuur van de lipiden) en soniceer totdat deze volledig is opgelost.
6. Aliquot lipide-oplossing in geautoclaveerde 1,5 ml HPLC-injectieflacons en schroef de septa-doppen vast.
7. Zuig alle lucht in de injectieflacon op met een spuit van 5 ml uitgerust met een naald van 27 G en creëer een vacuüm in de injectieflacon.
8. Voeg octofluorpropaan toe aan de injectieflacon met de meegeleverde spuit en zuig het gas uit de bus op. Vul de injectieflacon met 1-2 ml octafluorpropaan door het volume in de spuit af te lezen.
9. Sluit elke injectieflacon af met paraffinefilm en koel.
10. Breng de injectieflacon op de dag van het experiment op kamertemperatuur, voeg 0,5 ml 0,9% NaCl-oplossing toe aan de injectieflacon, plaats de injectieflacon in een amalgamator en roer gedurende 45 s (vooraf ingestelde tijd) om de microbubbels te produceren.

2. Microbubble kwaliteitscontrole met behulp van een coulter counter

1. Haal de microbubbeloplossing uit de amalgamator en ontlucht het gas uit de injectieflacon door de septa te doorboren met een naald van 19 G.
2. Verdun de microbubbeloplossing door tweestaps 1:5.000 seriële verdunningen uit te voeren door 100 μL microbubbeloplossing toe te voegen aan 5 ml gefilterde stroomoplossing met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 19 G, en vervolgens 100 μL 1:50 verdunde microbubbeloplossing te nemen en met een pipet in een cuvette te pipetteren in 10 ml gefilterde stroomoplossing.
3. Controleer of de elektrolyttank voldoende stroomoplossing heeft en of de afvaltank leeg is.
4. Plaats de cuvette in het coulter counter platform en vergrendel deze op zijn plaats. Gebruik een diafragma van 30 μm voor monsterverwerving.
5. Laad in de software de standaardwerkmethode (SOM) en selecteer vervolgens SOM bewerken | concentratie. Voer 5000x verdunning in.
6. Kies in de software een geschikte bestandsnaam. Bijvoorbeeld microbubble_1_date.
7. Laad en bevestig de cuvette in het platform.
8. Selecteer in de software Uitvoeren| Bekijk een voorbeeld en controleer of de monsterconcentratie lager is dan 10%. Als dit aantal hoger is dan 10%, voer dan een nieuwe verdunning van de microbubbels uit met een hogere verdunningsfactor.
9. Selecteer 'Start' om te beginnen met het verkrijgen van het monster om de eerste uitlezing te verkrijgen.
10. Spoel de opening van de Coulter-teller na elke meting af met een gefilterde stromingsoplossing. Herhaal stap 2.2-2.9 om 3 herhalingen te verkrijgen.
11. Plaats een cuvette met verdunde microbubbeloplossing in een sonicatorwaterbad en soniceer gedurende 30 s.
12. Meet de oplossing met gesonificeerde microbubbels en label als blanco.
13. Trek in de software de uiteindelijke uitlezing af van de eerste uitlezing. Dit trekt alle deeltjes af die geen microbubbels zijn en geen gas bevatten.
14. Selecteer Resultaten weergeven in de software om de microbubbelconcentratie, grootteverdeling, gemiddelde grootte en volumeconcentratie weer te geven.

3. Fluorescerende antilichaametikettering

1. Verkrijg een 1 mg/ml oplossing van muis IgG in PBS zonder toevoegingen.
2. Label 1 mg muis-IgG met AlexaFluor 647 in 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer door de instructies van de fabrikant in de kit te volgen. Deze hoeveelheid fluorescerend gelabeld IgG is voldoende om deze procedure uit te voeren bij 5-7 volwassen muizen waarbij een dosis antilichaam van 5 mg/ kg wordt toegediend.
3. Voeg de kleurstof toe aan de oplossing van IgG in 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Zuiver het fluorescerend gelabelde antilichaam door de antilichaamoplossing in een spinkolom te pipetteren en gedurende 5 minuten bij 1.000 x g te centrifugeren. Vrije kleurstof blijft in het kolombed.
5. Gebruik een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten. Meet de absorptie van de geconjugeerde oplossing bij 280 nm en 650 nm (A280 en A650). Bereken de concentratie van eiwit in het monster met behulp van de vergelijking:
   Eiwitconcentratie (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x verdunningsfactor / 203.000.
6. Gebruik een spectrofotometer om de mate van etikettering te berekenen met behulp van de vergelijking:
   molkleurstof per mol eiwit = A650 x verdunningsfactor / 239 000 x eiwitconcentratie (M).
   OPMERKING: Een aanvaardbare mate van etikettering is 3-7 mol kleurstof per mol eiwit en meestal verkregen mate van etikettering is ongeveer 6.

