Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Samenvatting

Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel, wat leidt tot zuurstof- en glucosedeprivatie, en het daaruit voortvloeiende neuronale verlies. Tal van aanwijzingen dat de interactie tussen glia- en neuronale cellen gunstige effecten uitoefent na een ischemische gebeurtenis. Daarom, om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen. Hierin presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van de rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke cultuur media, maakt de oprichting van neuron- of astrocyten verrijkt culturen of neuron-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid.

Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor op basis van een co-cultuursysteem waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multiwellplaten. De twee culturen worden gescheiden gehouden door kleine paraffinebollen. Deze aanpak maakt het mogelijk de onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandelingen op elk celtype, die een voordeel in veel studies vertegenwoordigt.

Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.

Inleiding

Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte^1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies^2,3.

Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn be....

Protocol

Alle gebruikte dieren werden gefokt in het CICS-UBI Health Science Research Centre in overeenstemming met de nationale ethische eisen voor dieronderzoek en met het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Richtlijn 2010/63/EU).

1. Rat embryo cortex primaire celcultuur

1. Cultuur medium voorbereiding
   1. Bereid het Neurobasal Medium (NBM) voor door de volgende supplementen toe te voegen: 2% B27, 0,5 mM glutamine, 25 μM glutamaat en 120 μg/mL gentamicine. Homogeniseren, de pH aanpassen tot 7,2 en het medium steriliseren met een vacuümfiltra....

Resultaten

Om de culturen te karakteriseren, immunocytochemie om het aantal cellen dat GFAP of MAP2 uitgedrukt, op grote schaal gebruikte markers van astrocyten en neuronen (figuur 2) te beoordelen werd uitgevoerd in elk type van corticale cultuur. Deze analyse toonde aan dat met astrocyten verrijkte culturen 97% van de cellen presenteerden die GFAP uitdrukken (figuur 2A). Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur 78% van de cellen uitgedrukt MAP2, 4% van de cellen ui.......

Discussie

De hier beschreven methode bestaat uit de astrocyten- en neuronisolatie van ratembryonal corticaal weefsel, waardoor neuron- of astrocytenverrijkte culturen of neuron-gliaculturen kunnen worden opgericht. Het werd aangepast aan een eerdere studie van onze groep⁵, waar de corticale neuron-glia en neuron-verrijkte embryonale culturen isolatie werden beschreven en de twee culturen gekenmerkt. Met behulp van deze culturen, Roque et al. vond dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij het reageren op.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
24 -well kweekplaten	Thermo Fischer Scientific	142475
95% N2/5% CO2 gascilinder	ArLíquido
Anti-muis geconjugeerd aan Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	1/1000 verdunning; incubatieperiode - 1 uur bij kamertemperatuur
Anti-konijn geconjugeerd aan Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	1/1000 verdunning; incubatieperiode - 1 uur bij kamertemperatuur
B27 supplement (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescerende Montage Medium	Dako	S3023
D-glucose watervrij	Fisher Scientific	G/0450/60	3,4 g/L
Epifluorescente microscoop	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objectief
Fetaal bovien serum (FBS)	Biochrom	S0615	10%
Gentamicine	Sigma-Aldrich	G1272	120 µg/mL
Glutamaat	Sigma-Aldrich	G8415	25µM
Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	0,5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 µM; incubatieperiode - 10 min bij kamertemperatuur
Hypoxie incubatiekamer	Stemcell Technologies	27310	Kamer gebruikt voor OGD-inductie
Insulin uit boviene pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
Ketamine	Sigma-Aldrich	K-002	87,5 mg/Kg
Minimum Essential Medium Eagle medium	Sigma-Aldrich	M0268	Opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Muis Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	1/500 verdunning; incubatieperiode overnacht bij 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Paraffine pastilles voor histologie	Sigma-Aldrich	1.07164	Smeltpunt 56-58°C
Paraformaldehyde	Sigma -Aldrich	P6148	4% in PBS
Penicilline/Streptomycine	Biochrom	A 2213	penicilline (12U/mL) /streptomycine (12µg/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Konijn Anti-GFAP	DAKO	Z0334	1/2000 verdunning; incubatieperiode overnacht bij 4 °C
Natriumwaterstofcarbonaat	Fisher Scientific	S/4240/60	2,2g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg