Methodenartikel

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

DOI:

10.3791/61376

⸱

5 augustus 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymicrobiële gemeenschappen zijn alomtegenwoordig van aard, maar het bestuderen van hun interacties op eencellig niveau is moeilijk. Zo is een op microscopie gebaseerde methode ontwikkeld voor het observeren van interspecies interacties tussen twee bacteriële pathogenen. Het gebruik van deze methode om interacties tussen een motile Gram-negatieve ziekteverwekker, Pseudomonas aeruginosa en een niet-motile Gram-positieve ziekteverwekker te ondervragen, staphylococcus aureus wordt hier aangetoond. Dit protocol bestaat uit co-inenting van elke soort tussen een coverslip en een agarose pad, die de cellen in een enkel vlak onderhoudt en zorgt voor visualisatie van bacterieel gedrag in zowel ruimte als tijd.

Bovendien is de hier aangetoonde time-lapse microscopie ideaal voor het visualiseren van de vroege interacties tussen twee of meer bacteriële soorten, waaronder veranderingen in de beweeglijkheid van bacteriële soorten in monocultuur en in cocultuur met andere soorten. Vanwege de aard van de beperkte monsterruimte in de microscopie-opstelling is dit protocol minder van toepassing voor het bestuderen van latere interacties tussen bacteriële soorten zodra de celpopulaties te hoog zijn. Echter, er zijn verschillende toepassingen van het protocol die het gebruik van kleuring voor beeldvorming levende en dode bacteriële cellen, kwantificering van gen- of eiwitexpressie door fluorescerende verslaggevers, en het bijhouden van bacteriële celbeweging in zowel enkele soorten en multispecies experimenten omvatten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polymicrobiële gemeenschappen komen vaak voor in de natuur, verspreid over een verscheidenheid vanmilieu-1,2,3 en menselijke niches4,5. Enkele van de meest beruchte polymicrobiële infecties bij menselijke ziekte zijn tandheelkundige biofilms6, chronische wonden7,8, en luchtweginfecties bij personen met chronische obstructieve longziekte9, beademingsgerelateerde longontsteking10, en de genetische ziekte cystische fibrose (CF)11,12. Deze infecties bestaan vaak uit diverse microbiële soorten; echter, een recente focus op de interacties tussen de Gram-positieve bacterie Staphylococcus aureus en de Gram-negatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa is ontstaan. Studies met inbegrip van patiënten die met deze organismen zijn besmet en in vitro-analyses onthullen zowel concurrerende als coöperatieve interacties die diepgaande en onverwachte invloeden kunnen hebben op de progressie van de ziekte, microbiële overleving, virulentie, metabolisme en antibioticagevoeligheid (in detail beoordeeld door Hotterbeekx et al. 201713 en Limoli en Hoffman 20193).

De groeiende interesse in interspecies interacties tijdens infectie heeft een verscheidenheid aan methoden opgeleverd voor het bestuderen van polymicrobiële gemeenschap gedrag. Typisch, deze studies hebben gebruikt plaat of bouillon-gebaseerde tests om de fenotypische verschillen tussen monocultuur en cocultuur te onderzoeken. Bijvoorbeeld, coculturing P. aeruginosa en S. aureus op vaste oppervlakken heeft toegestaan voor visualisatie van groeiremming of veranderingen in kolonie fenotype, pigment, of polysaccharide productie14,15,16. Gemengde soorten biofilms, op biotische of abiotische oppervlakken, evenals het coculeren van bacteriële soorten in vloeibare cultuur heeft het ook mogelijk gemaakt meting van veranderingen in groei, metabolisme, antibioticatolerantie, concurrentie en levensvatbaarheid, naast gen- en eiwitexpressie17,18. Hoewel deze bulkcultuurexperimenten inzicht hebben verwezen in hoe P. aeruginosa en S. aureus elkaar op gemeenschapsschaal zouden kunnen beïnvloeden, zijn ze niet in staat om belangrijke vragen te beantwoorden over de interacties die plaatsvinden op eencellig niveau. De hier gepresenteerde methode draagt bij aan de benaderingen voor het bestuderen van interspecies interacties door zich te concentreren op de veranderingen in beweging, cel levensvatbaarheid, en genexpressie van enkele cellen binnen een cocultured gemeenschap in de tijd.

Single-cell interacties kunnen sterk verschillen van de interacties die plaatsvinden in een bulk gemeenschap van cellen. Door middel van eencellige analyse kan heterogeniteit binnen een gemeenschap worden gekwantificeerd om te bestuderen hoe ruimtelijke plaatsing van cellen de dynamiek van de gemeenschap beïnvloedt of hoe gen- en eiwitexpressieniveaus veranderen binnen individuele leden van een groep. Het bijhouden van cellen kan ook inzicht geven in hoe afzonderlijke cellen zich in de loop van de tijd bewegen en zich gedragen, door meerdere generaties heen. Door het gelijktijdig bijhouden van celbeweging en veranderingen in genexpressie, kunnen correlaties worden gemaakt tussen genschommelingen en overeenkomstige fenotypen. Eerdere protocollen voor het bestuderen van individuele bacteriële soorten op eencellig niveau zijn beschreven. Deze studies maken gebruik van live-imaging cellen in de tijd in een enkel vlak, en zijn nuttig geweest voor het observeren van fenotypes zoals celdeling en antibiotica gevoeligheid19,20. Extra live-imaging microscopie is gebruikt om de groei, beweeglijkheid, oppervlaktekolonisatie en biofilmvorming van enkele bacteriële soorten21,22,23te monitoren . Echter, terwijl deze studies zijn inzichtelijk voor het begrijpen van de fysiologie van bacteriën in monocultuur, experimenten voor het observeren van eencellige gedrag van meerdere bacteriële soorten na verloop van tijd in cocultuur zijn beperkt.

Hier zijn eerdere protocollen die worden gebruikt voor beeldvorming met één soort aangepast om de interacties tussen P. aeruginosa en S. aureuste bestuderen. Deze organismen kunnen onder fasecontrast worden onderscheiden op basis van hun celmorfologieën(P. aeruginosa zijn bacillen en S. aureus zijn cocci). De ontwikkeling van deze methode maakte onlangs de visualisatie van eerder onbeschreven beweeglijkheidsgedrag van P. aeruginosa in aanwezigheid van S. aureus24mogelijk . P. aeruginosa bleek S. aureus van een afstand te kunnen waarmaken en te reageren met verhoogde en directionele eencellige bewegingen naar clusters van S. aureus-cellen. P. aeruginosa beweging naar S. aureus bleek het type IV pili (TFP), haar-achtige projecties waarvan de gecoördineerde uitbreiding en intrekking genereren een beweging genaamd trillende beweeglijkheid25vereisen .

Deze studies tonen het nut van deze methode voor het ondervragen van eerdere interacties tussen soorten. Beeldvorming bij hoge celdichtheden op latere interactietijdpunten is echter moeilijk, aangezien afzonderlijke lagen cellen niet meer kunnen worden geïdentificeerd, wat meestal problemen oplevert tijdens analyse na de beeldvorming. Gezien deze beperking is de methode het meest geschikt voor eerdere interacties die vervolgens kunnen worden opgevolgd met traditionele macroscopische tests bij hogere celdichtheden die representatief zijn voor latere interacties. Bijkomende beperkingen van deze methode zijn de lage doorvoer, omdat slechts één monster tegelijk kan worden afgebeeld en de kosten van de microscoop, camera en milieukamer. Bovendien vormt fluorescentiemicroscopie risico's voor de bacteriële cellen zoals fototoxiciteit en fotobleaching, waardoor de frequentie wordt beperkt dat fluorescentiebeelden kunnen worden verkregen. Ten slotte zijn de agarosepads die bij deze methode worden gebruikt zeer gevoelig voor veranderingen in de omgeving, waardoor het van cruciaal belang is om te controleren op omstandigheden zoals temperatuur en vochtigheid, gezien het feit dat de pads kunnen beginnen te krimpen of uit te breiden als de omstandigheden niet correct zijn. Ten slotte, terwijl deze methode niet na te bootsen de gastheer omgeving, het biedt aanwijzingen voor hoe verschillende bacteriële soorten reageren op oppervlakken, die kunnen worden opgevolgd in tests ontworpen om milieu / gastheer voorwaarden na te bootsen.

Deze methode verschilt van eerdere studies bijhouden van eencellige beweging, in die zin dat cellen worden ingeënt tussen een coverslip en agarose pad, beperking van cellen aan het oppervlak. Dit maakt celtracking na verloop van tijd in één vlak mogelijk; beperkt echter cycli van tijdelijke oppervlaktebetrokkenheid waargenomen wanneer cellen worden ondergedompeld in vloeistof26. Een bijkomend voordeel van beeldvorming bacteriën onder een agarose pad is dat het bootst macroscopische plaat-gebaseerde sub-oppervlakte inenting testen klassiek gebruikt om P. aeruginosa trillende beweeglijkheid25onderzoeken . In deze test worden bacteriële cellen ingeënt tussen de bodem van een petrischaaltje en de agar, waardoor de cellen in één vlak blijven terwijl ze over de bodem van de schotel naar buiten bewegen vanaf het punt van inenting, net als dit microscopieprotocol.

De time-lapse microscopie protocol voor het visualiseren van interspecies interacties hier gepresenteerd bestaat uit 1) de voorbereiding van de bacteriële monster en agarose pad, 2) het selecteren van microscoop instellingen voor imaging acquisitie en 3) post-imaging analyse. Gedetailleerde visualisatie van celbeweging en tracking kan worden uitgevoerd door het verwerven van beelden op korte tijdsintervallen op fasecontrast. Fluorescentie microscopie kan ook worden gebruikt om cel levensvatbaarheid of genexpressie te bepalen na verloop van tijd. Hier tonen we een voorbeeld van aanpassing voor fluorescentie microscopie door de toevoeging van levensvatbaarheid kleurstoffen aan de agarose pads.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Een volledige beschrijving en catalogusnummers voor alle benodigdheden in dit protocol zijn te vinden in de tabel met materialen.

1. Voorbereiding van m8t minimale media

  1. Bereid 1 L M8 minimale zouten basis (5x) door het oplossen van 64 g na2HPO4·7H2O, 15 g KH2PO4, en 2,5 g NaCl in 800 mL ultrazuiver water (UPW, resistivity 18 MΩ/cm) in een 2 L fles. pH tot 7,6. Compleet volume tot 1 L met UPW. Autoclave voor 45 min.
  2. Bereid 500 mL van een glucoseoplossing (20% w/v) voor door 100 g glucose in 400 mL UPW op te lossen in een 1 L-fles. Complete oplossing tot 500 mL met UPW. Autoclave voor 45 min.
  3. Bereid 500 mL van een tryptone oplossing (20% w/v) voor door 100 g tryptone op te lossen in 400 mL UPW. Compleet tot 500 mL met UPW. Autoclave voor 45 min.
  4. Bereid 1 L M8 + 10% tryptone (M8T) minimale media door toevoeging van 200 mL van 5x M8 minimale zouten (1x finale), 10 mL van 20% glucose (20% glucose (20 0,2% finale), 1 mL van 1 M MgSO4 (1 mM finale) en 50 mL van 20% tryptone (1% finale) tot 600 mL UPW. Compleet tot 1 L met UPW. Filtreer door een 0,2 μm steriel filter in een steriele 500 mL media-opslagfles.

Dag 1:

2. Voorbereiding van bacteriële nachtelijke culturen

  1. Inenting 5 mL ML van M8T minimale media met een enkele kolonie P. aeruginosa of S. aureus (inclusief antibiotica indien van toepassing) en incubeer 's nachts bij 37 °C met beluchting voor niet langer dan 16 uur.
    OPMERKING: De bacteriële pathogenen P. aeruginosa en S. aureus werden gebruikt voor deze methode, omdat ze vaak worden gecoisoleerd door chronische infecties, en het bestuderen van hun interacties is belangrijk om te begrijpen hoe ze bijdragen aan de resultaten van de patiënt tijdens polymicrobiële infecties. Andere bacteriële soorten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de focus van de studie.

Dag 2:

3. Subcultuur van bacteriële stammen

  1. Subcultuur P. aeruginosa 1:500 en S. aureus 1:1000 in 5 mL verse M8T (inclusief antibiotica indien van toepassing). Incubeer met beluchting bij 37 °C tot culturen halverwege de logfase bereiken (OD600 = ~0,3 - 0,5).

4. Bereiding van materialen voor padmatrijzen

  1. Bereid metalen spatels door het verwarmen van het einde van een platte, afgeronde laboratorium spatel met een Bunsen brander tot de helft van het vlakke uiteinde kan worden gebogen tot een hoek van 90 °. Verwarm het uiteinde van een andere vlakke, afgeronde laboratoriumspatel en buig de laatste 10 mm lichtjes tot een hoek van 45 °C.
  2. Snijd de vier hoeken van de siliconen mallen af, zodat de mallen in een schaal van 35 mm passen.
  3. Steriliseer de spatels en een pincet door 70% ethanol toe te voegen en ze door de vlam van de Bunsen brander te laten gaan.
  4. Maak de schaal en siliconen mallen schoon met 70% ethanol en droog ze met pluisvrije doekjes.

5. Bereiding van agarosepads

OPMERKING: De pads worden bereid met de M8T minimale media als voedingsbron voor de bacteriën die in dit protocol worden gebruikt. Echter, de voedingsstoffen die worden gebruikt in de pads kan worden gewijzigd voor verschillende organismen.

  1. Smelt 2% laag-smelt agarose in 10 mL van M8T in een schone 50 mL Erlenmeyer kolf. Magnetron in korte intervallen (2-5 s) tot de agarose in oplossing is om te voorkomen dat de inhoud van de kolf overkookt. Eenmaal gesmolten, laat afkoelen in een 50 °C waterbad gedurende ten minste 15 minuten.
  2. Bereid mallen door het uitlijnen van de siliconen uitspatel met de opening in de 35 mm schotel en tik licht met spatel om de siliconen vast te stellen aan de schotel, en om alle luchtbellen te verwijderen tussen de mal en de schotel.
  3. Eenmaal koel, pipet 915 μL gesmolten agarose in de mal. Laat het deksel op een kier staan en laat het pad 30 minuten drogen op kamertemperatuur.
  4. Bedek de schotel met het deksel en laat op kamertemperatuur voor een extra 2 uur.
  5. Bereid vochtigheidsdoekjes voor door een pluisvrij doekje stevig op te rollen. Plaats het opgerolde doekje in een steriele petrischaal en voeg gelijkmatig 500 μL steriel water over het doekje. Warm tot 37 °C voor 1 uur.
  6. Verwarm de pad en een steriele schotel van 35 mm tot 37 °C gedurende 1 uur.

6. Bereiding van bacteriële cellen en inentijverpads

  1. Meet de OD600 van elke subcultuur en verdun P. aeruginosa tot een OD600 = 0,03 en S. aureus tot een OD600 = 0,10 in M8T voorverwarmd tot 37 °C. Meng P. aeruginosa en S. aureus in een 1:1 verhouding en vortex.
    OPMERKING: Als stammen antibiotica nodig hebben, kunnen de antibiotica worden toegevoegd aan de nacht- en subcultuur, maar mogen ze niet worden toegevoegd bij het mengen van soorten voor beeldvorming als het de andere soorten in de cocultuur beïnvloedt. Voor elk organisme/plasmide dat wordt gebruikt, moeten de stabiliteit van plasmiden en de effecten van antibiotica op alle soorten in de cocultuur worden bepaald.
  2. Pipette 1 μL cocultuur gelijkmatig over de bodem van een voorverwarmde, steriele 35 mm glazen coverslip schotel.
  3. Verwijder de siliconen uitsnede uit de mal met behulp van steriele pincet.
  4. Haal het pad uit de schaal met steriele spatels.
    1. Schuif de licht gebogen spatel onder de rand van het pad, terwijl de mal ondersteboven, om het uit te laten vallen op een steriele petriplaat deksel.
      LET OP: Zorg ervoor dat u het pad niet forceert of het zal scheuren. Houd bij welke kant van de pad de onderkant is.
  5. Breng de pad naar de schotel met de bacteriële cellen, bottom-side-down, door het schuiven van de 90 ° schuine spatel onder het pad en het plaatsen van het op de top van de ingeënte coverslip. Gebruik de 90° schuine spatel om de pad tegen de coverslip te laten spoelen en druk de luchtbellen voorzichtig uit.
  6. Verwijder overtollig vocht uit vochtige doekjes en plaats vervolgens rond de rand van de schotel, zodat het pad niet raakt. Het monster is nu klaar voor beeldvorming.

7. Het opzetten van de microscoop voor live beeldvorming

  1. Warme milieukamer tot 37 °C ten minste 2 uur voorafgaand aan de experimentele opstelling.
  2. Schakel alle componenten in, waaronder microscoop-, computer- en lichtbronnen voor brightfield- en fluorescentiebeeldvorming.
  3. Open de beeldsoftware en zorg ervoor dat lichtbronnen zijn aangesloten en uitgevoerd.
  4. Voer Köhler-verlichting27 uit om alle beeldvlakken uit te lijnen.
    1. Ten eerste, breng gemarkeerde coverslip in beeld met een 20x doelstelling met behulp van een "dummy" schotel. Zorg ervoor dat de condensor toren is ingesteld op de "open" positie.
      OPMERKING: Köhler-verlichting moet worden uitgevoerd voor elke unieke doelstelling/monster om beeldvlakken goed uit te lijnen. Echter, focus en afstemming met de "dummy" schotel op lagere vergroting versnelt set-up op live monsters bij een hogere vergroting om de tijd tussen de set-up en experiment starttijd te beperken.
    2. Richt de condensor.
      1. Sluit het velddiafragma.
        OPMERKING: Er moet een achthoekvormig diafragma verschijnen. Als de condensor volledig onscherp is, wordt het hele gezichtsveld (FOV) donker weergegeven.
      2. Draai de scherpstelknoppen van de condensor tot de achthoekranden scherp zijn.
        OPMERKING: De lichtintensiteit neemt toe naarmate de beeldvlakken de juiste uitlijning naderen.
    3. Lijn de condensor uit.
      1. Centreer de veldcondensor door de uitlijnende knoppen aan te passen.
        OPMERKING: De achthoek moet gecentreerd zijn naar het midden van de FOV. De uitlijnknoppen verschillen afhankelijk van de microscoop. Sommige microscoopcondensors hebben bijvoorbeeld knoppen, terwijl andere schroeven hebben waarvoor een schroevendraaier nodig is.
    4. Focus de lampgloeidraad en pas het condensatoropening aan.
      1. Plaats een fase telescoop of Bertrand lens in het licht pad om de achterkant brandpuntsvlak van het doel te observeren.
        OPMERKING: Er moeten twee concentrische cirkels zijn.
      2. Draai de Bertrand lens focus knop totdat de ringen er helder uitzien.
      3. Verwijder de Bertrand lens van het lichtpad.
    5. Open het velddiafragma tot de achthoek net buiten de FOV ligt.
    6. Verander naar de 100x doelstelling en schuif de bijpassende fasering op zijn plaats voordat je een druppel onderdompelingsolie toevoegt en plaats de bereide monsterschotel erop.
    7. Voer Köhler verlichting uit op de 100x doelstelling met de bacteriële monsterschotel.
  5. Focus op de bacteriën met behulp van de fijne aanpassing alleen. Zodra de bacteriën in de FOV zijn gericht door het oculair, schakel het licht pad naar de camera door te drukken op de cameraknop op de microscoop.
  6. Klik op de optie Fase in de beeldsoftware.
  7. Pas het percentage DIA LED-licht dat wordt uitgezonden aan door de lichtbron in de software te selecteren en het gewenste lichtpercentage handmatig in te voeren of de balk op de lichtpercentageschaal te schuiven.
  8. Pas de dia-led-lichtbelichtingstijd aan door op de lichtbron te klikken en handmatig de gewenste belichtingstijd in te voeren of een belichtingstijd te selecteren in het meegeleverde vervolgkeuzemenu.
    LET OP: De belichtingstijd is afhankelijk van de camera die wordt gebruikt.
  9. Bij gebruik van fluorescentie, pas de camera-instellingen in elk overeenkomstig kanaal (dat wil zeggen, TxRed, GFP), door te klikken op het fluorescerende kanaal van belang.
    1. Stel het percentage uitgestraalde fluorescentielicht in en pas vervolgens de belichtingstijd aan (zoals uitgevoerd in de stappen 7.7 en 7.8 voor DIA-LED-licht).
    2. U ook de bitdiepte wijzigen om het dynamisch bereik aan te passen door een van de andere bitdiepteopties in het vervolgkeuzemenu visualisatiebesturingselementen te selecteren.
  10. Kies de XY-posities van belang door op de optie XY te klikken in het menu aankoopbesturingselementen.
    1. Verplaats de podiumpositie met de joystick of door op de FOV op het scherm te klikken en te slepen en klik op het lege vak om de X- en Y-coördinaten van een specifieke positie op te slaan.
      OPMERKING: Selectie van niet meer dan drie verschillende XY-posities, zo dicht mogelijk bij elkaar, wordt aanbevolen voor time-lapse acquisitie.
  11. Schakel het perfecte focussysteem (PFS) in door op het PFS-vak op het XY-tabblad van het aankoopbesturingselementmenu te klikken of op de PFS-knop op het bedieningspaneel van de joystick te drukken.
  12. Draai de fijne verstelknoppen om zich te concentreren op de bacteriële cellen.
  13. Klik op de PFS-knop voor elke XY-positie, zodra de cellen zich in het gewenste scherpstelvlak bevinden.
    OPMERKING: PFS compenseert drift in de Z-as tijdens time-lapse experimenten. Dit is nodig om de focus van bacteriële cellen na verloop van tijd te behouden. Verschillende fabrikanten hebben verschillende compensatiesystemen.
  14. Kies de voorwaarden voor het verkrijgen van afbeeldingen, inclusief acquisitieinterval en frequentie voor elk kanaal (bijvoorbeeld fasecontrast en elke fluorofofoër) door te selecteren uit de opties in het menu acquisitiebesturingselementen.
    OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde experimenten worden fasecontrastbeelden met tussenpozen om de 5-10 s verworven, terwijl fluorescentiebeelden in de GFP- en TxRed-kanalen elke 20 minuten worden verworven.
  15. Begin met beeldvorming zodra de microscoop- en acquisitie-instellingen zijn ingesteld.

8. Optioneel: Wijzigingen voor live/dead imaging

  1. Smelt 2% agarose in 10 mL M8T en laat afkoelen in 50 °C waterbad gedurende ten minste 15 min.
  2. Voeg 1 mM propidiumjodide toe aan de gesmolten agarose.
  3. Eenmaal afgekoeld, pipet 915 μL van agarose in de voorbereide mal.
  4. Laat het deksel op een kier en laat pad droog op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Bescherm tegen licht.
  5. Bedek de schotel met het deksel en laat op kamertemperatuur voor een extra 2 uur.
  6. Bereid vochtigheidsdoekjes voor.
    1. Rol een pluisvrij papier goed op.
    2. Leg het doekje in een steriele petrischaal en voeg 500 μL steriel water toe aan het doekje.
    3. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
  7. Broed het pad en een steriele schotel van 35 mm bij 37 °C gedurende 1 uur.
  8. Ga over tot het inenten van de schotel zoals aangegeven in sectie 6: Voorbereiding van bacteriële cellen en inenting pads.

9. Gegevensanalyse

  1. Identificatie van cellen
    1. Open afbeeldingsbestand in de beeldsoftware en snijd het bestand bij om alleen de frames op te nemen die moeten worden gebruikt voor het bijhouden, ingezoomd op de cellen van belang en alleen in het fasecontrastkanaal.
      OPMERKING: Het bijgesneden bestand kan worden opgeslagen als een nieuw bestand waarin trackinggegevens kunnen worden opgeslagen zonder het oorspronkelijke bestand te verstoren.
    2. Selecteer de optie om interessegebieden (ROI) te kiezen in het menu analysebesturingselementen en definieer ROI's door afzonderlijke bacteriële cellen of clusters van cellen in het eerste frame te traceren die voor analyse moeten worden gebruikt.
      OPMERKING: De ROI's kunnen handmatig of als binaire bestanden worden gedefinieerd.
      1. Roi handmatig definiëren
        1. Traceer de omtrek van elke afzonderlijke bacteriële cel of clusters van cellen om handmatig de ROI's te definiëren.
          OPMERKING: In de analysesoftware kan P. aeruginosa, of andere staafvormige cellen, handmatig worden getraceerd door de Ovlipse ROI te selecteren en een ellips te tekenen die is aangepast aan de grootte van de bacteriële cel. Als alternatief kan de optie Veelhoek ROI worden geselecteerd om niet-traditioneel gevormde ROI's te traceren, zoals clusters van cellen.
      2. Binaire ROI's identificeren
        1. Klik op de optie Binair naar ROI om binaire ROI's te definiëren.
          OPMERKING: Objecten worden gedefinieerd in een binaire laag op basis van de scheiding van de donkerder korrelige bacteriële cellen van de lichtere korrelige achtergrond in het contrastkanaal voor de fase.
        2. Als u de cellen wilt drempelwaarden, selecteert u de optie Drempel in het menu analysebesturingselementen. Selecteer het interessekanaal en schuif de balken in het fluorescentie-histogram om de drempelintervalwaarden aan te passen.
          OPMERKING: Binaire objectidentificatie voor ROI's kan ook worden gedefinieerd in fluorescerende beelden door de bacteriële cellen te thresholderen. Drempels bepalen welke fluorescentieintenten als objecten worden beschouwd en welke fluorescentieintentensiteiten de achtergrond vormen.
  2. Celtracking
    1. Als u ROI's handmatig wilt volgen, selecteert u het volgende frame in de beeldvolgorde en past u de positie van de ROI's aan door op elke ROI te klikken en te slepen om uit te lijnen met de nieuwe positie van de oorspronkelijke bacteriële cel.
      OPMERKING: Als de bacteriële cellen niet van positie zijn veranderd, hoeven de ROI's niet te worden verplaatst.
    2. Herhaal dit in alle opeenvolgende frames waarvoor cellen moeten worden bijgehouden.
    3. Als cellen zich verdelen, definieert u de dochtercellen als nieuwe ROI's, zoals beschreven in stap 9.1, en begint u met het bijhouden van de nieuw verdeelde cellen.
      OPMERKING: Als cellen worden geïdentificeerd als binaire bestanden, gebruikt u de functie Binaries bijhouden om ROI's in geselecteerde frames automatisch bij te houden.
    4. Zodra cellen zijn bijgehouden via alle geselecteerde frames, exporteert u de gegevens die moeten worden geanalyseerd.
    5. Open de gegevensspreadsheet en identificeer de metingen die nodig zijn voor analyse (d.w.z. objectsnelheid, versnelling of padlengte).
      OPMERKING: Bij het meten van de richtingsgezindheid zijn de metingen van de padlengte en de lijnlengte vereist. De lijnlengte is een meting van de Afstand van Euclidian, of de rechte afstand van de spooroorsprong aan de rand van de kolonie S. aureus. De padlengte is een meting van de geaccumuleerde afstand of de som van spoorsegmenten van alle frames. De richting kan worden berekend als een verhouding van de Afstand euclides, D(E), (Lijnlengte), over de geaccumuleerde afstand, D(A), (Lengte van het pad).
  3. Fluorescentie kwantificering
    1. Definieer ROI's voor fluorescerende bacteriële cellen zoals beschreven in stap 9.1.
    2. Herhaal tracering of beweging van ROI's voor bacteriële cellen of clusters in de resterende fluorescerende frames.
    3. Exporteer de gegenereerde tabel naar een spreadsheetbestand voor analyse van fluorescerende intensiteit.
    4. Zoek in de gegevensspreadsheet naar de kolom met 'Gemiddelde intensiteit' die de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de getraceerde bacteriële cel(s) ROI vertegenwoordigt.
    5. Grafiek de gemiddelde intensiteit waarden om te kijken naar de veranderingen in fluorescentie in de tijd.
      OPMERKING: De veranderingen in fluorescentie in de tijd vertegenwoordigen de fluctuatie van genexpressie voor het fluorescerende gelabelde gen van belang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvol gebruik van de beschreven methode zal resulteren in een reeks frames die een video genereren waarin de interspecies interacties kunnen worden waargenomen in de tijd. Het schema in figuur 1 geeft een visuele weergave om de belangrijkste stappen te benadrukken die betrokken zijn bij het voorbereiden van materialen voor beeldvorming. Het gebruik van deze methode heeft toegestaan de demonstratie van P. aeruginosa cellen vertonen verschillende gedragingen in monocultuur versus ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methoden beschrijven een protocol voor live-cel beeldvorming van bacteriële soorten interacties op het niveau van eencellige met wijzigingen voor andere toepassingen, waaronder celtracking en monitoring van de levensvatbaarheid van cellen. Deze methode opent nieuwe wegen voor het bestuderen van eencellig gedrag van micro-organismen in cocultuur met andere soorten in de tijd. Specifiek, het protocol toont het nut van deze cocultuur methode in het observeren van bacteriële oppervlakte gedrag, met nam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Cystic Fibrosis Foundation Postdoc-to-Faculty Transition Award LIMOLI18F5 (DHL), Cystic Fibrosis Foundation Junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL) en NIH T32 Training Grant 5T32HL007638-34 (ASP). Wij danken Jeffrey Meisner, Minsu Kim, en Ethan Garner voor het delen van de eerste protocollen en advies voor beeldvorming en het maken van pads.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose pads
35 mm Glass Bottom Dish met 20 mm Micro-well #1.5 Cover GlassCellvisD35-20-1.5-NEen voor agarose pad molds, een voor experiment
KimWipesKimberly-Clark Professional06-666A
Low-Melt AgaroseNu-Sieve GTG/Lonza50081Voor het maken van agarose pads
Rond-bodem SpatelsVWR82027-492
Rond-versmallende SpatelsVWR82027-530
Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesiveSigma-AldrichS6685-25EAVoor agarose pad molds
Steriele Petri Plates, 85 mmKord-Valmark /sold by RPI2900
PincetVWR89259-944
M8T Minimal Media
D (+) GlucoseRPIG32045
KH2PO4RPIP250500
MgSO4Sigma-Aldrich208094
NaClRPIS23025
Na2HPO4.7H2OSigma-Aldrich230391
TryptoneBD BiosciencesDF0123173
Microscoop
Andor Sona 4.2B-11Andor77026135Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount.
Filter Cube GFPNikon96372Filter cube
Filter Cube TxRedNikon96375Filter cube
H201-NIKON-TI-S-EROkolab77057447Stagetop incubator
Nikon NIS-Elements AR met GA3 en 2D en 3D trackingNikon77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950Software voor data-analyse
Nikon Ti2 EclipseNikonModel Ti2-EMicroscoop
CFI Plan Apo ƛ20x objectief (0.75NA)NikonMRD00205Objectief
CFI Plan Apo ƛ100x olie Ph3 DM objectief (1.45NA)NikonMRD31905Objectief
ThermoBox met ingebouwde ventilator verwarmingTokai HitTI2TB-E-BKOmkasting
Bacteriestammen
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)PMID: 7604262Niet-mucoïde prototroof
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)PMID: 23404398USA300 CA-Methicilline resistente stam LAC zonder plasmiden
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC ΔagrBDCAPMID: 31713513
Viabiliteitskleuring
Propidium JodideInvitrogenL7012LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacteriële Viabiliteits Kit

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
  2. Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
  3. Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
  4. Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
  6. Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
  7. Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
  8. Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
  9. Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
  10. Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232(2014).
  11. Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
  12. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
  13. Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
  14. Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
  15. Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
  16. Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56(2015).
  17. Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
  18. Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
  19. Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
  20. Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976(2018).
  21. Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
  22. Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
  23. Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
  24. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365(2019).
  25. Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
  26. Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
  27. Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tracking van individuele cellentime lapse microscopiePseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusbereiding van agarosepadsfluorescentie imagingkleuring van celviabiliteitgenexpressieanalysekwantificering van motiliteit

Gerelateerde artikelen