4. Ultrasone opstelling

1. Voeg met behulp van het gerichte echografiesysteem de afstandhouder van 5 mm toe aan de waterbolus om de ultrasone focus 9 mm onder de bodem van de waterbolus te plaatsen.
2. Vul de waterbolus met ongeveer 300 ml gedeïoniseerd water dat gedurende 20 minuten is ontgast met een inline ontgasser (het zuurstofgehalte moet lager zijn dan 3 ppm). Plaats de ringvormige array in de gevulde waterbolus en gebruik een tandheelkundige spiegel om te controleren of er geen luchtbellen op het oppervlak zijn. Indien aanwezig op het oppervlak, verwijder de ringvormige array en vervang deze in de waterbolus.
3. Start de toepassingssoftware. Selecteer in het menu Golfvorm de optie Golfvormtaakcyclus instellen. Instellingen zijn PRF (Hz) 10, duty cycle 10%, focus 80 mm, center frequency 1 MHz, amplitude (MPa peak negative pressure) 0,65 MPa, mechanische index = 0,65. Druk op Set om de golfvorm te definiëren en op te slaan in het geheugen.
   OPMERKING: Het gerichte echografiesysteem is vooraf gekalibreerd door de fabrikant op basis van metingen die zijn uitgevoerd door een gekalibreerde hydrofoon.
4. Definieer in de software van het gerichte echografiesysteem een behandelplan. Dit vereist het definiëren van een behandelingsgebied dat bestaat uit meerdere individuele behandelingsplaatsen en het definiëren van acties die op elk van die behandelingslocaties moeten worden ondernomen. In dit geval is de behandelingszone één hemisfeer van het muizenbrein.
5. Ga in het bewegingscontrollervenster naar het tabblad Scannen en Voer de waarde start, stop en increment in voor beweging in de x-dimensie in en start, stop en verhoog de waarde voor beweging in de y-richting. Voer waarden in voor X: start -4, stop 3.50 en Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
6. Definieer de acties voor behandelplaatsen. Selecteer in het venster van de bewegingscontroller de knop Gebeurtenis . Selecteer in het venster Scriptbewerking een lijst met acties die worden uitgevoerd in de volgorde die op elke behandelingslocatie is geselecteerd. Stel Bewegingstype in op rasterraster boven aan het scriptvenster. Selecteer op het tabblad Gebeurtenissen de optie Acties toevoegen om ze naar het scriptvenster te verplaatsen en voeg Synchroon verplaatsen, Trigger arb starten , wachten, Trigger arb stoppen toe. Klik op de wachtactie en selecteer een wachttijd van 6.000 ms.
   OPMERKING: Deze instellingen maken van de behandeling een raster van 6 x 5 van behandelingsplekken op een afstand van 1,5 mm uit elkaar, waarbij elke plek een behandelingsduur van 6 s heeft. De totale duur om een muizenbrein te soniceren is ongeveer 3 minuten. Dit formaat behandelingsrooster is geschikt voor volwassen C57/Bl6 muizen met een gewicht van ongeveer 30 g. De grootte van het raster van behandelingsvlekken kan omhoog of omlaag worden aangepast, afhankelijk van de grootte van de muis.

5. Bereiding van dieren

1. Weeg de muis met een balans tot op 0,1 g nauwkeurig.
2. Verdoving muis met 90 mg/kg ketamine en 6 mg/kg xylazine intraperitoneaal. Test op afwezigheid van reflexen met een teenknelpunt. Als alternatief kunnen muizen worden verdoofd met isofluraan met behulp van een geschikt inhalatie-anesthesieapparaat met een geschikt gezichtsmasker. Bij gebruik van isofluraan moet de muis tijdens de echografie op een warmtekussen worden geplaatst om onderkoeling te voorkomen.
3. Gebruik een elektrisch scheermes om het haar van het hoofd van het dier te scheren, breng vervolgens ontharingscrème aan met een wattenstaafje, laat het 2-3 minuten intrekken of totdat het haar is weggeveegd met een vochtig stuk gaas. Zorg ervoor dat de ontharingscrème niet in de ogen van de muis komt.
4. Markeer het midden van het hoofd van de muis met een permanente markering. De transducer heeft een gat in het midden en de focus en brandpuntsplek van de transducer kunnen visueel worden uitgelijnd.
5. Vul een kleine weegboot waarvan eerder de bodem is afgesneden en vervangen door plasticfolie die op de bodem van de weegboot is gelijmd met ultrasone gel. Dit dient als een afstandhouder van 8 mm en biedt een goede koppeling aan de kop van de muis en maakt visuele inspectie mogelijk van de focus van de transducer die is uitgelijnd met de kop van de muis.

