Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Samenvatting

Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.

Samenvatting

Microglia zijn ingezeten ingeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Microglia spelen een cruciale rol tijdens de ontwikkeling, bij het handhaven van homeostase, en tijdens infectie of letsel. Verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen hebben gewezen op de centrale rol die microglia spelen in auto-immuunziekten, auto-inflammatoire syndromen en kanker. De activering van microglia bij sommige neurologische ziekten kan direct deelnemen aan pathogene processen. Primaire microglia zijn een krachtig hulpmiddel om de immuunreacties in de hersenen, celcelinteracties en geantreguleerde microglia fenotypes bij ziekte te begrijpen. Primaire microglia bootsen in vivo microgliale eigenschappen beter na dan vereeuwigde microgliale cellijnen. Menselijke volwassen microglia vertonen verschillende eigenschappen in vergelijking met menselijke foetale en knaagdier microglia. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor isolatie van primaire microglia van volwassen menselijke hersenen. Het bestuderen van deze microglia kan kritische inzichten bieden in celcelinteracties tussen microglia en andere ingezeten cellulaire populaties in het CNS, waaronder oligodendrocyten, neuronen en astrocyten. Bovendien, microglia uit verschillende menselijke hersenen kan worden gekweekt voor karakterisering van unieke immuunreacties voor gepersonaliseerde geneeskunde en een groot aantal therapeutische toepassingen.

Inleiding

Het centrale zenuwstelsel (CNS) is opgebouwd uit een complex netwerk van neuronen en gliacellen¹. Onder de gliacellen functioneert microglia als de aangeboren immuuncellen van het CNS^2,3. Microglia is verantwoordelijk voor het behoud van homeostase in het gezonde CNS^4. Microglia spelen ook een belangrijke rol in de neuroontwikkeling, door het snoeien van synapsen². Microglia staan centraal in de pathofysiologie van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder maar niet beperkt tot; De ziekte van Alzheimer⁵, De ziekte van Parkinson⁶, beroerte^7,multiple sclerose⁸, traumatisch hersenletsel⁹, neuropathische pijn¹⁰, dwarslaesie¹¹ en hersentumoren zoals gliomen¹².

Studies met betrekking tot CNS homeostase en ziekten maken gebruik van knaagdier microglia als gevolg van een gebrek aan kostenefficiënte en tijdefficiënte menselijke primaire microglia isolatie protocollen¹³. Knaagdier microglia lijken op primaire menselijke microglia in expressie van genen zoals Iba-1, PU.1, DAP12 en M-CSF receptor en zijn effectief geweest in het begrijpen van normale en zieke hersenen¹³. Interessant is dat de expressie van verschillende immuungerelateerde genen zoals TLR4, MHC II, Siglec-11 en Siglec-3 varieert tussen menselijke en knaagdiermicroglia¹³. De expressie van verschillende genen varieert ook in temporele expressie en in neurodegeneratieve ziekten bij beide soorten^14,15. Deze significante verschillen maken menselijke microglia een essentieel model om microgliafunctie in homeostase en ziekte te bestuderen. Primaire menselijke microglia kan ook een effectief instrument voor preklinische screening van potentiële kandidaat-geneesmiddelen¹⁶. De bovengenoemde redenen onderstrepen de groeiende behoefte aan kosteneffectieve protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia.

We hebben een protocol ontwikkeld voor isolatie van primaire menselijke microglia van volwassen menselijk hersenweefsel verzameld als gevolg van chirurgisch venster gemaakt voor tumorresecties of andere chirurgische resecties. De methode hier is aanzienlijk anders dan bestaande methoden. We waren in staat om te isoleren en cultuur microglia na een transittijd van ongeveer 75 minuten van de weefsel collectie site te starten van de isolatie protocol in het laboratorium. We hebben de supernatant van L929 fibroblastcellen gebruikt om de groei van geïsoleerde microglia te bevorderen. Deze methode richt zich specifiek op de cultuur en ontwikkeling van alleen primaire microglia. De resulterende cultuur voorbereid is ongeveer 80% microglia. Terwijl andere protocollen zorgen voor een verrijkte cultuur van microglia door dichtheidgradiëntcentrifugatie, stroomcytometrie en magnetische kralen, is het protocol een snelle, eenvoudige, robuuste en kosteneffectieve manier om primaire menselijke microglia¹⁷,^18,,19,20te verkreeden .^, De mogelijkheid om chirurgisch verwijderd levend volwassen hersenweefsel te gebruiken in plaats van vaste hersenweefsels van kadavers bewijst een extra voordeel van deze methode in tegenstelling tot de bestaande procedures^18,21.

