Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

10.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61447

⸱

26 juni 2020

 , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Samenvatting

Zoogdiercellen worden voortdurend blootgesteld aan chemische stoffen, straling, en natuurlijk voorkomende metabolische bijproducten, die specifieke soorten DNA-beledigingen te creëren. Genotoxische middelen kunnen de DNA-ruggengraat beschadigen, breken of de chemische aard van individuele basen wijzigen. Na DNA-belediging worden DNA damage response (DDR) trajecten geactiveerd en eiwitten aangeworven die betrokken zijn bij de reparatie. Een overvloed aan factoren zijn betrokken bij het waarmaken van het type schade en het activeren van de juiste reparatierespons. Het niet correct activeren en rekruteren van DDR-factoren kan leiden tot genomische instabiliteit, wat ten grondslag ligt aan veel menselijke pathologieën, waaronder kanker. Studies van DDR-eiwitten kunnen inzicht geven in de reactie van genotoxische geneesmiddelen en cellulaire mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen.

Er zijn twee belangrijke manieren om eiwitten in vivote visualiseren: directe observatie, door het eiwit van belang te taggen met een fluorescerend eiwit en het te volgen door live beeldvorming, of indirecte immunofluorescentie op vaste monsters. Terwijl visualisatie van fluorescerende gelabelde eiwitten nauwkeurige monitoring na verloop van tijd mogelijk maakt, kan directe tagging in N- of C-terminus interfereren met de eiwitlokalisatie of functie. Observatie van eiwitten in hun ongewijzigde, endogene versie heeft de voorkeur. Wanneer DNA-reparatie-eiwitten worden aangeworven voor de DNA-belediging, hun concentratie stijgt lokaal en ze vormen groepen, of "foci", dat kan worden gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie met behulp van specifieke antilichamen.

Hoewel detectie van eiwitfoci geen definitief bewijs van directe interactie biedt, geeft colokalisatie van eiwitten in cellen aan dat ze zich hergroeperen naar de plaats van schade en kunnen ze informeren over de volgorde van gebeurtenissen die nodig zijn voor complexe vorming. Zorgvuldige analyse van foci ruimtelijke overlap in cellen uitdrukken wilde type of mutant versies van een eiwit kan kostbare aanwijzingen geven over functionele domeinen belangrijk voor DNA reparatie functie. Ten slotte duidt colokalisatie van eiwitten op mogelijke directe interacties die kunnen worden geverifieerd door co-immunoprecipitatie in cellen, of directe pulldown met behulp van gezuiverde eiwitten.

Inleiding

Menselijke cellen worden voortdurend blootgesteld aan een verscheidenheid van DNA-schadelijke stoffen van verschillende oorsprong. Exogene bronnen bestaan meestal uit blootstelling aan straling, chemicaliën (waaronder chemotherapeutische agentia en sommige antibiotica), en virussen, terwijl de belangrijkste endogene bronnen fouten in DNA-replicatie en oxidatieve stress omvatten. De directe effecten van genotoxische blootstelling kunnen variëren van een gewijzigde basis tot een potentieel dodelijke DNA double-strand break (DSB), afhankelijk van de stress en de blootstellingsdosis. Uiteindelijk kan niet-gerepareerde of verkeerd gerepareerde DNA-schade leiden tot de accumulatie van mutaties, genomische herschikkingen, instabiliteit van het genoom en uiteindelijk leiden tot carcinogenese1. Zoogdiercellen hebben complexe paden ontwikkeld om specifieke soorten DNA-schade2,,3 te herkennen en ze tijdig te herstellen, gesynchroniseerd met de progressie van de celcyclus.

Ioniserende straling (IR) beschadigt de DNA dubbele helix en creëert dubbelstrengbreuken (DSB's), een van de meest schadelijke vormen van DNA-schade. Het MRN -complex (MRE11, RAD50, NBS1) functioneert als een sensor van DNA-uiteinden en activeert het eiwit kinase ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM)4,5. Na de eerste activering van ATM door DNA-einden, ACTIVEert ATM een cascade van DDR-gebeurtenissen op de plaats van de pauze, initiërend met een belangrijke gebeurtenis, de fosforylatie van de histonevariant H2AX6. H2AX fosforylatie op residu S139 activeert het in γH2AX, verspreid over regio's tot megabases rond de DNA-laesie6,7,8,9. Deze gebeurtenis verhoogt de toegankelijkheid van DNA, wat leidt tot de werving en accumulatie van andere DNA-reparatieeiwitten7. Omdat γH2AX overvloedig en specifiek wordt geïnduceerd omliggende DSB's, kan het gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van specifieke antilichamen, en wordt vaak gebruikt als surrogaat marker voor DSB's in het DNA-reparatieveld. Zodra de breuk is gesignaleerd, activeren cellen hun DNA-hersteltrajecten en verwerken ze de DNA-schade. Het eiwit MDC1 (bemiddelaar van DNA-schadepostwit 1) bindt direct γH2AX10, interageert met ATM11 en ook met NBS112,13. Het draagt bij aan het verhogen van de concentratie van MRN-complex bij de DSB en het initiëren van een positieve ATM-feedbacklus. γH2AX wordt snel verwijderd zodra de breuk is gerepareerd, waardoor de DSB-klaring kan worden gecontroleerd. Gevolgd door microscopie, de daling van γH2AX na verloop van tijd zorgt voor een indirecte meting van resterende breuken en DNA-reparatie efficiëntie.

Eukaryotische cellen kunnen DSB's via verschillende trajecten herstellen, waarbij de twee belangrijkste niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie (HR)(figuur 1)zijn. NHEJ ligat in wezen DNA dubbelstrengeinden zonder het gebruik van uitgebreide homologie en werkt gedurende de celcyclus14,15. HR wordt overheersend tijdens S- en G2-fasen, en wordt anders onderdrukt, omdat het een zuster chromatid vereist als een homologe sjabloon voor reparatie14,16. De keuze van het traject tussen NHEJ en HR hangt niet alleen af van de fysieke nabijheid van de zusterchromatoïde, maar ook van de uitbreiding van DNA-eindresectie17, wat NHEJ remt.

Homologie-afhankelijke DSB reparatie initieert door nucleolytische afbraak van de 5 'streng van de pauze eindigt op het genereren van 3 'single-streng DNA (ssDNA) staarten, een proces aangeduid als 5 '-3' resectie. Het MRN-complex initieert DNA-eindresectie en verdere resectie wordt verwerkt in combinatie met BLM/EXO1 (Bloom syndrome protein/exonuclease 1) of BLM/DNA2 (DNA-replicatie ATP-afhankelijke helicase/nuclease)18,19,20,21,22. DNA-eindresectie wordt versterkt door CtIP (CtBP-interactief eiwit) door de directe interactie met MRN complex23 en rekrutering van BRCA1 (borstkanker type 1 gevoeligheideiwit)24,25. Replicatie-eiwit A (RPA) bindt zich onmiddellijk aan de blootgestelde ssDNA en wordt vervolgens verplaatst door het recombinase-eiwit RAD51 om een nucleoproteïne filament te vormen dat homologe zoek- en strenginvasie katalyseert26,27,28.

De initiatie van resectie is een kritieke stap voor reparatie traject keuze. Zodra de resectie is gestart, worden de DNA-uiteinden slechte substraten voor binding door Ku70/Ku80 heterodimer (component van NHEJ-pad) en zijn cellen toegewijd aan HR17,29,30. De Ku70/Ku80 heterodimeer bindt zich aan DSB-uiteinden en werft DNA-PKcs en p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 fungeert als een barrière voor resectie in G1, waardoor HR wordt geblokkeerd terwijl het NHEJ31,32bevordert , maar het wordt in de S-fase op een BRCA1-afhankelijke manier verwijderd, waardoor resectie33,34kan plaatsvinden . Daarom spelen 53BP1 en BRCA1 tegengestelde rollen in DSB-reparatie, waarbij 53BP1 een NHEJ-facilitator is, terwijl BRCA1 werkt om breuken te repareren via HR.

