Verbeterde UPLC-UV-methode voor de kwantificering van vitamine C in sla variëteiten(Lactuca sativa L.) en Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Summary

We presenteren een snelle en betrouwbare methode om vitamine C te kwantificeren in Lactuca spp. met behulp van UPLC-UV, mogelijk overdraagbaar naar andere planten. De belangrijkste stappen zijn de monsterbereiding en vitamine C-extractie onder stabiele omstandigheden, de vermindering van dehydroascorbinezuur tot ascorbinezuur en de optimalisatie van de chromatografische procedure.

Abstract

Vitaminen, vooral vitamine C, zijn belangrijke micronutriënten gevonden in groenten en fruit. Vitamine C is ook een belangrijke bijdrage aan hun antioxidant capaciteit. Sla is een van de meest populaire groenten onder consumenten wereldwijd. Een nauwkeurig protocol om het vitamine C-gehalte in sla en andere verwante soorten te meten is cruciaal. We beschrijven hier een methode met behulp van de ultra-high-performance vloeistofchromatografie-ultraviolet (UPLC-UV) techniek, waarbij monsterpreparaat, vitamine extractie en chromatografie voorwaarden werden geoptimaliseerd.

Monsters werden verzameld om de hele plant te vertegenwoordigen, bevroren bij -80 °C en lyofiel om ongewenste oxidatie te voorkomen en hun manipulatie gemakkelijker te maken. De extractie van vitamine C werd uitgevoerd in zure media, wat ook bijdroeg aan de stabiliteit ervan. Aangezien vitamine C aanwezig kan zijn in twee verschillende interconvertible vormen, ascorbinezuur (AA) en dehydroascorbinezuur (DHAA), moeten beide verbindingen worden gemeten voor nauwkeurige kwantificering. De DHAA werd indirect gekwantificeerd na de verlaging tot AA omdat AA een hogere absorptiviteit vertoont dan DHAA in het UV-bereik van het spectrum. Uit hetzelfde extract werden twee metingen uitgevoerd, één voor en één na die reductiereactie. In het eerste geval kwantificeren we het AA-gehalte, en in het tweede geval kwantificeerde we de som van AA en DHAA (TAA: totaal ascorbinezuur) in de vorm van AA. Vervolgens werd dhaa-hoeveelheid indirect verkregen door AA af te trekken uit de eerste meting van TAA. Ze werden bepaald door UPLC-UV, met behulp van een commerciële AA-standaard om een kalibratiecurve te bouwen en het optimaliseren van de chromatografische procedure, om AA-pieken te verkrijgen die in korte tijd volledig waren opgelost. Dit protocol kan gemakkelijk worden geëxtrapoleerd naar ander plantaardig materiaal met lichte of geen veranderingen. De nauwkeurigheid ervan bracht statistisch significante verschillen aan het licht die anders niet werden waargenomen. Andere sterke punten en beperkingen worden dieper in het manuscript besproken.

Introduction

Geteelde sla (Lactuca sativa L.) is een van de meest geproduceerde en geconsumeerde bladgroenten wereldwijd, met een totale productie van ongeveer 27,3 miljoen ton in 2018¹. Sla wordt door de consument als gezond ervaren. De voedingseigenschappen worden voornamelijk toegeschreven aan de bron van antioxidantverbindingen in het gewas, zoals vitamine C, onder andere zoals polyfenolen en vitamine E². Vitamine C is een essentiële micronutriënten voor de mens in tegenstelling tot veel andere gewervelde dieren, omdat we niet in staat zijn om het te produceren als gevolg van mutaties aanwezig in de gen codering voor de laatste stap enzym in de biosynthetische route³. Het is vereist voor een normale celmetabolisme en het speelt ook een belangrijke rol in de immuunresponsen voornamelijk als gevolg van de anti-oxidant activiteit^3,4.

Totaal vitamine C bestaat uit ascorbinezuur (AA) en dehydroascorbinezuur (DHAA). AA is de meest biologisch actieve vorm van de vitamine, maar DHAA (zijn oxidatieproduct) vertoont ook biologische activiteit en kan gemakkelijk worden omgezet in AA in het menselijk lichaam⁵. Daarom is het kwantificeren van beide vormen belangrijk om het totale vitamine C-gehalte van een tuinbouwgewas te bepalen, inclusief sla.

Er is een breed scala aan benaderingen gebruikt op basis van verschillende analytische technieken om vitamine C in groenten te meten, zoals enzymatische, spectrofotometrische en titrimetrische methoden^6,7,8. Hoewel deze methoden eenvoudig zijn, zijn ze niet chemisch specifiek voor AA^9. Daarom hebben chromatografische methoden de voorkeur, met name de high-performance vloeistofchromatografie-ultraviolette (HPLC-UV) techniek, vanwege hun hogere nauwkeurigheid¹⁰. HPLC-UV is gebruikt om vitamine C te bepalen in een grote diversiteit aan gewassen, zoals broccoli, spinazie en sla^11,12,13. De gelijktijdige kwantificering van AA en DHAA is echter ingewikkeld vanwege de lage absorptie van DHAA in het UV-bereik van het spectrum. Als alternatief kan DHAA indirect worden bepaald door een reducerend middel te gebruiken dat DHAA omzet in AA, het totale ascorbinezuur (TAA) meet en vervolgens het verschil tussen TAA en AA berekent. Vanwege de noodzaak van een verminderingsreactie is in sommige studies alleen AA gekwantificeerd¹⁴, wat eigenlijk een onderschatting van de vitamine C-activiteit zou kunnen vertegenwoordigen. Die extra reductiereactie is ook nodig om DHAA indirect te bepalen, zelfs wanneer de laatste vooruitgang in vloeibare chromatografietechnieken, ultra-high performance liquid chromatografie (UPLC), wordt gebruikt. Deze stap profiteert ook van de voordelen die UPLC biedt in vergelijking met HPLC: hogere efficiëntie en resolutie, verhoogde gevoeligheid, kortere tijdanalyse en lager oplosmiddelverbruik¹⁵. Bijgevolg is uplc-UV techniek gebruikt om vitamine C te kwantificeren in verschillende gewassen¹⁶.

Bovendien is AA een zeer labiel molecuul; daarom is het belangrijk om een protocol te ontwikkelen dat de afbraak ervan tijdens slaopslag en vitamine C-analyse^{voorkomt 9}. In deze context biedt het volgende protocol een snelle en verbeterde kwantificering van het vitamine C-gehalte in sla door UPLC-UV, evenals een efficiënte extractieprocedure. Niet alleen elite cultivars zijn opgenomen in de huidige studie, maar ook traditionele landrregen en enkele wilde familieleden vanwege hun potentiële interesse in de teelt van gewassen, met name in de verbetering van de voedingswaarde van sla.

Protocol

1. Plantaardige materiaalpreparaat

1. Monster ten minste twee bladeren per plant in 50 mL polypropyleenbuizen, een buitenste (oudere) en een binnenste (jongere) om de hele plant nauwkeuriger weer te geven. Verzamel ten minste drie biologische replica's voor elk monster.
2. Bevries ze onmiddellijk met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de vloeibare stikstof niet in de buizen komt; anders kunnen ze ontploffen wanneer ze worden verwijderd als gevolg van de gasuitbreiding tijdens de verdamping.
   LET OP: Handschoenen en een gezichtsschild zijn vereist vanwege de mogelijke gevaren die gepaard gaan met het gebruik van vloeibare stikstof.
3. Haal de doppen uit de buizen en leg ze op de trays in de vriesdrogerkamer van de lyofielieverband (Tabel van materialen) geprogrammeerd als volgt: -25 °C voor 72 uur, -10 °C gedurende 10 uur, 0 °C voor 10 uur en 20 °C gedurende ten minste 4 uur. Houd de condensortemperatuur en de vacuümconstante tijdens het vriesdroogproces op respectievelijk -80,2 °C en 112 mTorr.
4. Wanneer het materiaal volledig droog is (tussen 4 en 7 dagen, afhankelijk van de plant en de mate van verdichting in de buis), bewaar dan bij respectievelijk 4 °C, -20 °C of -80 °C (dagen tot weken), medium (maanden) of lange (jaren) opslag. Het is raadzaam zakken met silicagelkralen in de monsterhoudende buizen op te nemen.
5. Plaats de gelyofilifiseerde monsters in 20 mL polypropyleen buizen samen met 10 mm diameter roestvrijstalen ballen en maal ze met een multitube vortexer met behulp van de intensiteit en tijd die nodig is om een fijn stof te verkrijgen.
   OPMERKING: Bescherm de monsters tijdens het hele proces tegen blootstelling aan direct licht.

2. Reagens en oplossingsvoorbereiding

1. Bereid de oplosmiddelextractieoplossing voor: 8% azijnzuur (v/v), 1% MPA (metafos fosforzuur) (w/v), 1 mM EDTA (ethyleenediaminetetraacetisch zuur).
   1. Bereken het totale volume oplosmiddel dat nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 5 mL aan elk wordt toegevoegd. Om 1 L van de oplossing te bereiden, voeg je toe aan een kolf: 30 g MPA, 0,372 g EDTA-uitdrogen, 80 mL azijnzuur en 500 mL ultrazuiver water (schaalvolumes en hoeveelheden dienovereenkomstig). Sluit de kolfmond af met plastic folie.
   2. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric fles om nauwkeurig te meten 1 L, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water.
2. Bereid de reductiereactiebuffer (0,5 M Tris (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propaandiol) pH 9.0) en reduceeroplossing (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) met 0,5 M Tris pH 9.0).
   1. Bereken het totale volume van de reducerende oplossing die nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 200 μL aan elk van deze μL wordt toegevoegd. Om 100 mL van de buffer voor te bereiden, voegt u toe aan een beker: 6.055 g Tris en 90 mL ultrazuiver water (schaalvolumes en hoeveelheden dienovereenkomstig). Sluit de bekermond af met plastic folie.
   2. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, pas de oplossing aan op pH 9.0 door 2 M HCl toe te voegen en gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig 100 mL te meten, waarbij het nodige ultrazuiver water wordt toegevoegd.
   3. Om 100 mL van de reduceeroplossing voor te bereiden, voegt u toe aan een beker: 0,629 g DTT (zuiverheid: 98%) en 90 mL van de buffer (0,5 M Tris pH 9.0) eerder voorbereid (2.2.1 tot 2.2.2). Schaal volumes en hoeveelheden dienovereenkomstig. Sluit de bekermond af met plastic folie.
   4. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige volume van buffer 0,5 M Tris pH 9.0.
      LET OP: De reducerende oplossing is zeer instabiel. Daarom wordt een vers gemaakte oplossing sterk aanbevolen.
3. Zwavelzuur (0,4 M H₂SO₄)
   1. Bereken het totale volume van 0,4 M zwavelzuur dat nodig is om de hele set monsters te verwerken, rekening houdend met het feit dat er 200 μL aan elk wordt toegevoegd. Om 100 mL van de oplossing voor te bereiden, voeg toe aan een beker: 80 mL ultrazuiver water en vervolgens 2,22 mL H₂SO₄ (zuiverheid: 96%, dichtheid: 1,84 g mL^-1). Gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water.
      LET OP: Zwavelzuur is zeer corrosief, dus het moet worden behandeld met behulp van beschermende apparatuur en onder de motorkap. Bovendien moet het zuur worden toegevoegd aan ultrazuiver water, en niet water aan zuur, om dampen te verminderen en ongevallen te voorkomen.
4. Zoutzuur (2 M HCl).
   1. Om 100 mL zoutzuur van 2 M voor te bereiden, voeg toe aan een beker: 80 mL ultrazuiver water en vervolgens 6,13 mL HCl (zuiverheid: 37%, dichtheid: 1,19 g mL^-1). Sluit de bekermond af met plastic folie. Gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige ultrazuiver water. Schaal volumes dienovereenkomstig.
      LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief, dus het moet worden behandeld met behulp van beschermende apparatuur en onder de motorkap. Bovendien moet het zuur worden toegevoegd aan ultrazuiver water, en niet water aan zuur, om dampen te verminderen en ongevallen te voorkomen.
5. AA-norm (voorraad en verdunningen)
   1. Weeg precies 10 mg AA-standaard (zuiverheid: 99%) met behulp van een precisiebalans en voeg 90 mL mobiele fase (ultrazuiver water pH 2.0 met mierenzuur).
   2. Eenmaal opgelost met behulp van een magnetische roerder, gebruik een volumetric fles om nauwkeurig te meten 100 mL, het toevoegen van de nodige volume van ultrazuiver water pH 2.0 met mierenzuur.
      LET OP: Bescherm deze voorraadoplossing tegen blootstelling aan licht.
   3. Bereid vijf verdunningen uit de voorraad van de AA-norm voor om een kalibratiecurve te verkrijgen volgens de instructies in tabel 1 en ga verder met stap 5.2.

Standaard	[AA] (μg mL-1)	AA (100 μg mL-1)oplossing (μL)	Mobiele fase (μL)een
1	0.5	5	995
2	2.5	25	975
3	5	50	950
4	10	100	900
5	25	250	750
a. Ultrazuiver water pH 2.0 verzuurd door mierenzuur.

Tabel 1: Protocol voor de voorbereiding van vijf normen van AA (ascorbinezuur). Volumes van oplosmiddel en oplosmiddel om elk van de verschillende concentraties van de normen voor te bereiden worden aangegeven.

3. Extractie van AA en DHAA

LET OP: Het wordt aanbevolen om te werken onder omstandigheden met weinig licht intensiteit tijdens de extractiestappen.

1. Voeg aan een polypropyleencentrifugebuis van 15 mL 50 mg lyofiel grondmonster en 5 mL van het extractieoplosmiddel toe (stap 2.1).
2. Schud het mengsel met behulp van een vortex voor 5 s en vervolgens een orbitale shaker voor 10 min bij 2000 rpm.
3. Introduceer de buis in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met echografie geactiveerd.
4. Centrifuge bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
5. Neem de supernatant, geef het door een 0,22 μm geregenereerd cellulosefilter en bewaar het in een 5 mL amber flacon. Dit is Extract 1, dat AA en DHAA bevat.
   OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken door de extracten bij -80 °C te bevriezen en hen te beschermen tegen blootstelling aan licht, aangezien AA en DHAA zeer instabiel zijn en gemakkelijk degraderen in aanwezigheid van licht, bij hoge temperaturen of onder oxiderende atmosferen(supplementisch bestand 1).

4. DHAA-reductie naar AA om TAA te extraheren

1. Breng 200 μL extract 1 over naar een 2 mL amberblad voor vloeibare chromatografie en voeg 200 μL van de reduceeroplossing toe (stap 2.2). Sluit de flacon met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en schud het met een vortex voor 5 s.
2. Laat de oplossing 30 minuten op kamertemperatuur staan en bescherm tegen licht.
3. Voeg 200 μL 0,4 M H₂SO₄ toe om de reactie te stoppen en AA te stabiliseren in zure pH. De resulterende oplossing is Extract 2, die alleen AA bevat en eigenlijk TAA is.

5. Vaststelling

1. UPLC-UV voorbereiding
   1. Bereid de in tabel 2beschreven werkoplossingen voor, op passende wijze gefilterd door 0,22 μm filters, gesoond gedurende ten minste 10 minuten en plaats ze in het UPLC-systeem.
   2. Schakel de drie UPLC-modules in en wacht tot het interne kalibratieproces is voltooid.
   3. Open de software (bijvoorbeeld Empower 3) en laad het in tabel 2beschreven instrumenteel programma : Empower 3 | Monsters uitvoeren | Vitamine C-methode | UPLC_PDA | Gebruik QuickStart.
   4. Zodra de software is geladen met het juiste programma, toegang tot de UPLC management console: Quaternary Solvent Manager | Klik met de rechtermuisknop | Console starten.
   5. Overgaan tot de voorbereiding en stabilisatie van het UPLC-instrument: Systeem | Controle | Opstarten.
      1. Alle UPLC-lijnen gedurende ten minste 5 min zuiveren: Prime Solvents | QSM | Controleer A, B, C, D en Seal Wash | Duur van priemgetal > 5 min.
      2. Zuiveren en reinigen van de injector: Prime Solvents | SM | Controleer Wasmiddel (> 45 s) en Controleer purge oplosmiddel (> 35 cycli).
      3. Equilibrate UPLC aan methodevoorwaarden: Equilibrate aan Methode | QSM | Stroom (0,3 m L min^-1) | Oplosmiddel A (2%) | Oplosmiddel B (0%) | Oplosmiddel C (98%) | Solvent D (0%); Evenwicht met de methode | SM | Monster (5 °C) | Kolom (30 °C) en Equilibrate naar methode | Overige | Lamp controleren | Druk op Start.
      4. Wacht minstens 1 uur (nog meer tijd wordt aanbevolen) voor de apparatuur te stabiliseren. Stabiliteit kan worden gecontroleerd bij het controleren van de druk in de kolom in de startconsole: Systeem | Quaternaire oplosmiddelbeheerder | QSM-systeemdruk. Zorg ervoor dat er geen identificeerbare trends zijn in drukveranderingen (stijgt of daalt) en dat de deltawaarde minder dan 10 psi bedraagt.
   6. Vul in het QuickStart-scherm de matrix met de namen van de te analyseren standaarden en monsters.
2. AA bepaling in de normen
   1. Breng 1 mL van elk van de vijf eerder voorbereide AA-normen (stap 2.5.3) over op 2 mL amberfol flacons voor vloeibare chromatografie. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument.
   2. Voer de chromatografie uit volgens de in tabel 2 beschreven procedure, uitgaande van de meest verdund tot meest geconcentreerde.
3. AA bepaling in de monsters
   1. Pipette 200 μL extract 1 in een 2 mL amberfuit voor vloeibare chromatografie en voeg 800 μL ultrazuiver water toe. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument.
   2. Voer de chromatografie uit volgens de procedure van tabel 2.
4. TAA bepaling in de monsters
   1. Voeg 400 μL ultrazuiver water toe aan Extract 2. Sluit het flesje met een PTFE-siliconen stekker met voor-opening en injecteer 5 μL in het UPLC-instrument.
   2. Voer de chromatografie uit volgens de procedure van tabel 2.

Componenten en parameters	Beschrijving
Instrument	Vrijspraak UPLC H-Klasse
Detector	PDA eλ Detector λabs voor AA=245 nm
Software	Empower 3
Kolom	Vrijspraak UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm)
Kanaal A	CH3OH
Kanaal B/Wash	H2O:CH3OH (50:50 v:v)
Kanaal C	Ultrazuiver water pH 2.0 verzuurd door mierenzuura
Kanaal D/Seal Wash	Ultrazuiver water:acetonitril (90:10 v:v)
Mobiele fase	0,3 mL min-1 van 2%A + 98%C (isocratische modus)
Kolomtemperatuur	30 °C
Autosampler temperatuur	5 °C
Injectievolume	5 μL
AA retentietijd	1.874 min
Looptijd	3 min
a. Onbepaald volume mierenzuur gebruikt tot pH-aanpassing

Tabel 2: Chromatografische procedure geoptimaliseerd om AA (ascorbinezuur) te bepalen in extracten van sla en wilde verwanten. Beschrijving van de gebruikte componenten, voorwaarden en oplossingen.

6. Kwantificering van AA en DHAA

1. Statistische analyse
   1. Bepaal de analytische parameters van de chromatografische methode zoals beschreven door Bertolín et al.¹⁸ (tabel 3).
      OPMERKING: De waarden van de parameters die in tabel 3 worden weergegeven, moeten onder specifieke experimentele omstandigheden worden gedefinieerd.

Analytische parameters van de methode	Waarden
Lineair bereik (μg mL-1)	0.5-25
Lineaire vergelijking	y=53.143,03x
R2.	0.99998
Detectielimiet (mg AA g-1 van droge stof)	0.013
Limiet van kwantificering (mg AA g-1 van droge stof)	0.045
Herhaalbaarheid (CV, %)een	1.75
Tussentijdse precisie (CV, %)een	4.22
Herstel (Rec, %)b	95±2,4
a. CV: variatiecoëfficiënt
b De hersteltest werd uitgevoerd met 10 aliquots die 50 mg van hetzelfde monster bevatten, 5 verrijkt met 2 mg AA g-1 droge stof en 5 niet-spiked. %Rec=([AA]spiked sample-[AA]sample)/(AA]spiked)x100.

Tabel 3: Geoptimaliseerde analytische parameters voor de detectie en kwantificering van AA (ascorbinezuur) en TAA (totaal ascorbinezuur). Het lineaire bereik, de vergelijking en de bepalingscoëfficiënt van de kalibratiecurve (R^2),evenals de grenzen van detectie en kwantificering van AA (hetzelfde voor TAA), en de herhaalbaarheid, tussenprecisie en terugwinning werden verkregen met een monsterinjectievolume van 5 μL.

2. Bereken de AA- en TAA-concentratie.
   1. Open de standaard- en monsterchromatogrammen: QuickStart | Browse Project | Kanalen | "naam van de norm of het monster" | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm.
   2. Integreer de overeenkomstige piek (AA of TAA) in de normen en monsters door op het startpunt (ongeveer 1.790 min) te klikken en deze met de muis naar het eindpunt (ongeveer 1.910 min) te slepen.
   3. Bouw een kalibratiecurve die de chromatografisch bepaalde absorptiewaarden (stap 5.2.) vertegenwoordigt tegen de concentratie van de vijf hierboven voorbereide AA-normen (tabel 1).
   4. Interpoleer de absorptiewaarden van de in de stappen 5.3 en 5.4 vastgestelde monsters en verkrijg de AA- en TAA-concentratie met de volgende formule:
      
      wanneer y het geïntegreerde piekgebied is, is x de AA- of TAA-concentratie in ppm en m en n respectievelijk de helling en de y-interceptievan de verkregen regressielijn.
   5. Voor de berekening van de concentratie van DHAA de volgende formule toepassen:
      
      OPMERKING: Om de totale concentraties van de DHAA, AA en TAA in mg g^-1 droog gewicht te verkrijgen, moeten de waarden die rechtstreeks in de kalibratiecurve worden verkregen, worden vermenigvuldigd met het totale extractvolume en de toegepaste verdunningsfactor, en vervolgens worden gedeeld door het gewicht van het monster dat wordt gebruikt om de extractie uit te voeren.

Results

Vitamine C kwantificering in Lactuca matrixen vereist de ontwikkeling van een chromatografische aanpak die betrouwbare resultaten kan garanderen. Figuur 1A toont een chromatogram als gevolg van een niet-geoptimaliseerd protocol(Supplemental File 2), dat een AA-piek presenteert samen met een niet-geïdentificeerde kleine "schouder". Niettemin werd na het verbeteren van de extractie en chromatografische omstandigheden een opgeloste AA-piek bereikt zonder interferenties van onbekende verbindingen (figuur 1B). Bovendien, het gebruik van UPLC-UV-apparatuur in plaats van HPLC-UV konden we de retentie tijd (RT) voor AA te verminderen: 1.874 min in de geoptimaliseerde chromatogrammen versus 2.980 min in de niet-geoptimaliseerde (Figuur 1), evenals de looptijden, 3 en 7 minuten voor de geoptimaliseerde en niet-geoptimaliseerde protocollen, respectievelijk.

Figuur 1: Chromatogrammen van AA in hetzelfde slamonster (commerciële cultivar 'Begoña'). a) HPLC-UV chromatogram als gevolg van een niet-geoptimaliseerd protocol (voorwaarden beschreven in supplemental file 2). (B) UPLC-UV chromatogram verkregen met het geoptimaliseerde protocol (voorwaarden beschreven in tabel 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Interferenties in AA-pieken, zoals die in figuur 1A, resulteerden consequent in onderschatting van vitamine C (AA, DHAA en TAA) gehalte (figuur 2) als gevolg van een onvoldoende scheiding tijdens het chromatografische proces, omdat de overlappende piekgebieden werden geïntegreerd door een verticale daling op het diepste punt ertussen. Deze bias is vooral merkbaar in het geval van de gewaswilde verwanten, met name in DHAA- en TAA-inhoud(figuur 2).

Figuur 2: Verdeling van het gehalte aan vitamine C. Split vioolpercelen van DHAA, AA en TAA-gehalte (mg g^-1 van droog gewicht) in commerciële en traditionele slasoorten en enkele wilde verwanten met behulp van niet-geoptimaliseerde en geoptimaliseerde protocollen. Zwarte lijnen tonen de gemiddelde waarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Bovendien verhinderde het gebruik van een niet-geoptimaliseerd protocol ons om nuttige conclusies uit de resultaten te halen, omdat ze alle monsters lieten zien, zowel de soorten sla als de wilde verwanten, met een vergelijkbaar vitamine C-gehalte. Het geoptimaliseerde protocol stelde ons daarentegen in staat om statistisch significante verschillen tussen hen te detecteren voor DHAA- en TAA-inhoud(tabel 4),waarvan de rijkste de wilde soort is(figuur 2).

	Niet geoptimaliseerd		Geoptimaliseerd
	F-ratio	p-waarde	F-ratio	p-waarde
DHAA DHAA	0.460	0.637ns	5.613	0.009**
Aa	0.070	0.932ns	1.020	0.374ns
Taa	0.015	0.985ns	4.438	0.022*
ns, * en ** geven niet significant en significant aan bij respectievelijk p<0,05 en 0,01.

Tabel 4: Variatie in het gehalte aan vitamine C. F-ratio's (quotiënten van twee varianties, de tussengroepvariantie en de verschillen binnen de groep) en betekeniswaarden van de eenrichtings-ANOVA, rekening houdend met het type Lactuca (commerciële slavariëteiten, traditionele slavariëteiten en gewaswilde familieleden) voor DHAA-, AA- en TAA-gehalte in niet-geoptimaliseerde en geoptimaliseerde protocollen.

Aanvullend bestand 1: AA en TAA stabiliteit bij 5 °C over 24 uur. (A) AA- en TAA-piekgebieden gedurende 24 uur (B) AA en TAA-gehalte (mg g^-1 droog gewicht) gedurende 24 uur. Balken vertegenwoordigen de standaarddeviaties van twee technische replica's (n=2) die bij 5 °C in de autosampler worden bewaard en beschermd tegen blootstelling aan licht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Belangrijkste verschillen tussen het geoptimaliseerde en het niet-geoptimaliseerde protocol voor TAA, AA en DHAA extractie en kwantificering. De gebruikte monsters waren in beide gevallen hetzelfde. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Vitamine C is een zeer belangrijke voedingsstof, maar het is ook een zeer labiele verbinding, dus de UPLC-UV-kwantificering is afhankelijk van meerdere factoren, zoals monsteropslag en -bereiding, extractiemethode en chromatografische omstandigheden. Daarom was een snelle en eenvoudige procedure nodig om AA (met antioxidantkracht) oxidatie naar DHAA (zonder antioxiderende eigenschappen) te voorkomen. Het was ook van cruciaal belang om hoge pH- en temperatuuromstandigheden te vermijden, evenals intens licht en een oxiderende atmosfeer tijdens de monsterbehandeling om de stabiliteit van de verbinding te bevorderen.

Om AA-oxidatie tot een minimum te beperken, werden de volgende maatregelen genomen. Allereerst werden monsters lyofphilized als uitgangspunt voor beide protocollen om een nauwkeurige kwantificering van het vitamine C-gehalte te garanderen en om gemakkelijk monsters te manipuleren. Deze optie kreeg de voorkeur boven fijn slijpen, vaak gevonden in de literatuur¹⁹, als het stof ontdooit zeer snel, zodat het water weer beschikbaar komt. Tijdens de extractieprocedure werd een hoger volume van een zuurdere oplossing (8% azijnzuur en 1% MPA) gebruikt als extractant in het geoptimaliseerde protocol(Supplemental File 2), dat ook als stabilisator fungeerde door AA-afbraak te voorkomen. Deze oplossing bevatte ook EDTA als een chelaatvormer om stabilisatie¹⁶te verhogen , in tegenstelling tot de extractant in het niet-geoptimaliseerde protocol(Supplemental File 2). Bovendien hebben we getest of de extractieprocedure kan worden verbeterd door gebruik te maken van twee opeenvolgende extracties met 2,5 mL extractant in plaats van één met 5 mL en onder een N_2-atmosfeer in plaats van de standaard atmosferische omstandigheden. De beste resultaten werden bereikt met slechts één extractie onder een ongewijzigde atmosfeer, die het protocol vereenvoudigde door onnodige aanvullende stappen te maken (gegevens die niet worden weergegeven). Andere kleine wijzigingen werden ook geïntroduceerd in het protocol om de extractie te verbeteren (d.w.z. sonicatie), een duidelijker extract (fijnere filtratie) te verkrijgen en de protocolduur te verminderen(supplemental file 2). Wat de chromatografische omstandigheden betreft, werd de validatie van de methode uitgevoerd zoals gemeld vóór¹⁸jaar , wat een goede analytische parameters garandeert (tabel 3). Bovendien resulteerde het gebruik van ultrazuiver water met mierenzuur (pH 2.0) en methanol (98:2 v:v) met een 0,3 mL min^-1 stroom, in plaats van monopotassiumfosfaat 30 mM (pH 3.0) op 1 mL min^-1 als de mobiele fase (Supplemental File 2), in een verbeterde methode. De belangrijkste vooruitgang was waarschijnlijk met behulp van een UPLC-systeem in plaats van een HPLC, die ons in staat stelde meer controle van de impact voorwaarden (zoals de temperatuur) en wat resulteert in opgeloste AA pieken zonder storingen door onbekende verbindingen, in een kortere tijd en verbruiken minder volume van extract (Supplemental File 2).

Toch zijn er twee belangrijke beperkingen van deze methode. De eerste is dat DHAA niet direct kan worden gemeten met behulp van een UV-detector vanwege de lage absorptie in het UV-bereik van het spectrum. Het is belangrijk om het DHAA-gehalte te kwantificeren omdat het bepaalde biologische activiteit presenteert en gemakkelijk kan worden omgezet naar AA in het menselijk lichaam⁵. Daarvoor is een extra reactie nodig om DHAA tot AA te reduceren, samen met een tweede chromatografische run om TAA te meten en vervolgens dhaa indirect te bepalen door AA-inhoud af te trekken van TAA (figuur 3). In deze zin is de reductiestap geoptimaliseerd door een hogere concentratie van het reducerende middel (DTT) te gebruiken, de reactietijd te verhogen van 5 naar 30 min en de reactie te stoppen met zwavelzuur(supplementair bestand 2). De lage stabiliteit van AA vormt de tweede beperking van de methode. Als AA begint te degraderen 4 uur na extractie(Supplemental File 1), is het noodzakelijk om het te kwantificeren in dit tijdsinterval. Dus, het aantal monsters te extraheren wordt geconditioneerd door de chromatografische procedure. Daarom stellen we voor om ze te bevriezen bij die stap in dit protocol, maar in dat geval kunnen ze niet allemaal in de UPLC-autosampler worden geplaatst om automatisch te meten. Gelukkig, de verminderde RT voor AA toegestaan ons te verkrijgen 3 min chromatogrammen, veel korter dan de 7 min chromatogrammen verkregen met behulp van HPLC (Supplemental File 2). Vandaar dat het vitamine C-gehalte kan worden bepaald in een groot aantal monsters in een venster van 4 uur.

Figuur 3: Workflow van de kwantificering van vitamine C in sla en enkele wilde familieleden.
Schematisch diagram van het geoptimaliseerde protocol met twee takken voor de bepaling van alleen AA of AA + DHAA (TAA). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Als vitamine C is een essentiële voedingsstof voor de mens en vanwege de belangrijke voordelen voor de gezondheid, het is uitgegroeid tot het voorwerp van vele studies. Daarom is het gekwantificeerd in een grote verscheidenheid aan gewassen, waaronder sla, een van de meest geconsumeerde groenten wereldwijd. Eenvoudige klassieke methoden zijn geleidelijk vervangen door vloeibare chromatografie technieken omdat ze meer specifiek en nauwkeurig¹⁰. Echter, als gevolg van de noodzaak van een extra reactie op het kwantificeren van zowel AA en DHAA via HPLC, in sommige studies over sla, alleen AA¹⁴ of alleen TAA¹¹ (zonder kwantificeren AA voordat de vermindering van DHAA in AA) zijn gemeten. Bovendien hebben slechts een paar auteurs AA en DHAA gekwantificeerd, ondanks de bijdrage van beide moleculen aan vitamine C antioxidant activiteit². Niettemin is uplc techniek de laatste tijd belangrijker geworden vanwege de hogere prestaties bij het meten van vitamine C in verschillende gewassen¹⁶. Door de resultaten van deze studie te vergelijken met de twee methodologieën, UPLC en HPLC, zijn deze voordelen bevestigd: goed gedefinieerde AA-pieken dankzij een hogere gevoeligheid, en in zeer korte tijd, zijn bereikt, wat ook minder middelen verbruikt impliceert. Ondanks de UPLC-efficiëntie hebben alleen Chen et al.²⁰ deze techniek toegepast om het vitamine C-gehalte in sla te meten, wat nog steeds leidde tot een onderschatting omdat alleen de AA-vorm werd gekwantificeerd.

Samengevat, dit werk vertegenwoordigt de eerste succesvolle poging om het totale vitamine C-gehalte te bepalen, niet alleen in verschillende slavariëteiten, maar ook in sommige van hun wilde familieleden. Vitamine C kwantificering is ook essentieel om sla met een hogere antioxidant activiteit binnen fokprogramma's te selecteren. In deze zin, de verhoogde totale vitamine C-gehalte in sla wilde familieleden hier gevonden en de verhoogde AA-gehalte gemeld in eerdere studies¹⁴, evenals andere antioxidant verbindingen²¹, verbreedt de geschikte kandidaten om de voedingswaarde van sla te verbeteren.

Tot slot, zelfs met een aantal beperkingen die inherent zijn aan de aard van vitamine C, zoals de geleidelijke afbraak enkele uren na wordt geëxtraheerd of de noodzaak van een vermindering reactie als gevolg van de lage DHAA UV-absorptiviteit, het biedt een minder arbeids-intense en een minder tijdrovende methode om vitamine C-gehalte te meten. Bovendien is het ook zeer robuust en toont het een hoge gevoeligheid en kracht van resolutie. Bovendien is het gemakkelijk overdraagbaar, niet alleen naar andere plantaardige materialen met lichte of geen veranderingen, maar ook naar verwerkte producten die de inname van vitamine C via de voeding aan de mens leveren, wat aanleiding geeft tot een breed scala aan toekomstige toepassingen in het opkomende testgebied voor betrouwbare voedselkwaliteit.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm Φ roestvrijstalen bal	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropyleenbuis voor centrifuge	Deltalab	429946
2 mL HPLC amberkleurige fleson	Agilent	5190-9063
2 mL spuit met naald	Deltalab	JS2
20 mL polypropyleenbuizen	Deltalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propaandiol (TRIS) ≥99,9% (titratie)	Roche	10708976001
50 mL polypropyleenbuis	Deltalab	429951
Azijnzuur (CH3COOH) ≥99% puurheid glazuur, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitril, HPLC super gradiëntkwaliteit (99,9+% CH3CN-0,2 µm gefiltreerd)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 kolom (150 mm x 2,1 mm x 1,8 µm)	Waters	186003540
Kolf 1 L, 200 mL	Deltalab	191725, 191722
Dikaliumfosfaat (KH2PO4)	Panreac	766384	Alleen in het niet-geoptimaliseerde protocol (aanvullend bestand 2)
Etheen-diaminetetraazijnzuur Dinatriumzout (EDTA x 2H2O) 99-101% bepaling, ACS-reagens	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Mierenzuur 98-100% voor HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Vriesdroger VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 uitgerust met een eλ Detector	Hewlett Packard	na	Alleen in het niet-geoptimaliseerde protocol (aanvullend bestand 2)
Zoutzuur (HCl) 37% puurheid, ACS-reagens	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbinezuur ≥99%, ACS-reagens	Sigma-Aldrich	255564
Meta-fosforzuur (MPA) ACS-reagens, chips, 33,5-36,5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99,9% (HPLC supergradiëntkwaliteit)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipetten 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer kolom (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Alleen in het niet-geoptimaliseerde protocol (aanvullend bestand 2)
PTFE-siliconen dop met voorboring	Agilent	5190-9067
Gekoelde centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Geregenereerde cellulosefilters 0,22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Geregenereerde cellulosefilters 0,45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Alleen in het niet-geoptimaliseerde protocol (aanvullend bestand 2)
Spectrofotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Zwavelzuur (H2SO4) 95,0-98,0% puurheid, ACS-reagens	Sigma-Aldrich	258105
Ultrazuiver water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetrische kolven 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class uitgerust met een PDA eλ Detector	Waters	na