Methodenartikel

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

DOI:

10.3791/61446

⸱

15 mei 2020

 ,  ,  , 
1Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Penn State College of Medicine, Penn State Hershey Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de stapsgewijze procedure voor het kweken en differentiëren van embryonale stamcellen van muizen in neuronale afstammingslijnen, gevolgd door een reeks testen om de gedifferentieerde cellen te karakteriseren. De embryonale stamcellen van de E14-muis werden gebruikt om embryoïde lichamen te vormen via de hanging drop-methode en vervolgens geïnduceerd om te differentiëren in neurale voorlopercellen door retinoïnezuur en uiteindelijk gedifferentieerd in neuronen. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR) en immunofluorescentie-experimenten onthulden dat de neurale voorlopers en neuronen overeenkomstige markers vertonen (nestine voor neurale voorlopers en neurofilament voor neuronen) op respectievelijk dag 8 en 12 postdifferentiatie. Flowcytometrie-experimenten op een E14-lijn die een Sox1-promotorgestuurde GFP-verslaggever tot expressie bracht, toonden aan dat ongeveer 60% van de cellen op dag 8 GFP-positief is, wat wijst op de succesvolle differentiatie van neurale voorlopercellen in dit stadium. Ten slotte werd RNA-seq-analyse gebruikt om de wereldwijde transcriptomische veranderingen te profileren. Deze methoden zijn nuttig voor het analyseren van de betrokkenheid van specifieke genen en paden bij het reguleren van de celidentiteitstransitie tijdens neuronale differentiatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds hun eerste afleiding van de binnenste celmassa van de zich ontwikkelende muizenblastocysten1,2,zijn embryonale stamcellen van muizen (mESC) gebruikt als krachtige hulpmiddelen om zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen te bestuderen3. Bovendien leidt het bestuderen van mESC-differentiatie tot een enorm begrip van moleculaire mechanismen die de efficiëntie en veiligheid in op stamcellen gebaseerde therapie bij de behandeling van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen kunnen verbeteren4. In vergelijking met diermodellen biedt dit in vitro systeem veel voordelen, waaronder eenvoud in praktijk en beoordeling, lage kosten bij het onderhouden van cellijnen in tegenstelling tot dieren en relatief gemak bij genetische manipulaties. De efficiëntie en kwaliteit van gedifferentieerde celtypen worden echter vaak beïnvloed door verschillende lijnen van mESCs en de differentiatiemethoden5,6. Ook zijn de traditionele assays om de efficiëntie van differentiatie te evalueren afhankelijk van kwalitatief onderzoek van geselecteerde markergenen die geen robuustheid hebben en daarom geen wereldwijde veranderingen in genexpressie begrijpen.

Hier willen we een batterij testen gebruiken voor systematische beoordeling van de neuronale differentiatie. Met behulp van zowel traditionele in vitro analyses op geselecteerde markers als RNA-seq, zetten we een platform op voor het meten van de differentiatie-efficiëntie en de transcriptomische veranderingen tijdens dit proces. Op basis van een eerder vastgesteld protocol7genereerden we embryoïde lichamen (EB's) via de hanging drop-techniek, gevolgd door inductie met behulp van suprafysiologische hoeveelheid retinoïnezuur (RA) om neurale voorlopercellen (NPC's) te genereren, die vervolgens werden gedifferentieerd naar neuronen met neuraal inductiemedium. Om de efficiëntie van de differentiatie te onderzoeken, voerden we, naast traditionele RT-qPCR- en immunofluorescentie (IF) -assays, RNA-seq- en flowcytometrie uit. Deze analyses bieden uitgebreide meting van de progressie van de stadiumspecifieke differentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mESC cultuur

  1. Bestrijk een met weefselkweek behandelde plaat van 10 cm met 0,1% gelatine en laat de gelatine minstens 15-30 minuten uitharden voordat u deze opzuigt.
  2. Zaad γ doorstraalde embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) één dag voordat de mESCs worden gekweekt in het voorverwarmde mESC-medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) met 15% foetaal runderserum (FBS), niet-essentiële aminozuren, β-mercaptoethanol, L-glutamine, penicilline / streptomycine, natriumpyruvaat, LIF, PD0325901 (PD) en Chir99021 (CH)).
  3. Laat de γ bestraalde MEF's bezinken en hechten aan het plaatoppervlak voordat u E14-cellen kweekt.
  4. Ontdooi E14 SER's in een waterbad van 37 °C en breng de cellen snel over in een conische buis van 15 cm met warm mESC-medium. Pellet de cellen op 200 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
  5. Resuspend de cellen in 10 ml mESC-medium en plaats de cellen op de kweekplaat met de γ bestraalde MEF's die eerder zijn gezaaid. Incubeer de celkweek in een incubator van 37 °C onder 5% CO2.
  6. Voor kweekpassageing, aspirateer e het medium en was de plaat met steriele 1x PBS. Voeg voldoende 0,05% trypsine toe om het plaatoppervlak te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 3 min.
  7. Neutraliseer de trypsine met mESC-medium en pipet om eencellige suspensie te genereren. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijder het supernatant.
  8. Tel de cellen met een hemocytometer of celteller en zaai ongeveer 5,0 x 105 cellen in een kweekplaat van 10 cm.
  9. Resuspend de cellen in 10 ml mESC-medium, plaats de cellen op de met gelatine bedekte weefselkweekplaat en incubeer culturen zoals eerder beschreven.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat mESCs om de 2 dagen worden gepasseerd om te voorkomen dat de cellen differentiëren in hun kolonies. Fenolrood in het medium functioneert uitsluitend als een pH-indicator en afhankelijk van de cellulaire dichtheid kan het eerder dan 2 dagen geelachtig (zuurder) worden. Daarom kan het nodig zijn om het medium elke dag te veranderen. De γ bestraalde MEF's zullen uiteindelijk na een paar passages afsterven.

2. EB, NPC en neuron differentiatie

  1. Voer het eerder genoemde protocol voor cultuurpassageing uit en tel de cellen (stappen 1.7-1.10).
  2. Hangende druppelmethode (dag 0)
    1. Tel voor een celkweekplaat van 10 cm ongeveer 2,5 x 104 cellen waarbij 5,0 x 102 cellen worden gesuspendeerd in een differentiatiemedium van 20 μL (DMEM met 15% FBS, niet-essentiële aminozuren, β-mercaptoethanol, L-glutamine, penicilline / streptomycine en natriumpyruvaat). Ongeveer vijftig druppels van 20 μL die de cellen bevatten, kunnen op één plaat van 10 cm worden verguld.
    2. Aliquot het juiste aantal cellen en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijder het supernatant.
    3. Resuspend de cellen in het juiste volume differentiatiemedium voor een celdichtheid van 5,0 x10 2 cellen per 20 μL (bijv. 2,5 x 104 cellen in 1 ml differentiatiemedium).
    4. Plaats met behulp van een micropipette of een repeaterpipet 20 μL druppels van de celsuspensie op het deksel van de weefselkweekplaat. Zorg ervoor dat de druppeltjes niet te dicht bij elkaar staan om te voorkomen dat ze samensmelten.
      OPMERKING: De druppels kunnen worden verguld op een met weefselkweek behandelde bevestigingsplaat of ophangplaat, omdat ze op het deksel worden geplaatst en niet op de plaat zelf. Voor een meer haalbare en steriele aanpak plaatst u de druppels op een aanhechtingsweefselkweekplaat en brengt u ze over op een suspensieplaat zoals hieronder beschreven.
    5. Vul de plaat met 5-10 ml 1x PBS en leg het deksel voorzichtig terug op de plaat. Incubeer de kweek in de incubator van 37 °C.
      OPMERKING: PBS wordt toegevoegd aan de kweekplaat om te voorkomen dat de druppels opdrogen.
  3. Gebruik op dag 2een micropipette om de druppels van het deksel te verzamelen en plaats ze in een celcultuursuspensieplaat van 10 cm gevuld met 10 ml differentiatiemedium. Incubeer de cultuur op een orbitale shaker die met lage snelheid in de incubator trilt.
  4. Op dag 4, om de EB's te oogsten, verzamelt u de cellen, centrifugeert u gedurende 3 minuten bij 200 x g en verwijdert u het supernatant.
    OPMERKING: De EB's kunnen ook worden gewassen met 1x PBS volgens de vereisten van volgende experimenten.
  5. Om de procedure voort te zetten en de EB-differentiatie in neurale voorlopercellen (NPC's) te induceren, bereidt u het differentiatiemedium voor met 5 μM retinoïnezuur (RA).
  6. Verwijder het oude medium door de EB's gedurende 3 minuten te pelleteren op 100 x g of laat de EB's bezinken voordat u het oude medium opzuigt. Voeg 10 ml van het differentiatiemedium met 5 μM RA toe aan de kweekplaat.
  7. Vervang op dag 6ten minste de helft van het medium door een vers medium met 5 μM RA door de plaat te kantelen en het medium eruit te pipetteren zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste de helft van het medium te vervangen door een vers RA-bevattend medium op dag 5 en 7. Let op de fenolrode indicator; als het geelachtig wordt, is het het beste om al het medium te vervangen.
  8. Oogst op dag 8de NPC's door de cellen te verzamelen, gedurende 3 minuten op 200 x g te centrifugeren en het supernatant te verwijderen.
    OPMERKING: De NPC's kunnen ook worden gewassen met 1x PBS volgens de behoeften van volgende experimenten. Indien nodig kunnen NPC's worden ingevroren en opnieuw worden ontdooid voor latere kweek en analyse. Als de NPC's moeten worden gekweekt, kan accutase ook worden gebruikt als alternatief voor trypsine.
  9. Om de procedure voort te zetten en NPC's in neuronen te differentiëren, verzamelt u NPC's in een conische buis van 15 ml door centrifugatie, dissocieert u ze met trypsine en incubeert u ze bij 37 °C gedurende 3 minuten. Pipetteer de NPC's om ervoor te zorgen dat alle NPC-aggregaten worden gedissocieerd en neutraliseer het trypsine met het medium.
  10. Filter de cellen met 40 μm nylon celzeef en tel de cellen voordat u ze platlegt met een dichtheid van 1,5 x 105/ cm2 in N2-medium (DMEM / F12-medium + 3 mg / ml glucose + 3 mg / ml lipiderijk runderserumalbumine (LBSA) + 1:100 N2-supplement + 10 ng / ml bFGF + 50 U / ml pen / streptokokken + 1 mM L-glutamine) op een met weefselkweek behandelde plaat voor daaropvolgende PCR- en western blot-experimenten; of op een weefselkweekkamer voor immunofluorescentie-experimenten.
  11. Vervang op dag 9het oude medium door een vers N2 medium.
  12. Schakel op dag 10het N2-medium met N2/B27 medium (50% DMEM/F12 en 50% neurale basaal, 3 mg/ml LBA, 1:200 N2 supplement, 1:100 B27 supplement, 50 U/ml pen/streptokokken en 1 mM L-glutamine).
  13. Oogst op dag 11-12de neuronen als volgt. Was de cellen met 1x PBS, voeg trypsine toe en incubeer de cultuur in de incubator van 37 °C gedurende 3 minuten voordat u de trypsine neutraliseert met medium en centrifugeer op 200 x g gedurende 3 minuten.

3. Karakterisering van mESCs en gedifferentieerde cellen

  1. Alkalische fosfatase (AP) assay
    1. Gebruik een kit om de alkalische fosfatase-activiteit te beoordelen (zie de tabel met materialen).
    2. Verwijder het medium van de kweekplaat en was de SER's met 1x PBS.
    3. Voeg 1 ml van de vaste oplossing (bestaat uit formaldehyde en methanol) die bij de kit is geleverd toe aan de plaat en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende 2-5 minuten.
      OPMERKING: Overincubatie in de oplossing kan de AP-activiteit in gevaar brengen.
    4. Verwijder de vaste oplossing, was de SER's met 1x PBS en laat een bepaalde hoeveelheid PBS in de plaat zitten.
      OPMERKING: Houd de SER's vochtig in PBS om de AP-activiteit niet in gevaar te brengen.
    5. Bereid de AP-oplossing door de A-, B- en C-substraatoplossingen te mengen in een verhouding van 1:1:1. Meng eerst A- en B-oplossingen en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten voordat u de C-oplossing toevoegt.
    6. Verwijder de 1x PBS en voeg de eerder voorbereide AP-oplossing toe.
    7. Incubeer de SER's gedurende ongeveer 15 minuten in het donker door de kweekplaat in te pakken met aluminiumfolie of stap 3.5 uit te voeren in een donkere kamer.
    8. Controleer de reactie en verwijder de reactieoplossing wanneer de oplossing helder wordt om niet-specifieke vlekken te voorkomen.
    9. Was de SER's twee keer met 1x PBS.
    10. Voorkom dat het monster uitdroogt door de SER's af te dekken met 1x PBS of montagemedium.
      OPMERKING: Er verschijnt een rode of paarse vlek voor ap-expressie. De plaat kan worden bewaard in een koelkast van 4 °C.
  2. RT-qPCR
    1. Verzamel cellen in verschillende stadia door de stappen 1.6-1.7 en 2.4 te volgen voor respectievelijk SER's en EG's en NPC's.
    2. Isoleer RNA met behulp van RNA, DNA en eiwitextractieoplossing (zie Tabel met materialen).
    3. Genereer cDNA met een reverse transcriptasekit (zie de tabel met materialen)en volg de handleiding van de fabrikant.
  3. Fixatie en inbedding
    1. Oogst EB's en NPC's zoals hierboven beschreven (stap 2.6) en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder de PFA en was het monster met 1x PBS gedurende 5 min.
    3. Plaats het monster in een seriële verdunning van 1x PBS-, 10%-, 20%- en 30%-sucroseoplossingen bij 25\u201228 °C, waarbij het monster na 30 minuten incubatie wordt overgebracht naar de volgende oplossing.
      OPMERKING: Het monster kan worden opgeslagen in de 30% sucrose-oplossing bij 4 °C voordat wordt verdergegaan met de inbeddingsstap.
    4. Maak de pipetpunt nat met sucrose-oplossing voordat u het monster (zonder ze te stapelen) in het midden van de cryovorm plaatst en pipetteer de overtollige vloeistof eruit.
      OPMERKING: Filtreerpapier kan ook worden gebruikt om de overtollige oplossing te verwijderen. Het bevochtigen van de pipetpunt met sucrose-oplossing is belangrijk om te voorkomen dat de EB's en NPC's aan de wanden van de punt blijven plakken.
    5. Voeg voorzichtig een optimale snijtemperatuuroplossing (OCT) toe aan de mal zonder de monsters opnieuw uit te geven en verwijder overtollige bubbels met een pipet.
    6. Plaats de vorm met het monster op een laboratoriummenger met lage snelheid om het monster gedurende 15 minuten licht te roeren. Dit helpt om de EB's en NPC's naar de bodem te vereffenen als ze worden geresuspendeerd in de OCT-oplossing.
    7. Vries het monster snel in door de mal in vloeibare stikstof of op droogijs te plaatsen.
      OPMERKING: Monsters kunnen worden bewaard in een vriezer van -70 °C voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  4. Cryosectie
    1. Laat de cryostaat afkoelen tot -20 tot -18 °C voordat u het monster naar het instrument overbrengt.
    2. Maak het bevroren OCT-blok los van de mal en bevestig het op de houder met een beetje OCT-oplossing op het oppervlak van de houder.
    3. Lijn het OCT-blok zo uit dat de EB's en NPC's zich het dichtst bij het blad bevinden om ervoor te zorgen dat het monster niet verloren gaat tijdens het sectiewerk.
    4. Snijd voorzichtig 10 μm van het blok en let goed op de plakjes die het monster bevatten.
    5. Plaats de OCT-plak met het monster snel op de weefselinsluitende glasplaat en laat de OCT-plakjes 1 uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De monsters kunnen bij -70 °C worden bewaard voor later gebruik.
  5. Immunofluorescentie (IF)
    1. Blok OCT secties of kweekkamers met neuronen in 10% normaal ezelsserum/0,1% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    2. Incubeer de monsters in primaire antilichamen verdund in 5% normaal ezelserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS gedurende de nacht bij 4 °C.
    3. Was monsters in 1x PBS/0,1% Triton X-100 driemaal gedurende 5 minuten per wasbeurt.
    4. Incubeer de monsters met secundair antilichaam verdund in 5% normaal ezelserum/0,05% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    5. Was monsters in 1x PBS/0,1% Triton X-100 driemaal gedurende 5 minuten per wasbeurt en incubeer de monsters vervolgens in 1 μg/ml DAPI.
    6. Monteer de monsters met een afdekplaat en wat bevestigingsmedium en laat het drogen.
    7. Bekijk de monsters onder een fluorescentiemicroscoop.
  6. RNA-seq analyse
    1. Verzamel de cellen in verschillende stadia en voer RNA-extractie uit (zie stap 3.2).
    2. Bereid de cDNA-bibliotheken voor, voer diepe sequencing en data-analyse uit volgens het protocol beschreven in Wang et al.8.
    3. Voer de Gene Ontology (GO) analyse uit met behulp van het R-pakket, clusterProfiler.
  7. Flowcytometrie
    1. Verzamel SER's door de stappen 1.6-1.7 te volgen en resuspend de cellen in medium. Verzamel de EB's en NPC's door stap 2.4 te volgen en resuspend de cellen in medium.
    2. Filter de celsuspensie met behulp van de 40 μm nylon celzeef in een nieuwe conische buis van 15 ml.
    3. Meet het GFP-signaal van de monsters met behulp van de flowcytometer (uitgevoerd door de kernfaciliteit van de instelling).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als weergave van onze methode voerden we een EB-, NPC- en neurondifferentiatie-experiment uit op E14-cellen. E14-cellen werden gekweekt op γ bestraalde MEF's (figuur 1A) totdat de γ bestraalde MEF-populatie verdunde. We bevestigden de pluripotentie van de E14-cellen door alkalische fosfatase (AP) kleuring(Figuur 1B)en later RT-qPCR (zie hieronder) uit te voeren voor Nanog en Oct4 markers. De γ bestraalde MEF-vrije E14-cellen werden vervolgens g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode voor neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen is al tientallen jaren vastgesteld en onderzoekers zijn doorgegaan met het wijzigen van de vorige protocollen of het creëren van nieuwe protocollen voor verschillende doeleinden7,10,11. We gebruikten een reeks assays om de efficiëntie en voortgang van de differentiatiestadia van mESCs naar neuronen uitgebreid te analyseren, die kunnen worden gebruikt bij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (1R35GM133496-01) aan Z. Gao. We willen Dr. Ryan Hobbs bedanken voor de hulp bij het sectieren. We bedanken de kernfaciliteiten van Penn State College of Medicine, waaronder de Genome Sciences en Bioinformatics, de Advanced Light Microscopy Imaging en de Flow Cytometry. We bedanken ook Dr. Yuka Imamura voor de hulp bij RNA-seq analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1XCorning25-052-CV
0.1% GelatinSigmaG1890-100GBereid in gedeïoniseerd water
16% ParaformaldehydeThermo Scientific28908Verdund in 1X PBS
40-μm cell strainerFalcon352340
AlbumaxThermo Fisher Scientific11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA11001Antilichaam werd verdund tot 1:500 voor IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit IIStemgent00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRoxAzura GenomicsAZ-2105
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSCantoBD657338
bFGFSigma11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626
Chir99021Cayman Chemicals13122
ChloroformC298-500Fisher Chemical
DAPIInvitrogenR37606
DMEMCorning10-017-CM
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320033
EB bufferQiagen19086
Ethanol111000200PharmcoVerdund in gedeïoniseerd water
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501
IsopropanolBDH1133-4LGBDH VWR AnalyticalVerdund in gedeïoniseerd water
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030024
LIFN/AN/AVerzameld uit MEF-supernatant
m18srRNA primersIDTDNAN/A5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acidsCorning25-025-Cl
mNanog primersIDTDNAN/A5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primersIDTDNAN/A5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primersIDTDNAN/A5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primersIDTDNAN/A5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primersIDTDNAN/A5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin primary antibodyMilliporeMAB5326Antilichaam werd verdund tot 1:200 voor IF
Neural basalThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament primary antibodyDSHB2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep KitBioO ScientificNOVA-5138-07
PD0325901Cayman Chemicals13034
Penicillin/streptomycinCorning30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS)N/AN/ABereid in gedeïoniseerd water
- KaliumchlorideP217-500GVWR
- Kaliumfosfaat monobasisch anhydrous0781-500GVWR
- NatriumchlorideBP358-10Fisher Bioreagents
- Natriumfosfaat, dibasisch, heptahydraatSX0715-1Milipore
Random hexamer primerThermo ScientificSO142
Retinoic acidSigmaR2625Bereid in DMSO
NatriumpyrovaatCorning25-000-Cl
SucroseSigma84097Verdund in 1X PBS
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen18064022
Tissue-Tek O.C.T. compoundSakura4583
TriPure Isolation ReagentSigma-Aldrich11667165001
TruSeq RapidIllumina20020616
β-mercaptoethanolFisher BioReagentsBP176-100
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

neurale progenitorcellenhanging drop methodedifferentiatie door retino nezuurvorming van embryonale lichamenRT qPCR analyseimmunofluorescentiekleuringflowcytometrie analyseRNA sequencingSox1 GFP reporter

Gerelateerde artikelen