Protocol

Alle weefsels werden verworven na ethische goedkeuring van het instituut ethische commissies van het Indian Institute of Technology Jodhpur en All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.

1.Weefselverwerving en -verwerking (dag 0)

1. Verzamel het weefsel in een buis van 50 mL met 10 mL ijskoude kunstmatige hersenvocht (aCSF) (2 mM CaCl₂∙2H₂O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 202 mM sucrose)²⁰. Zorg ervoor dat de buis op ijs wordt gehouden als het weefsel naar een andere locatie moet worden overgebracht.
   LET OP: Bereid aCSF voor in automatisch gedestilleerd water. Filter het met 0,22 μm spuitfilter in de laminaire kap. Deze kan 1 maand worden bewaard bij 4 °C.
2. Veeg de opvangbuis zorgvuldig af met 70% alcohol en breng over naar een aseptische laminaire luchtstroomkamer.
3. Gooi aCSF voorzichtig weg en weeg weefsel in een aseptische conditie. Weefselgewicht is essentieel om het volume van trypsin-EDTA te berekenen dat nodig is voor volgende stappen.
4. Houd het weefsel in vers warme aCSF gedurende 5 minuten op 37 °C. Deze stap is van cruciaal belang om celdood te voorkomen.
5. Gooi aCSF weg en was weefsel eenmaal met 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij 37 °C. Zorg ervoor dat al het bloed wordt weggespoeld met herhaalde PBS wasbeurten (indien nodig).
6. Incubeer het weefsel in warme PBS, bij 37 °C, gedurende 5 min.
7. Gooi PBS voorzichtig weg en breng weefsel over naar een gesteriliseerde petrischaal. PBS kan worden verwijderd met een pipet. Dit voorkomt verlies van weefsel.
8. Snijd het weefsel in kleine (ten minste 1 mm³⁾stukken met behulp van een steriele scalpel. Fijn in blokjes gesneden weefsel zorgt voor een hoger weefseloppervlak voor weefseldissociatie door trypsine-EDTA zorgen voor een hogere opbrengst.
9. Breng het in blokjes gesneden weefsel over in een buis van 50 mL met 10 mL/g weefsel van 0,25% trypsin-EDTA en meng door een 10 mL serologische pipet te pipetten. Voeg 2 mL trypsin/EDTA toe aan een petrischaaltje en was de plaat grondig met behulp van pipet. Voeg deze trypsine terug aan de valkbuis. Dit minimaliseert het verlies van weefsel en cellen tijdens het dicing.
10. Broed de buis 30 minuten op een shaker bij 37 °C bij 250 tpm. Deze stap verhoogt de dissociatie van cellen uit weefsel.
11. Voeg aan het einde van de incubatie 10 mL neutraliserend medium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS) toe om trypsine te neutraliseren. Meng met een serologische pipet van 10 mL. De hoeveelheid toegevoegde neutraliserende media moet gelijk zijn aan de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt.
12. Centrifugeren de buis op 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
13. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 1 mL kweekmedium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
    OPMERKING: L929 cellen zijn cultuur in DMEM (DMEM met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS). ATCC aanbevolen cultuur methode moet worden gevolgd voor celcultuur. Supernatant moet worden verzameld uit de cultuurkolf die ten minste 75% confluent is. Het kan in bulk worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C om afbraak van groeifactoren te voorkomen. Het wordt aanbevolen om L929 supernatant afzonderlijk toe te voegen in kolven in plaats van toe te voegen aan het stamcultuurmedium.
14. Plaats de cellen in een T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen, en voeg 4 mL extra kweekmedium toe. Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO₂. Schud de kolf voorzichtig om het weefsel homogeen te verspreiden. Vermijd het brengen van de media naar de nek van de kolf, tijdens het schudden, omdat dit de kans op besmetting kan verhogen.

2.Celcultuur (dag 2)

1. Verzamel de media uit de T-25 cultuurfles bereid op dag 0 in drie 1,5 mL centrifugebuizen door het verzamelen van gelijke hoeveelheid media in elke buis. Was de kolf één keer met 1 x PBS. Schud de kolf voorzichtig om restjes te verwijderen weefselfragmenten links. Vermijd harde schudden van de kolf als eventuele restfragmenten zal geen negatieve invloed op de cultuur. Voeg 5 mL verse cultuurmedia toe aan de kolf.
2. Centrifugeren de verzamelde media op 1.466 x g (4000 rpm) bij 4 °C gedurende 4 minuten.
3. Gooi de supernatant van elke buis en voeg 1 mL cultuurmedium toe aan een van de buizen. Meng grondig met pipet. Voeg in serie de gemengde media met cellen toe aan andere buizen. Meng grondig met pipet en pool de cellen in een buis.
4. Plaats de cellen in een aparte T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen. Voeg 4 mL kweekmedium toe en broed de kolf bij 37 °C met 5% CO_2.

3.Celcultuur (dag 4)

1. Gooi de media uit beide kolven en voeg verse 5 mL cultuur media aan de kolf.
2. Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 2 dagen.

4. Celcultuur (dag 6)

1. Cellen zullen klaar zijn voor verdere experimenten.

Resultaten

Door het bovengenoemde protocol te gebruiken (Figuur 1), konden we primaire menselijke microglia isoleren van levende chirurgisch gereseceerde hersenweefsels. Gekweekte cellen werden gekleurd met Ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine voor microglia (groen) en met glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP) voor astrocyten (rood) (figuur 2) zoals eerder beschreven^22,23

Discussie

Microglia zorgen voor homeostase in de normale hersenen en spelen een centrale rol in de pathofysiologie van verschillende neurologische ziekten⁴. Microglia staan centraal in de neuroontwikkeling en vorming van synapsen². Microgliale studies hebben bewezen cruciaal te zijn in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van diverse neurologische ziekten⁴. Knaagdier microglia zijn de heersende model van keuze voor primaire microglia studies, hoewel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibiotic-Antimycotic oplossing	Himedia	A002
Calciumchloride	Sigma	223506
Centrifuge (4 °C)	Sigma	146532
Centrifugebuizen	Abdos	P10203
CO2 incubator	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose	Himedia	GRM077
DMEM-medium met glutamine	Himedia	AL007S
Foetaal bovien serum	Himedia	RM9955
Flaconbuis (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
Fluoresceïne Ricinus communis agglutinine-1	Vector	FL-1081
Fluorescente microscoop	Leica	DM2000LED
Fluoroshield met DAPI	Sigma	F6057
GFAP-antilichaam	GA5	3670S
Incubator shaker	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929-cellijn	ATCC	NCTC clone 929 [L-cel, L-929, derivaat van Strain L] (ATCC CCL-1)
Laminaire luchtstroom	Thermo Fsiher Scientific	1386
Magnesiumchloride	Himedia	MB040
Mononatriumfosfaat	Merck	567545
Nutrient Mixture F-12 Ham Medium	Himedia	Al106S
Petrischaal	Duran Group	237554805
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Himedia	ML023
Kaliumchloride	Himedia	MB043
Serologische pipet	Labware	LW-SP1010
Natriumbicarbonaat	Himedia	MB045
Sucrose	Himedia	MB025
Spuitfilter (0.2μ, 25 mm diameter)	Axiva	SFPV25R
T-25 weefselkweekkolven geschikt voor adherente celkweek.	Himedia	TCG4-20X10NO
Trypsine-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056