Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

6.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61398

⸱

16 mei 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

Intacte regulatie van spierglucoseopname is belangrijk voor het behoud van glucosehomeostase van het hele lichaam. Dit protocol presenteert een beoordeling van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren bij het afbakenen van de impact van verschillende fysiologische interventies op het glucosemetabolisme van het hele lichaam.

Samenvatting

Skeletspieren zijn een insuline-responsief weefsel en nemen meestal het grootste deel van de glucose op die na een maaltijd in het bloed komt. Bovendien is gemeld dat skeletspieren de extractie van glucose uit het bloed tijdens inspanning tot 50-voudig kunnen verhogen in vergelijking met rustomstandigheden. De toename van de opname van spierglucose tijdens inspanning en insulinestimulatie is afhankelijk van de translocatie van glucosetransporter 4 (GLUT4) van intracellulaire compartimenten naar het spierceloppervlakmembraan, evenals fosforylering van glucose naar glucose-6-fosfaat door hexokinase II. Isolatie en incubatie van muisspieren zoals m. soleus en m. extensor digitorum longus (EDL) is een geschikt ex vivo model om de effecten van insuline en elektrisch geïnduceerde contractie (een model voor lichaamsbeweging) op glucoseopname in volwassen skeletspieren te bestuderen. Het ex vivo-model maakt dus evaluatie van de gevoeligheid van spierinsuline mogelijk en maakt het mogelijk om de spierkrachtproductie tijdens contractie te matchen, wat zorgt voor een uniforme rekrutering van spiervezels tijdens metingen van spierglucoseopname. Bovendien is het beschreven model geschikt voor farmacologische samengestelde testen die van invloed kunnen zijn op de insulinegevoeligheid van de spieren of van hulp kunnen zijn bij het afbakenen van de regulerende complexiteit van de glucoseopname van de skeletspier.

Hier beschrijven en bieden we een gedetailleerd protocol over het meten van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spierpreparaten van muizen met behulp van radioactief gelabelde [3H] 2-deoxy-D-glucose en [14C] mannitol als een extracellulaire marker. Dit maakt een nauwkeurige beoordeling van de glucoseopname in volwassen skeletspieren mogelijk in afwezigheid van verstorende factoren die het intacte diermodel kunnen verstoren. Bovendien geven we informatie over de metabole levensvatbaarheid van geïncubeerde muizenskeletspieren, wat suggereert dat de toegepaste methode onder bepaalde omstandigheden enkele kanttekeningen bevat bij het bestuderen van het spierenergiemetabolisme.

Inleiding

Skeletspieren bezitten het vermogen om grote hoeveelheden glucose uit de extracellulaire ruimte te extraheren als reactie op insuline en lichaamsbeweging. Dit helpt om de glucosehomeostase van het hele lichaam te behouden en stelt de glucosetoevoer veilig in tijden van hoge energievraag. Aangezien intacte regulatie van de glucoseopname van de skeletspier belangrijk is gebleken voor de algehele gezondheid en fysieke prestaties 1,2, hebben metingen van spierglucoseopname tijdens verschillende aandoeningen veel aandacht gekregen. Bij mens en dier is de hyperinsulinemisch-euglycemische klem gebruikt als de gouden standaardtechniek om de insulinegevoeligheid in vivo te beoordelen 3,4. In tegenstelling tot bevindingen verkregen uit een orale glucosetolerantietest, vereist de hyperinsulinemisch-euglycemische klemtechniek geen intacte gastro-intestinale functie of insulinesecretie uit de pancreas en maakt het dus mogelijk insulineresponsen te vergelijken tussen proefpersonen die variaties vertonen in gastro-intestinale en / of pancreasfunctie. Metingen van spierglucoseopname in vivo tijdens inspanning bij mensen zijn vaak uitgevoerd sinds de jaren 19605. Eerst door het gebruik van arterioveneuze balanstechnieken6 en later door het gebruik van positronemissietomografie (PET) beeldvorming in combinatie met een positron emitterende glucose analoog bijv. 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. Bij knaagdieren wordt de door inspanning gestimuleerde spierglucoseopname in vivo meestal uitgevoerd door het gebruik van radioactieve of stabiele isotoop-gelabelde glucoseanalogen 8,9,10.

Een aanvullende methode voor het meten van spierglucoseopname in vivo, is het isoleren en incuberen van kleine spieren van knaagdieren en vervolgens de glucoseopname te meten met behulp van radioactieve of stabiele isotoop-gelabelde glucoseanalogen 11,12,13. Deze methode maakt een nauwkeurige en betrouwbare kwantificering van glucoseopnamesnelheden in volwassen skeletspieren mogelijk en kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid van verschillende insulineconcentraties en tijdens contractie opgewekt door elektrische stimulatie. Wat nog belangrijker is, metingen van glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde skeletspieren zijn van belang bij het onderzoeken van het spierstofwisselingsfenotype van muizen die verschillende interventies hebben ondergaan (bijv. Voeding, fysieke activiteit, infectie, therapeutica). Het geïsoleerde skeletspiermodel is ook een geschikt hulpmiddel voor farmacologische samengestelde tests die de glucoseopname op zich kunnen beïnvloeden en/of de insulinegevoeligheid kunnen wijzigen12,14. Op deze manier kan de werkzaamheid van verbindingen die zijn ontworpen om het spierglucosemetabolisme te reguleren, worden getest en geëvalueerd in een zeer gecontroleerde omgeving voordat vervolgens in vivo wordt getest in preklinische diermodellen.

Onder sommige omstandigheden kan metabole levensvatbaarheid een uitdaging vormen in het geïsoleerde en geïncubeerde skeletspiermodelsysteem. Het ontbreken van een bloedsomloop in de geïncubeerde spieren brengt immers met zich mee dat de afgifte van substraten (bijv. zuurstof en voedingsstoffen) volledig afhankelijk is van eenvoudige diffusie tussen de spiervezels en de omgeving. In dit verband is het van belang dat de geïncubeerde spieren klein en dun zijn en dus minder een barrière vormen voor zuurstofdiffusie tijdens incubatie15. Vooral tijdens langdurige incubaties gedurende enkele uren kunnen hypoxische toestanden zich ontwikkelen als gevolg van onvoldoende zuurstoftoevoer, wat resulteert in uitputting van spierenergie15. Hoewel verschillende markers van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde rattenspier eerder zijn gemeld naast de identificatie van belangrijke variabelen die helpen om de levensvatbaarheid van de rattenspier te behouden15, is een uitgebreide evaluatie van de metabole levensvatbaarheid in kleine geïncubeerde muisspieren nog steeds gerechtvaardigd. Daarom is het glycogeengehalte momenteel voornamelijk gebruikt als een marker van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde muizenskeletspieren16,17.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om basale, insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname te meten in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spieren van muizen met behulp van radioactief gelabelde [3H] 2-deoxy-D-glucose en [14C] mannitol als extracellulaire marker. In de huidige studie werd de glucoseopname gemeten gedurende een periode van 10 minuten en de methode wordt gepresenteerd met behulp van submaximaal en maximaal effectieve insulineconcentraties en een enkel contractieprotocol. De hierin beschreven protocollen kunnen echter gemakkelijk worden gewijzigd met betrekking tot incubatietijd, insulinedosering en elektrisch stimulatieprotocol. Verder bieden we een grondige karakterisering van verschillende markers van metabole levensvatbaarheid in geïncubeerde soleus- en EDL-muizenspier. De resultaten geven aan dat glucosesuppletie aan de incubatiebuffer essentieel is om de metabole levensvatbaarheid van de geïncubeerde spieren gedurende 1 uur te behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures waarbij proefdieren betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en lokale wetgeving. Alle dierproeven die voor deze studie werden gebruikt, voldeden aan het Europees Verdrag inzake de bescherming van gewervelde dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden en werden goedgekeurd door de Deense inspectie voor dierproeven.

1. Voorbereiding van het experimentele apparaat en de hechtlussen

OPMERKING: Gebruik voor deze studie een geïntegreerd spierstripmyograafsysteem met aangepaste incubatiehaken om geïsoleerde skeletspieren van muizen te incuberen (figuur 1). Dit systeem laat spieren baden in een fysiologische oplossing met continue oxygenatie (95% O2 en 5% CO2) en bij constante temperatuur. Het spierweefselbad is gekoppeld aan een krachtopnemer voor het meten van spierkrachtproductie tijdens contractie. Om myo-mechanische reacties tijdens contractie uit te lokken en te registreren, gebruikt u respectievelijk een elektrische pulsstimulator en een gegevensverzamelingsprogramma. Stimuleer de geïncubeerde spieren om samen te trekken door platina-elektroden die centraal en aan beide zijden van de spier zijn geplaatst.

  1. Zet het myograafsysteem en de warme kamers aan op 30 °C. Open dataverzamelingssoftware die compatibel is met het myograafsysteem en kalibreer krachtomvormers om vergelijkbaarheid tussen datasets te garanderen.
  2. Begin met het snijden van ~ 16 cm strengen van niet-absorbeerbare chirurgische nylon hechtdraad. Gebruik een tang om een lus van ongeveer 0,4 cm in diameter te maken van een enkele streng. Herhaal dit totdat er voldoende lussen zijn geproduceerd. Elke spier heeft twee lussen nodig - een voor de proximale en een voor de distale pees.

2. Bereiding van oplossingen en incubatiemedia

  1. Bereiding van basale incubatiemedia
    1. Bereid de volgende stamoplossingen voor: 2,5 M natriumchloride (NaCl, 250 ml), 0,5 m natriumbicarbonaat (NaHCO3, 250 ml), 0,5 m kaliumchloride (KCl, 50 ml), 0,25 m calciumchloride (CaCl2, 50 ml), 0,25 m kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4, 50 ml), 0,25 m magnesiumsulfaat (MgSO4, 50 ml), 110 m natriumpyruvaat (na-pyruvaat, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoxy-D-glucose (4 ml), 15% oplossing van runderserumalbumine (BSA) gedialyseerd tegen Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) buffer (hieronder beschreven in stap 4) (100 ml).
      OPMERKING: Er zijn twee oplossingen nodig om de opname van glucose in rust en contractie te meten. Bovendien vereist elke afzonderlijke insulineconcentratie die wordt gebruikt om de insuline-gestimuleerde glucoseopname te beoordelen, twee oplossingen. In totaal zijn er dus zes verschillende oplossingen nodig om basale, submaximale insuline-, maximale insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde muizenskeletspieren te meten. In het volgende verwijst 'basale incubatiemedia' naar media zonder insuline of radioactieve tracers. 'Incubatiemedia' verwijst naar media die insuline bevatten. "Glucoseopname-incubatiemedia" verwijst naar media die naast insuline 2-deoxy-D-glucose en radioactieve tracers bevatten in een concentratie die identiek is aan die welke in de "incubatiemedia" wordt gebruikt.
    2. Bereid een KRH-buffer voor door ultrapuur water (ddH2O) aan te vullen met NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) en MgSO4 (1,2 mM). Vergas vervolgens de KRH-buffer met 95% O2 en 5% CO2 gedurende ten minste 10 minuten. De gewenste pH van de KRH-buffer moet tussen 7,35-7,45 bij 30 °C liggen. Als de pH bij kamertemperatuur wordt aangepast, moet de pH van de KRH-buffer tussen 7,25 en 7,35 liggen.
    3. Voeg BSA (0,1%), Na-Pyruvaat (2 mM) en D-mannitol (8 mM) toe aan de vergaste en pH-aangepaste KRH-buffer om de basale incubatiemedia te voltooien. Bewaar basale incubatiemedia in een afgesloten container om de ontgassing van O2 en CO2 tot een minimum te beperken en plaats de media bij 30 °C.
      OPMERKING: Typisch, de osmolariteit van de KRH supplementen (dwz Na-Pyruvaat, D-Mannitol, en D-glucose) wordt constant gehouden gedurende een heel experiment om krimp of uitbreiding van de spiercellen te voorkomen. Het hierin beschreven protocol gebruikt een osmolariteit van 10 mM voor de KRH-supplementen. Als een glucosebevattende buffer nodig is, vervang dan KRH-supplementen om aan de behoeften te voldoen, bijvoorbeeld 5 mM D-glucose en 5 mM D-mannitol.
    4. Om mogelijke BSA-geassocieerde verontreinigingen in de incubatiebuffer te voorkomen, dialyseert u BSA tegen KRH.
      1. Om een 15% BSA-voorraadoplossing gedialyseerd tegen KRH-buffer te maken, begint u met het oplossen van 300 g vetvrije BSA van analytische kwaliteit in 900 ml KRH-buffer. Kook vervolgens de dialysebuis in herdacht water totdat de slang zacht is.
      2. Vul de slang met de BSA-KRH-oplossing en zet de uiteinden van de slang vast. Plaats de slang met BSA-KRH in 5 L KRH-buffer en laat deze een nacht op 4 °C staan. Vervang de volgende dag de KRH-buffer en laat de slang met BSA-KRH 's nachts in KRH-buffer bij 4 °C staan.
      3. Verzamel ten slotte de BSA-KRH-oplossing uit de slang en voeg KRH-buffer toe aan een eindvolume van 2 l (d.w.z. 15% BSA-KRH-voorraadoplossing). Verdeel de 15% BSA-KRH-stamoplossing in aliquots en bewaar in de vriezer bij ~-20 °C.
  2. Bereiding van incubatiemedia die insuline bevatten
    1. Voeg voor de incubatiemedia die een submaximaal effectieve insulineconcentratie bevatten, 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 100 ml per ml basale incubatiemedia (100 μU/ml insuline) toe.
    2. Voeg voor de incubatiemedia met een maximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 10 E/ml toe per ml basale incubatiemedia (10 ml insuline).
  3. Bereiding van glucoseopname-incubatiemedia
    LET OP: Het hanteren van radioactief materiaal is alleen toegestaan in een beperkt en gecontroleerd gebied door geautoriseerd personeel en sommige universiteiten, onderzoeksinstellingen en bedrijven kunnen de verwerving van een "Radioactivity Use Permit" vereisen. Materiaal en afval moeten worden behandeld volgens de juiste lokale procedures, richtlijnen en wetgeving.
    1. Volg dezelfde procedure als beschreven in rubriek 2.1.2.
    2. Voeg BSA (0,1%), Na-Pyruvaat (2 mM), D-mannitol (7 mM) en 2-deoxy-D-glucose (1 mM) toe aan de vergaste en pH-aangepaste KRH-buffer.
    3. Voeg [3H]2-deoxy-D-glucose (0,028 MBq/ml) en [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) toe aan de aangevulde KRH-buffer om de glucoseopname-incubatiemedia te voltooien. Bewaren bij 30 °C. Als [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol in ethanol zijn opgelost, verwijder dan de ethanol door N 2-gemedieerde verdamping vóór gebruik.
    4. Voeg voor de glucoseopname-incubatiemedia met een submaximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 100 mU/ml toe per ml glucoseopname-incubatiemedia (100 μU/ml insuline).
    5. Voeg voor de glucoseopname-incubatiemedia met een maximaal effectieve insulineconcentratie 1 μL van een insulinevoorraadoplossing van 10 E/ml toe per ml glucose-opname-incubatiemedia (10 ml/ml insuline).

3. Dieren en dissectie van de muis soleus en EDL spier voor incubatie

OPMERKING: Procedures waarbij proefdieren betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en lokale wetgeving. De beschreven procedure kan worden gebruikt met in-house gefokte of commercieel verkrijgbare mannelijke en vrouwelijke muizen van verschillende stammen en genetische achtergronden. De volgende procedure is voorzien voor gevoede vrouwelijke C57Bl / 6J-muizen. Gemiddeld waren muizen 19 weken oud en wogen ze 25 g. De muizen werden onderhouden op een licht-donkercyclus van 12:12 uur met vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water. Dierproeven werden gestart om ~ 9:00 uur lokale tijd en alle dieren werden geofferd binnen een periode van 2 uur.

  1. Voeg 4 ml voorverwarmde (30 °C) basale incubatiemedia toe aan elke incubatiekamer en zorg ervoor dat de basale incubatiemedia continu van zuurstof worden voorzien met 95% O2 en 5% CO2.
  2. Verdoof muizen met een intraperitoneale injectie van pentobarbital (10 mg/100 g lichaamsgewicht) of andere beschikbare anesthesie (bijv. tribromoethanol).
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat in sommige landen een vergunning voor het gebruik van pentobarbital en andere anesthetica vereist kan zijn. Voordat spierdissectie kan worden gestart, moet de anesthesie van elk dier op de juiste manier worden geïnduceerd. Om dit te garanderen, worden staart- en beenreflexen getest. Voor optimale resultaten moet dissectie goed worden geoefend om te voorkomen dat de spieren tijdens het verwijderen worden beschadigd.
  3. Plaats verdoofde muizen op een dissectiebak (bijv. piepschuim deksel) en pin de voor- en achterpoten zo nodig vast met een naald.
  4. Verwijder de huid van het onderbeen en zorg ervoor dat zowel de achillespees als het kniegewricht zichtbaar zijn.
    1. Voor de dissectie van de soleusspier begint u met het bevestigen van een enkele hechtlus aan de achillespees. Zet een peantang vast aan de achillespees los van de hechtlus en snijd door om de soleus- en gastrocnemiusspieren uit de poot te bevrijden. Schuif de peantang voorzichtig over de muis waardoor de soleusspier bloot komt te liggen.
    2. Pin de peantang vast en plaats een tweede hechtlus rond de proximale pees van de soleusspier. Snijd vervolgens de proximale pees door en ontleed soleus (inclusief de twee aangehechte hechtlussen) vrij van gastrocnemiusspier. Plaats de soleusspier snel in de incubatiekamer door elke hechtlus aan de respectievelijke haken te bevestigen.
  5. Verwijder de fascia die de m. tibialis anterior (TA) bedekt met een tang. Als het correct wordt gedaan, moeten distale pezen van de TA- en EDL-spieren helder wit en zichtbaar zijn; en van elkaar gescheiden.
  6. Knip de distale pees van de TA-spier door en ontleed de spier voor latere analyses (bijv. genotypering). Bevrijd met behulp van een tang voorzichtig de EDL-spier van de omliggende weefsels, maar laat de spier intact en snijd de pezen niet door. Plaats een hechtlus rond de distale pees en een tweede hechtlus rond de proximale pees van EDL.
  7. Snijd vervolgens de pezen door de EDL-spier los te maken met twee bevestigde hechtlussen en plaats de spier snel in de incubatiekamer door elke hechtlus aan de respectieve haken te bevestigen. Om geen spanning te verliezen tijdens de incubatie en vooral tijdens elektrisch geïnduceerde samentrekking van de soleus- en EDL-spieren, is het van groot belang om de hechtlussen rond de pezen met strakke knopen te fixeren.
  8. Tot slot euthanaseer je het dier door bijvoorbeeld cervicale dislocatie.
  9. Wanneer de spieren zijn ontleed en in incubatiekamers zijn geplaatst, past u de rustspanning van elke spier aan op ~ 5 mN en incubeert u de spieren gedurende ten minste 10 minuten voordat het experimentele protocol wordt gestart.

4. Insuline-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde skeletspieren van muizen

  1. Vervang na stap 3.9 de basale incubatiemedia door incubatiemedia die geen insuline (basale incubatiemedia), een submaximaal effectieve insulineconcentratie of een maximaal effectieve insulineconcentratie bevatten en laat gedurende 20 minuten in de incubatiekamers. Plaats elke incubatiekamer met 1 minuut, waardoor er tijd is voor de daaropvolgende oogst van spieren.
  2. Vervang aan het einde van de stimulatieperiode van 20 minuten de incubatiemedia door de glucoseopname-incubatiemedia met een identieke insulineconcentratie en laat deze gedurende 10 minuten in de incubatiekamers staan, opnieuw met een afstand van 1 minuut tussen elke incubatiekamer.
  3. Na 10 minuten incubatie in de glucoseopname-incubatiemedia verwijdert u voorzichtig de spieren uit de incubatiekamers en wast u ze in ijskoude basale incubatiemedia. Droog vervolgens de spieren snel op filterpapier voordat de hechtlussen worden verwijderd en de spieren worden bevroren in vloeibare stikstof. Het is absoluut noodzakelijk dat de geïncubeerde spieren snel worden geoogst als men naast glucose-opname ook verschillende intracellulaire metabolieten en eiwitsignalering wil onderzoeken.
  4. Verzamel 100 μL van de glucoseopname-incubatiemedia uit elke incubatiekamer en bewaar deze bij -20 °C. De hoeveelheid radioactiviteit in deze monsters wordt meegenomen in de berekening van de spierglucoseopname.

5. Contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde muizenskeletspieren

OPMERKING: Om contractie van geïsoleerde muizenskeletspieren te induceren, gebruikt u het volgende protocol: 1 trein/15 s, elke trein 1 s lang bestaande uit pulsen van 0,2 ms die worden afgeleverd bij 100 Hz. Andere soortgelijke protocollen die contractie van geïsoleerde skeletspieren van muizen veroorzaken, zullen waarschijnlijk ook werken. Belangrijk is dat de spanning moet worden aangepast om maximale krachtontwikkeling van de geïncubeerde spier te genereren, die afhankelijk is van de experimentele opstelling. Als dit niet is verzekerd, kunt u het risico lopen dat niet alle vezels van de spier samentrekken. Dit kan op zijn beurt leiden tot vertekening in de dataset.

  1. Plaats na stap 3.9 de platina-elektroden centraal en aan beide zijden van de spieren. Start de samentrekking van de spieren onmiddellijk na het vervangen van de basale incubatiemedia door de glucoseopname-incubatiemedia. Plaats indien mogelijk elke incubatiekamer met 1 minuut, waardoor er tijd wordt gemaakt voor de daaropvolgende oogst van spieren. Vergeet niet om de krachtproductie van elke geïncubeerde spier te registreren.
  2. Na 10 minuten contractie in de glucose-opname-incubatiemedia, verwijder de platina-elektroden, verzamel voorzichtig de spieren uit de incubatiekamers en was ze in ijskoude basale incubatiemedia. Droog vervolgens de spieren snel op filterpapier voordat de hechtlussen worden verwijderd en de spieren worden bevroren in vloeibare stikstof. De hele spieroogstprocedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
  3. Verzamel 100 μL van de glucoseopname-incubatiemedia uit elke incubatiekamer en bewaar deze bij -20 °C. De hoeveelheid radioactiviteit in deze monsters wordt meegenomen in de berekening van de spierglucoseopname.

6. Homogenisatie en verwerking van skeletspieren

OPMERKING: De onderstaande procedure voor spierhomogenisatie maakt het mogelijk om zowel glucoseopname als myocellulaire signalering te bepalen door western blotting in dezelfde set spiermonsters.

  1. Homogeniseer elke spier in 400 μL ijskoude buffer met pH 7,5 met 10% glycerol, 20 mM natriumpyrofosfaat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (opgelost in isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glycerofosfaat, 10 mM natriumfluoride (NaF), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM glycoletherdiaminetetra-azijnzuur (EGTA), 10 μg/ml aprotinine, 10 μg/ml leupeptine, 3 mM benzamidine en 2mM natrium-orthovanadaat met stalen kralen en een tissuelyser (2 x 45 s bij 30 Hz). Draai alle homogenaten gedurende 1 uur bij 4 °C, waarna ze gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 16.000 x g worden gecentrifugeerd. Verzamel het lysaat (supernatant) dat wordt gebruikt om de opname van spierglucose te bepalen.

7. Bepaling van radioactief gelabeld 2-deoxyglucose en mannitol

  1. Voeg 150 μL van elk spierlysaat en 25 μL van de glucoseopname-incubatiemedia van elke incubatiekamer toe aan afzonderlijke injectieflacons voor het tellen van vloeibare scintillaties met 2 ml vloeibare scintillatievloeistof. Bereid bovendien twee blinde controleflacons voor die slechts 3 ml vloeibare scintillatievloeistof bevatten. Sluit alle injectieflacons en meng grondig door elke injectieflacon gedurende ~ 5 s te vortexen.
  2. Plaats de injectieflacons in een vloeibare scintillatieteller en meet de radioactiviteit van [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol volgens de richtlijnen van de fabrikant. Registreer DPM (desintegraties per minuut) voor elke vloeibare scintillatieflacon.

8. Berekening van spierglucoseopnamesnelheden

  1. Gebruik het lysaat uit stap 6.1 om de totale eiwitconcentratie in elk spiermonster te meten met behulp van standaard eiwitkwantificeringsmethoden (bijv. Bicinchoninic acid of Bradford-assays). Bereken de hoeveelheid eiwit (mg) die aan elke scintillatieflacon wordt toegevoegd.
    OPMERKING: De snelheid van glucoseopname voor elk spiermonster wordt berekend door de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose in de extracellulaire ruimte af te trekken van de totale hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose in het spiermonster met [14C]mannitol als extracellulaire marker. Aangenomen wordt dat [3H]2-deoxy-D-glucose en [14C]mannitol vergelijkbare diffusie-eigenschappen vertonen in het spierweefsel tijdens de incubatie. Voer de volgende berekeningen uit:
  2. Begin met het aftrekken van de [3H] en [14C] DPM van de blinde controlemonsters van alle spier- en mediamonsters.
  3. Bepaal de spier extracellulaire ruimte in μL (μL-ECS):
    [14C] DPMspier / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Bereken de hoeveelheid [3H]DPM in de extracellulaire ruimte van de spier ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Bereken de hoeveelheid [3H]DPM in de spier intracellulaire ruimte ([3H]DPMICS):
    [3uur] DPMspier− [3H]DPMECS
  6. Bereken de spierglucoseopnamesnelheid (μmol / g eiwit / uur):
    [3uur] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-deoxy-D-glucose])) / mg eiwit) / Th
    OPMERKING: Voor alle bovenstaande vergelijkingen,
    [14C] DPMspier is de hoeveelheid [14C] mannitol radioactiviteit in een spiermonster;
    [14C] DPM-media is de hoeveelheid [14C]mannitol radioactiviteit in een mediamonster;
    [3uur] DPM-spier is de hoeveelheid [3H] 2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in een spiermonster;
    [3uur] DPM-mediais de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in een mediamonster;
    [3uur] DPMECS is de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in de spier extracellulaire ruimte;
    [3uur] DPMICS is de hoeveelheid [3H]2-deoxy-D-glucose radioactiviteit in de spier intracellulaire ruimte;
    μL-ECS is de spierextracellulaire ruimte in μL;
    Mvol is het volume (μL) incubatiemedia dat wordt gebruikt voor het tellen van scintillaties (bv. "25" zoals hierboven vermeld);
    Th is de tijdsfactor die wordt gebruikt om de opnamesnelheden per uur te berekenen (d.w.z. '1/6' bij het incuberen van spieren met glucoseopnamemedia gedurende 10 minuten)
  7. Houd rekening met deze voorbeeldberekening. De [3H] en [14C] DPM van de blinde controlemonsters (respectievelijk 17 en 6) zijn afgetrokken van de hieronder vermelde DPM-waarden.
    [14C] DPMspier: 343
    [14C] DPMmedia: 11846
    [3uur] DPMspier: 4467
    [3uur] DPMmedia: 39814
    Mvol: 25
    mg eiwit: 0,396 (in 150 μL spiereiwit lysaat)
    [2-deoxy-D-glucose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (h)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3uur] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3uur] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glucose opname: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg eiwit) / (1/6 uur) = 31,53 μmol / g eiwit / uur

9. SDS-PAGE en western blot analyses

  1. Bereid soleus- en EDL-spierlysaten in Laemmli-buffer en verwarm gedurende 5 minuten bij 96 °C.
  2. Scheid gelijke hoeveelheden spiereiwit door SDS-PAGE op zelf gegoten gels en breng de eiwitten over naar polyvinylideenfluoridemembranen door semidry blotting.
  3. Incubeer vervolgens membranen in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,05% Tween 20 en 2% magere melk en sondemembranen met relevante primaire en secundaire antilichamen.
  4. Detecteer eiwitten met chemiluminescentie en visualiseer ze door een digitaal beeldvormingssysteem.

10. Spierglycogeen, nucleotiden, lactaat, creatine en fosfocreatine

  1. Gebruik perchloorzuur om EDL en soleus spiermonsters te extraheren.
  2. Neutraliseer vervolgens monsters en analyseer ze op lactaat, creatine en fosfocreatine zoals eerder beschreven18.
  3. Analyseer het nucleotidegehalte in EDL en soleusspier door omgekeerde fase HPLC na extractie in perchloorzuur.
  4. Bepaal het spierglycogeengehalte in hele spierhomogenaat als glycosyleenheden na zure hydrolyse met een fluorometrische methode zoals eerder beschreven18.

11. Statistieken

  1. Statistische analyses uitvoeren met statistische analysesoftware.
  2. Gebruik een ANOVA-test (two-way analysis of variance) om statistische verschillen tussen de waarden in tabel 1 te beoordelen.
  3. Gebruik ongepaarde Student t-tests om statistische verschillen in glucoseopname tussen EDL en soleus te beoordelen binnen elke groep in figuur 2. Gegevens presenteren als middel ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). P < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 2 waren de basale glucoseopnamesnelheden vergelijkbaar tussen geïsoleerde soleus- en EDL-spieren van vrouwelijke muizen. Dit is ook meerdere keren gemeld voor 12,13,19,20. De glucoseopname nam toe met ~ 0,8 en ~ 0,6 keer en bereikte 12 en 9 μmol / g eiwit / h in respectievelijk soleus- en EDL-spieren, als ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Intacte regulatie van glucoseopname in skeletspieren is belangrijk voor het behoud van de algehele gezondheid1. Onderzoek naar spierglucoseopname dient dus vaak als een primaire uitlezing bij het evalueren van verschillende gezondheidsveranderende interventies. Hier beschrijven we een ex vivo methode voor het meten van glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde soleus- en EDL-spieren van muizen als reactie op insuline en elektrisch geïnduceerde contracties. De methode is snel en betrouwbaar en m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deense Raad voor Onafhankelijk Onderzoek - Medische Wetenschappen (FSS8020-00288B) en de Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Dit werk werd ook ondersteund door een onderzoekssubsidie aan Rasmus Kjøbsted van de Deense Diabetes Academie, die wordt gefinancierd door de Novo Nordisk Foundation, subsidienummer NNF17SA0031406. De auteurs willen Karina Olsen, Betina Bolmgren en Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) bedanken voor hun bekwame technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[14C]D-mannitolAmerican Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose American Radiolabeled Chemicals, Inc.ART 0103A
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD8375
4-0 USP niet-steriele chirurgische nylon hechtdraadHarvard Apparatus51-7698
Streptavidine/HRP (Conjugaat)DAKOP0397Wordt gebruikt voor het detecteren van ACC-eiwit
Akt2 antilichaamCell Signaling3063
AMPKα2 antilichaamSanta CruzSC-19131
aprotinineSigmaA1153
benzamidineSigmaB6505
Bovine serum albumine (BSA)SigmaA7030
CaCl2Merck1020831000
Kalibratiekit (kracht)Danish Myo Technology A/S300041
ChemiluminescentieMilliporeWBLUF0500
D-GlucoseMerck1084180100
D-MannitolSigmaM4125
DataverzamelprogrammaNational InstrumentsLabVIEW software versie 7.1
DialyseslangViskingDTV.12000.09 Maat Nr.9
Digitaal beeldvormingssysteemBioRadChemiDoc MP
EDTASigma EDSE9884
EGTASigmaE4378
Elektrische pulsstimulatorDigitimerD330 MultiStim-systeem
GlycerolSigmaG7757
HEPESSigmaH7637
IGEPAL CA-630 SigmaI8896
InsulinNovo NordiskActrapid, 100 IE/mL
KClMerck1049361000
KH2PO4Merck104873025
leupeptineSigmaL2884
MgSO4Merck1058860500
Spierstrip myograph-systeemDanish Myo Technology A/SModel 820MS
Na-OrthovanadateSigmaS6508
Na-PyrofosfaatSigma221368
Na-PyrovahnaatSigmaP2256
NaClMerck106041000
NaFSigmaS1504
NaHCO3VWR27778260
pACC Ser212 antilichaamCell Signaling3661
pAkt Thr308 antilichaamCell Signaling9275
pAMPK Thr172 antilichaamCell Signaling2531
fenylmethylsulfonylfluorideSigmaP7626
Platinum elektrodenDanish Myo Technology A/S300145
pTBC1D4 Ser588 antilichaamCell Signaling8730
ScintillatietellerPerkin ElmerTri-Carb-2910TR
Scintillatievloeistof Perkin Elmer6013329
Statistische analysesoftwareSystatSigmaPlot versie 14
TBC1D4 antilichaamAbcamab189890
TissueLyser II Qiagen85300
Ultrapuur waterMerckMilli-Q Reference A+ System
β-glycerofosfaatSigmaG9422

Referenties

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273(2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198(2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198(2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

InsulinstimulatieContractiestimulatieMuissoleusMuise EDLRadiolabelled GlucoseVloeibare ScintillatieWestern Blot-analyseSpierdissectie
Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.