6. Microbubbel bereiding

1. Verwarm een injectieflacon met microbubbel tot kamertemperatuur. Om te activeren, voegt u 0,5 ml 0,9% NaCl-oplossing toe aan de injectieflacon en plaatst u deze in een amalgamator om gedurende 45 s te roeren om de microbubbels te produceren.
2. Ontlucht de injectieflacon door de septa te doorboren met een naald van 27 G.

7. Echografie behandeling

1. Keer de injectieflacon met microbubbels om en zuig voorzichtig 1 μL/g lichaamsgewicht van de oplossing op. Voeg hieraan oplossing van fluorescerend gelabeld antilichaam toe en meng voorzichtig in de spuit. Het maximale geïnjecteerde volume is 150 μL.
   OPMERKING: In-house bereide microbubbels zijn ongeveer 60 keer minder geconcentreerd dan de klinisch gebruikte (bijv. Definity microbubbels). Pas het volume of de concentratie zodanig aan dat het aantal geïnjecteerde microbubbels vergelijkbaar is met die welke klinisch worden gebruikt (dwz. Definiteit 1,2 x ¹⁰⁸ microbubbels/kg lichaamsgewicht).
2. Injecteer de microbubbel- en antilichaamoplossing retroorbitaal en zorg ervoor dat u voorzichtig en langzaam injecteert. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan op de ogen van de muis.
3. Plaats de muis in de kophouder (zie Materialentabel) en bevestig de neus van de muis. Plaats vervolgens de met ultrasone gel gevulde kleine weegboot bovenop het hoofd.
4. Laat de waterbolus zakken totdat deze bovenop de ultrasone gel in de weegboot zit.
5. Gebruik de joystick om de focus van de transducer naar het midden van het hoofd te verplaatsen. Selecteer Origin opnieuw instellen op het tabblad Beweging.
6. Selecteer volledige scan. Stap 7.3-7.6 duurt 2 minuten.
7. Stel voor consistentie een timer in om een vertraging van 2 minuten te garanderen tussen het injecteren van microbubbels en het selecteren van de volledige scan.
8. Nadat de behandeling is voltooid, brengt u oogheelkundige zalf aan op de ogen en plaatst u de muis in een verwarmde herstelkamer. Als onderkoeling wordt waargenomen tijdens de procedure, kan een verwarmingskussen onder de muis worden geplaatst om tijdens de procedure extra warmte te leveren.

8. Weefseloogst en -verwerking

1. Op het moment van interesse na echografie (ten minste 1 uur om hoge niveaus van antilichamen in de hersenen te detecteren) verdoven de muis diep met een overdosis Pentobarbitone-oplossing (100 mg / kg) en transcardiaal perfuseren de muis met 30 ml PBS. Een goede perfusie is nodig om specifiek fluorescerend gelabelde antilichamen te detecteren die aan de hersenen zijn afgegeven.
2. Verzamel de hersenen en fixeer door onderdompeling in 4% PFA gedurende 24 uur bij 4 °C en was vervolgens met PBS.
3. Stel de hersenen in een infraroodscanner in beeld door de hersenen op de lade te plaatsen en door een beeld te krijgen in het 700 nm-kanaal.
   OPMERKING: Na fixatie worden de hersenen uit de PFA verwijderd, gewassen in PBS en gesneden. Als alternatief kan het gedurende 24 uur bij 4 °C of tot onderdompeling in ethyleenglycol cryoprotectantoplossing worden geplaatst en vervolgens worden verplaatst naar een nieuwe cryoprotectant bevattende injectieflacon en bij -20 °C worden geplaatst voor langdurige opslag.
4. Sectie de hersenkoude in PBS met behulp van een vibratome. Lijm de hersenen op het platform en snijd 30-40 μm secties en verzamel in PBS.
   OPMERKING: Lysosomale autofluorescentie (veel voorkomend in secties van dieren ouder dan ongeveer 12 maanden) moet worden gebleekt door nachtelijke verlichting van de secties in een lichtkamerdoos, bij kamertemperatuur en in PBS met azide (0,02%) om bacteriegroei te blokkeren.

9. Weefselkleuring en beeldverwerving

1. Breng secties over naar een blokkerende oplossing (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en was vervolgens de secties 3x door de oplossing te vervangen door 0,2% Triton/PBS.
2. Incubeer secties bij 4 °C 's nachts met de primaire antilichamen tegen Iba1 (verdunning 1:1.000) en CD68 (verdunning 1:500), in 0,2% Triton/PBS, gevolgd door 3x wasbeurten met 0,2% Triton/PBS.
3. Incubeer secties gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met fluorescerende secundaire antilichamen (verdunning 1:500), gevolgd door 3x wasbeurten met alleen 0,2% Triton/PBS.
   OPMERKING: De kernen kunnen ook worden gekleurd met BEHULP VAN DAPI-oplossing (0,5 μg / ml).
4. Breng de secties over naar een schuif- en afdekplaat met hard ingestelde montagemedia. Geef het montagemedium voldoende tijd om te stollen voordat u ('s nachts) visualisatie en beeldacquisitie maakt.
5. Met een confocale microscoop verkrijgen z-stack beelden (ten minste 10 μm diepte en 0,3 μm stapgrootte, 10 beelden per dier) van het ultrasone gerichte hersengebied met behulp van een confocale microscoop en een objectief van ten minste 40x vergroting.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u beelden binnen het signaaldynamische bereik maakt en vermijd onder- / overbelichting. Sla de afbeeldingsbestanden op in het bijbehorende softwareformaat dat door de microscoop wordt gebruikt.

10. Beeldanalyse

1. Converteer de z-stack microscopiebestanden met behulp van de bestandsimporteur van de software voor beeldanalyse.
2. Open de geconverteerde bestanden in de software en pas de intensiteit van het Iba1-kanaal aan om microgliale cellen te observeren.
3. Snijd een enkele microgliale cel bij door er een vak omheen te tekenen, selecteer 'bijsnijden' en sla het nieuwe bestand op.
4. Bouw de 3D-oppervlakteweergave van het IBA1-signaal door:
   1. Open het imaris-bestand met één cel dat in de vorige stap is gegenereerd.
   2. Voeg een oppervlak toe aan het bestand.
   3. Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de Iba1-kleuring.
   4. Breng een drempel aan die de Iba1-kleuring moet overlappen
   5. Selecteer alleen de structuur van belang die de microgliale cel van belang vormt
5. Het proces afronden
   1. Verkrijg en registreer het volume van de Iba1-kleuring
   2. Bouw de 3D-oppervlakteweergave van de CD68-kleuring
   3. Maskeer in het subbestand van het IBA1-oppervlak het CD68-kanaal en verwijder de voxels buiten de IBA1-kleuring
   4. Een nieuw oppervlak aan het bestand toevoegen
   5. Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de CD68-kleuring
   6. Breng een drempel aan die de CD68-kleuring moet overlappen en zo goed mogelijk overeenkomt met de kleuringsvolumes
   7. Voltooi het proces, omdat alleen de intra-microgliale CD68-structuren in dit bestand aanwezig zijn en ze dus geen nieuwe drempelfilterstap vereisen
   8. Verkrijg en registreer het aantal en het gemiddelde volume van de CD68 positieve structuren
   9. Bereken het relatieve volume van CD68-structuren volgens de overeenkomstige IBA1-structuren als een maat voor microgliale activering in een fagocytische toestand.

Resultaten

Met behulp van dit protocol worden fluorescerend gelabelde antilichamen aan de hersenen afgegeven en kunnen ze worden gedetecteerd, samen met microglia-activering. De conclusie die kan worden getrokken, is dat het gebruik van gerichte echografie en microbubbels de opname van antilichamen in de hersenen aanzienlijk verbetert en antilichamen kan leveren aan de hele hersenen of hemisfeer van een muis bij gebruik in een scanmodus. Figuur 1 toont het TIPS-apparaat voor echografie (verschillende c...

Discussie

Fluorescerend gelabelde antilichamen kunnen aan de hersenen worden geleverd met behulp van gerichte echografie samen met microbubbels die in een scanmodus worden toegepast. Antilichaamafgifte, microgliale morfologie en lysosomale vergroting kunnen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie na scanning echografie. Microglia kunnen in hun lysosomen antilichamen en antigenen opnemen waaraan de antilichamen zich hebben gebonden in een Fc-receptor-gemedieerd ^proces4.

...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti	850365C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
CD68 antibody	AbD Serotec	MCA1957GA	Gebruik 1:1000 verdunning
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Coulter Counter (Multisizer 4e)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Gebruik 1:500 verdunning
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Gebruik 1:500 verdunning
Head holder (model SG-4N, Narishige Japan)
Iba1 antibody	Wako	019-19741	Gebruik 1:1000 verdunning
Image analysis software	Beckman Coulter	#8547008
Isoflow flow solution	Beckman Coulter	B43905
Near infrared imaging system Odyssey Fc	Licor	2800-03
Octafluoropropane	Arcadophta	0229NC
Propylene Glycol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Therapy Imaging Probe System)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane