Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61388

⸱

14 november 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Samenvatting

Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel, wat leidt tot zuurstof- en glucosedeprivatie, en het daaruit voortvloeiende neuronale verlies. Tal van aanwijzingen dat de interactie tussen glia- en neuronale cellen gunstige effecten uitoefent na een ischemische gebeurtenis. Daarom, om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen. Hierin presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van de rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke cultuur media, maakt de oprichting van neuron- of astrocyten verrijkt culturen of neuron-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid.

Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor op basis van een co-cultuursysteem waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multiwellplaten. De twee culturen worden gescheiden gehouden door kleine paraffinebollen. Deze aanpak maakt het mogelijk de onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandelingen op elk celtype, die een voordeel in veel studies vertegenwoordigt.

Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.

Inleiding

Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies2,3.

Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn betrokken bij de pathofysiologie van de ischemische beroerte4. In het bijzonder, astrocyten zijn essentieel voor het onderhoud van neuronen en onlangs bleek een cruciale rol te spelen in de reactie op de ischemische laesie5. Dit type gliacel vervult functies van structurele ondersteuning, verdediging tegen oxidatieve stress, synthese van neurotransmitters, stabilisatie van celcelcommunicatie, onder andere6. Samen met neuronen, astrocyten spelen een directe rol in synaptische transmissie, het reguleren van de afgifte van moleculen zoals adenosine triphosfat, gamma-aminoboterzuur en glutamaat7. Een deel van de schade veroorzaakt door ischemie wordt veroorzaakt door de overmatige afgifte van glutamaat en de accumulatie ervan op de synaptische kloof, wat leidt tot de overactivatie van N-methyl-D-aspartaatreceptoren, het activeren van downstream signaalcascades, wat uiteindelijk resulteert in excitotoxiciteit8. Aangezien astrocyten glutamaat uit de synaptische kloof kunnen verwijderen en omzetten in glutamine, zijn ze cruciaal in het verdedigen tegen excitotoxiciteit, waardoor een neuroprotectief effect op ischemie wordt uitgeoefend. Deze cellen spelen ook een rol in ischemie-geïnduceerde neuro-ontsteking. Na de ischemische belediging ondergaan geactiveerde astrocyten morfologische veranderingen (hypertrofie), vermenigvuldigen, en tonen een toename van de gliafibrillaire zure eiwit (GFAP) expressie. Ze kunnen reactief worden (astroglise), het vrijgeven van pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrose factor-α, interleukine-1α en interleukine-1β, en het produceren van vrije radicalen, waaronder stikstofmonoxide en superoxide, die op hun beurt kan leiden tot neuronale dood9,10. In tegenstelling, reactieve astrocyten kunnen ook een neuroprotectief effect spelen, omdat ze ontstekingsremmende cytokinen afgeven, zoals het transformeren van groeifactor-β, die na beroerte11upgereguleerd is. Bovendien kunnen ze een glialitteken genereren, dat weefselregeneratie kan beperken door het remmen van axonale kiemen; dit glialitteken kan echter de letselplaats isoleren van levensvatbaar weefsel, waardoor een trapsgewijze golf van ongecontroleerde weefselschade12,13wordt voorkomen .

Zo is het noodzakelijk om modellen vast te stellen die het mogelijk maken het bestuderen van neuron-glia interacties onder een ischemische schade om therapeutische strategieën die beperken of omkeren van de effecten van ischemische letsel te vinden. In vergelijking met andere modellen die worden gebruikt om ischemische letsel te bestuderen, namelijk in vivo modellen14,15,16, organotypic culturen17,18,19 en acute hersenschijfjes20,21,22, primaire celculturen zijn minder complex, waardoor de studie van individuele bijdragen van elk celtype in de pathofysiologie van ischemische beroerte en hoe elk celtype reageert op mogelijke therapeutische doelen mogelijk maakt. Typisch, om de interacties tussen neuron-verrijkte culturen en astrocyten verrijkte culturen te bestuderen, neuronen en gliacellen van postnatale oorsprong worden gebruikt23,,24, of postnatale gliacellen en embryonale neuronen25,26. Hierin wordt voorgesteld een eenvoudige aanpak om neuron- of astrocyten verrijkte culturen en neuron-glia culturen vast te stellen uit hetzelfde weefsel. Deze primaire cellen worden verkregen uit rat embryonale cortex, een gebied vaak beïnvloed door beroerte27,28. Bovendien wordt de dissociatie van het weefsel alleen uitgevoerd door een mechanische procedure. Daarom maakt dit protocol het isoleren van cellen in dezelfde ontwikkelingsfase mogelijk, op een snelle en goedkope manier, en met hoge prestaties en reproduceerbaarheid.

De crosstalk tussen astrocyten en neuronen kan worden onderzocht met behulp van een co-cultuur systeem waarin neuronen gekweekt in coverslips worden onderhouden in contact met een monolaag van astrocyten gezaaid in multiwell platen. Kleine paraffinebollen kunnen worden gebruikt om de scheiding van de twee celculturen te garanderen. Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie van elk celtype mogelijk voordat ze in contact worden gebracht. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een specifiek gen in astrocyten het zwijgen op te leggen en te zien hoe het de neuronale kwetsbaarheid of bescherming tegen ischemische schade kan beïnvloeden. Een gevestigde methode om ischemische omstandigheden in vitro te induceren is zuurstof- en glucosedeprivatie (OGD)3, die bestaat in het vervangen van de reguliere atmosfeer (95% lucht en 5% CO2)door een anoxische atmosfeer (95% N2 en 5% CO2), geassocieerd met het weglaten van glucose.

De beschreven methode is geschikt voor het bestuderen van de interacties tussen neuronen en astrocyten in de context van ischemische beroerte, op een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en goedkope manier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle gebruikte dieren werden gefokt in het CICS-UBI Health Science Research Centre in overeenstemming met de nationale ethische eisen voor dieronderzoek en met het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Richtlijn 2010/63/EU).

1. Rat embryo cortex primaire celcultuur

  1. Cultuur medium voorbereiding
    1. Bereid het Neurobasal Medium (NBM) voor door de volgende supplementen toe te voegen: 2% B27, 0,5 mM glutamine, 25 μM glutamaat en 120 μg/mL gentamicine. Homogeniseren, de pH aanpassen tot 7,2 en het medium steriliseren met een vacuümfiltratiestap, met behulp van een filter van 0,22 μm. Voor de neuron-glia celcultuur, vul het NBM celkweekmiddel aan met 10% van heat-inactivated foetale runderserum (HI-FBS).
    2. Bereid het medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM) voor met de volgende supplementen: natriumwaterstofcarbonaat 2,2 g/L, insuline uit runderalvleesklier 5 mg/L, D-glucosehydrous 3,4 g/L, penicilline (12 U/mL) /streptomycine (12 μg/mL) en 10% HI-FBS. Homogeniseren, de pH aanpassen tot 7,2 en het medium steriliseren met een filtratiestap.
  2. Bereiding van materialen en uitrusting
    1. Prik het einddeel van een 1 mL plastic micropipetpunt van links naar rechts, met behulp van een naald met een specifieke diameter (0,5 mm voor S; 0,6 mm voor M; 0,8 mm voor L) en verzegel de opening van de tip met behulp van een vlam.
    2. Steriliseer al het glaswerk. Gedurende de dissectie houden de gebruikte gereedschappen (bijvoorbeeld schaar, pincet, scalpel) ondergedompeld in 70% ethanol. Spuit de materialen met 70% ethanol voordat u ze in de laminaire stroomkamer betreedt.
    3. Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en plaats het celkweekmedium in het waterbad voordat u met de procedure begint.
      OPMERKING: Voor immunocytochemietesten moet poly-D-lysinecoating worden uitgevoerd in multiwellplaten met coverslips.
  3. De embryonale cortexcultuur van de rat
    1. Verwijder de rattenembryo's van een vrouwelijke Wistar-rat met 15-16 dagen zwangerschap (het einde van de paring, die 24 uur moet duren, wordt beschouwd als de1e dag van de embryonale ontwikkeling). Verdoven het vrouwtje met ketamine (87,5 mg/kg) en xylazine (12 mg/kg) en verwijder de embryo's. Euthanaseer de vrouwelijke rat vervolgens door cervicale dislocatie, volgens het standaardprotocol.
    2. Plaats de embryo's in een steriele buis van 50 mL, voeg fosfaatbuffer zout (PBS) toe tot het de embryo's bedekt en breng ze snel naar de kweekkamer.
    3. Nog steeds in de dooier zak, plaats de embryo's in een petrischaaltje met 25 mL koude PBS. Met behulp van een schaar en een pincet, breek de dooier zak, verwijder het embryo en breng het naar een andere petrischaal met ook koude PBS. De PBS in de petrischaal moet voldoende zijn om het hele embryo te bedekken.
      LET OP: Wees voorzichtig bij het openen van de dooierzak om beschadiging van het embryo te voorkomen. In 1.3.3 en 1.3.4 gebruikten we petrischaaltjes met een diameter van 90 mm die bovenop ijsverpakkingen zijn geplaatst die bedekt zijn met absorberend papier om de PBS op lage temperatuur te houden.
    4. Voor dissectie van het embryo, breng het naar een ander petrischaaltje met 30 mL koude PBS. Plaats het embryo onder een ontledenmicroscoop en immobiliseer het met een pincet. Maak de initiële incisie parallel aan de cortex, gaande van de oogholte naar het einde van de snuit en wees voorzichtig niet te onthoofden het dier.
    5. Verwijder voorzichtig de hoofdhuid en de hersenvliezen met behulp van een pincet, om het corticale hersenweefsel niet te beschadigen. Maak de volgende incisie om de cortex te scheiden. Breng het corticale weefsel over in een buis van 15 mL met 5 mL PBS met behulp van een Pasteur pipet.
    6. Voer de mechanische vertering van het corticale hersenweefsel uit met behulp van de 1 mL plastic tips bereid in 1.2.1. Trituraat 10 keer met een gewone pipet en herhaal het proces met behulp van pipetten met geleidelijk kleinere gaten (L, M en S), totdat de brokken uit elkaar zijn gevallen.
    7. Na de mechanische vertering, centrifugeren de suspensie op 400 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en verhoog het sediment opnieuw met het juiste celkweekmedium dat eerder bij 37 °C werd opgewarmd.
    8. Bepaal het totale aantal cellen aanwezig in de celsuspensie (celdichtheid) met behulp van een Neubauer-kamer, maak de juiste verdunningen en plaat van de cellen. De initiële celdichtheid werd gedefinieerd op basis van een eerdere studie5.
      1. Voor een neuron-verrijkte cultuur, gebruik 0,21 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhouden van de cellen in NBM cultuurmedium zonder HI-FBS.
      2. Voor de neuron-glia culturen gebruiken 0.14 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhouden van de cellen in NBM cultuurmedium aangevuld met 10% HI-FBS.
      3. Voor een met astrocyten verrijkte cultuur gebruikt u 0,26 x 106 cellen/cm2 als de initiële celdichtheid en onderhoudt u de cellen in MEM, aangevuld zoals eerder aangegeven.
      4. Plaats de cellen in een couveuse op 37 °C, 95% O2 en 5% CO2.
        OPMERKING: Voor langere kweekperiodes moet een anti-mitotisch zoals 27 μM 5-fluor-2′-deoxyuridine met 68 μM uridine worden toegevoegd om de celgroei te onderdrukken.

2. Co-cultuursysteem

  1. Bereiding van materialen
    1. Verwarm de paraffine bij 150 °C in een verwarmingsblok gedurende ongeveer 7 min. Houd op 150 °C tot het einde van de procedure. Voeg vervolgens, met behulp van een steriel glas Pasteur pipet met een diameter van 1 mm, een kleine druppel toe over gesteriliseerde en PDL-gecoate coverslips. De paraffinebollen zijn onregelmatig, maar ze hebben een diameter van ongeveer 2 mm. De bollen zullen het mogelijk maken de twee culturen te worden gescheiden door ongeveer 1,25 mm.
    2. Omdat de paraffine niet steriel is, plaatst u de multiwell met de paraffinebollen gedurende 15 minuten onder ultraviolette straling.
    3. Om de co-cultuur vast te stellen, breng de coverslip met de paraffine bollen met behulp van een pincet eerder ondergedompeld in 70% ethanol voor 15 min.
  2. Co-cultuur
    1. Wanneer de twee culturen klaar zijn voor gebruik (d.w.z. na 7 dagen in cultuur onder de in stap 1.3.8 genoemde omstandigheden), breng je de neuronen die in de coverslips met paraffinebollen zijn gezaaid over naar de putten die de astrocyten bevatten.
    2. 24 uur voordat de twee culturen in contact worden gebracht, verander het cultuurmedium van neuronen en astrocyten naar NBM aangevuld, of niet, met HI-FBS, afhankelijk van het doel van het experiment.
    3. Nadat u beide celtypen in contact hebt gebracht, wacht u 8-12 uur voordat u de verschillende stimuli en procedures start.
      OPMERKING: De schematische weergave van het co-cultuursysteem is te zien in figuur 1.

3. Zuurstof- en glucosetekort

  1. Cultuur Medium Voorbereiding
    1. Gebruik voor de OGD-experimenten Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Bereid het HBSS-medium voor met de volgende reagentia: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogeniseren en de pH aanpassen aan 7,2. Steriliseren van het medium door filtratie.
      OPMERKING: Vul indien van toepassing de HBSS-oplossing aan met glucose (HBSSglu+), door 5,56 mM glucose toe te voegen. Voor culturen die aan OGD worden voorgelegd, vult u het HBSS-medium niet aan met glucose (HBSSglu-).
  2. OGD-procedure
    1. 7 dagen na het zaaien van de cellen, verwijder het kweekmedium en was twee keer met HBSSglu-. Voeg na het wassen het HBSSglu-celkweekmedium toe en plaats de multiwell in de hypoxiekamer.
    2. Verzegel de hypoxiekamer en voeg een gasmengsel toe met 95% N2/5% CO2 gedurende 4 minuten met een stroom van 20 L/min om de zuurstof in de kamer te verwijderen. Stop hierna de stroom en plaats de hypoxiekamer in een couveuse op 37 °C gedurende 4 uur of 6 uur, afhankelijk van de omvang van de beoogde ischemie.
    3. Vervang na de periode van OGD het HBSSglu-medium door het juiste kweekmedium voor de resterende procedures.
      OPMERKING: Het OGD-experiment is bedoeld om de in vitro-omstandigheden te simuleren die de cellen lijden tijdens een ischemische gebeurtenis, dus het is belangrijk om te certificeren dat alle eerder gebruikte media worden verwijderd.

4. Immunocytochemietest

OPMERKING: Voer de immunocytochemietest uit zoals eerder beschreven5.

  1. Kortom, om de verschillende corticale culturen te karakteriseren, de cellen 's nachts bij 4 °C uitbroeden met konijnanti-GFAP (1:2000) en muis anti-microtubuli-geassocieerd eiwit 2 (MAP2; 1:500); en vervolgens 1 uur bij kamertemperatuur met de volgende secundaire antilichamen: anti-konijn geconjugeerd aan Alexa Fluor 546 en anti-muis geconjugeerd aan Alexa Fluor 488, beide bij 1:1000 verdunning.
  2. Label de celkernen door incubatie met 2 μM Hoechst 33342 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Mount coverslips in fluorescentie montage medium en het verwerven van beelden op een epifluorescentie microscoop met een 63x vergroting.

5. Statistische analyse

  1. Gegevens uitdrukken als percentage van het totale aantal cellen of als percentage van de controle en gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van ten minste 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud.
  2. Statistische analyse uitvoeren met software (GraphPad Software Inc., San Diego, t CA), met behulp van de ongepaarde Student's t-test. De resultaten werden als significant beschouwd wanneer de waarden van p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de culturen te karakteriseren, immunocytochemie om het aantal cellen dat GFAP of MAP2 uitgedrukt, op grote schaal gebruikte markers van astrocyten en neuronen (figuur 2) te beoordelen werd uitgevoerd in elk type van corticale cultuur. Deze analyse toonde aan dat met astrocyten verrijkte culturen 97% van de cellen presenteerden die GFAP uitdrukken (figuur 2A). Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur 78% van de cellen uitgedrukt MAP2, 4% van de cellen ui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methode bestaat uit de astrocyten- en neuronisolatie van ratembryonal corticaal weefsel, waardoor neuron- of astrocytenverrijkte culturen of neuron-gliaculturen kunnen worden opgericht. Het werd aangepast aan een eerdere studie van onze groep5, waar de corticale neuron-glia en neuron-verrijkte embryonale culturen isolatie werden beschreven en de twee culturen gekenmerkt. Met behulp van deze culturen, Roque et al. vond dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij het reageren op...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de financieringssteun van Fundação para a Ciência e a Tecnologia via Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 en de beurs SFRH/BD/135936/2018 aan JP, door ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" via het project CENTRO-01-0145-FEDER-000013 en financiering aan het PPBI-Portugees Platform of BioImaging via het project POCI-01-0145-FEDER-022122.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24 -well kweekplatenThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 gascilinderArLíquido
Anti-muis geconjugeerd aan Alexa Fluor 488InvitrogenA110011/1000 verdunning; incubatieperiode - 1 uur bij kamertemperatuur
Anti-konijn geconjugeerd aan Alexa Fluor 546InvitrogenA110101/1000 verdunning; incubatieperiode - 1 uur bij kamertemperatuur
B27 supplement (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescerende Montage MediumDakoS3023
D-glucose watervrijFisher ScientificG/0450/603,4 g/L
Epifluorescente microscoopZeissAxioObserver Z1x63x objectief
Fetaal bovien serum (FBS)BiochromS061510%
GentamicineSigma-AldrichG1272120 µg/mL
GlutamaatSigma-AldrichG841525µM
GlutamineSigma-AldrichG31260,5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µM; incubatieperiode - 10 min bij kamertemperatuur
Hypoxie incubatiekamerStemcell Technologies27310Kamer gebruikt voor OGD-inductie
Insulin uit boviene pancreasSigma-AldrichI55005 mg/L
KetamineSigma-AldrichK-00287,5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle mediumSigma-AldrichM0268Opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Muis Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-744211/500 verdunning; incubatieperiode overnacht bij 4 °C
Neurobasal mediumGibco21103-049Opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Paraffine pastilles voor histologieSigma-Aldrich1.07164Smeltpunt 56-58°C
ParaformaldehydeSigma -AldrichP61484% in PBS
Penicilline/StreptomycineBiochromA 2213penicilline (12U/mL) /streptomycine (12µg/mL)
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1024
Konijn Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 verdunning; incubatieperiode overnacht bij 4 °C
NatriumwaterstofcarbonaatFisher ScientificS/4240/602,2g/L
XylazineSigma-AldrichX112612 mg/Kg

Referenties

  1. Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  2. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
  3. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
  4. Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287(2012).
  5. Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
  6. Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
  7. Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
  8. Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
  9. Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
  10. Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
  11. Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
  12. Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
  13. Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
  14. Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
  15. Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
  16. Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156(2018).
  17. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
  18. Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
  19. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  20. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  21. Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
  22. Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
  23. Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
  24. Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
  25. Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
  26. Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74(2019).
  27. Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
  28. Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
  29. Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
  30. Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
  31. Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
  32. Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), Pt A 2035-2041 (2015).
  33. De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
  34. Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
  35. Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
  36. Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ischemisch BeroertemodelZuurstof- en GlucoseprivatieAstrocyten-Neuronen Co-cultuurRattenembryonale CortexPrimaire CelcultuurParaffinsferensysteemCelisolatietechniekImmunohistochemische AnalyseFluorescentiemicroscopie
Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.