In het laboratorium kan DSB-vorming worden veroorzaakt door ioniserende straling (IR). Terwijl dit voorbeeld maakt gebruik van een hoge dosis van 4 Gy, 1 Gy en 2 Gy ook een aanzienlijke hoeveelheid DSB's, geschikt voor de analyse van foci vorming door overvloedige eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het type en de dosis van de gebruikte straling kan leiden tot verschillende laesies in het DNA en in de cel: terwijl IR induceert DSB's, het kan ook leiden tot single streng breuken of basis modificatie (zie35,36 voor een verwijzing naar straling lineaire energieoverdracht (LET) en type dna-schade). Om de kinetiek van ioniserende straling-geïnduceerde foci (IRIF) vorming en hun klaring te bepalen, die wijzen op herstel van de schade en omkering van de geactiveerde DDR8,9,37,38, foci vorming kan worden gecontroleerd op verschillende tijdstippen na ioniserende straling. Timing van activering en klaring van alle belangrijke DNA-schade eiwitten is bekend39, en velen worden onderzocht als surrogaat markers van belangrijke gebeurtenissen. PRPA, dat een hoge affiniteit heeft met ssDNA, wordt bijvoorbeeld gebruikt als surrogaat van de pauzeresectie, MRN-eiwitten (MRE11, RAD50, NBS1) en exonleases kunnen ook worden gebruikt om de resectie-efficiëntie te beoordelen. Terwijl RAD51, BRCA1, BRCA2 (borstkanker type 2 gevoeligheideiwit) en PALB2 (partner en localizer van BRCA2) kunnen worden gecontroleerd om hr-efficiëntie te evalueren, worden de aanwezigheid van de Ku-eiwitten of 53BP1 gebruikt als markers van NHEJ(figuur 1).

Aangezien de proteïnen van de reparatiemachines van DNA elkaar aan de onderbreking aan de onderbreking aanwerven en in super-complexen assembleren, kunnen de interacties van DNA-eiwit en eiwit-eiwit door hun individuele lokalisatie in tijd volgen en colokalisatie van proteïnen analyseren, zoals gevisualiseerd door overlappende signalen in cel40,41,42. In cellijnen maakt de introductie van puntmutaties of verwijdering in specifieke DNA-herstelgenen, hetzij door genoombewerking, hetzij door overexpressie van op plasmid gebaseerde mutanten, onderzoek mogelijk naar specifieke residuen en hun mogelijke rol bij de herkenning van DNA-schade (bijvoorbeeld colokalisatie met γH2AX) of complexe assemblage (colokalisatie met een andere, of meerdere, eiwitten), evenals hun impact op DNA-reparatie. Hier gebruiken we indirecte immunofluorescentie als een middel om de vorming en resolutie van DSB's te onderzoeken door γH2AX foci in de loop van de tijd te volgen. We presenteren ook een voorbeeld van foci vorming en co-lokalisatie analyse door een belangrijke speler in DSB reparatie: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Zoals eerder vermeld, 53BP1 wordt beschouwd als centraal in DNA reparatie traject keuze. Na 53BP1 accumulatie en de co-lokalisatie met γH2AX biedt kostbare informatie over celcyclus fase, DNA schade accumulatie, en route gebruikt om DSB's te repareren. Het doel van indirecte immunolokalisatie is het beoordelen van de efficiëntie van DNA-schadeherstel in cellijnen, naar aanleiding van IR zoals in deze studie, of na blootstelling aan verschillende spanningen in de cel, van DNA-kruislinking tot verstopping van de replicatievork (een lijst van DNA-schadelijke stoffen is opgenomen in tabel 1).

figure-introduction-1
Figuur 1: DNA double strand breaks (DSB) reparatie trajecten.
DSB reparatie omvat twee belangrijke trajecten: Homologous Recombinatie (HR, links) en Non-Homologous End-Joining (NHEJ, rechts). Na de pauze worden eiwitten geactiveerd om de pauze te markeren (γH2AX), deel te nemen aan eindresectie (MRN), de resected ssDNA (pRPA) te coaten, recombinatie te bevorderen (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) of hersectie te beperken en NHEJ (53BP1) te bevorderen. Andere eiwitten nemen deel aan schadeherstel, maar de genoemde eiwitten worden routinematig gevolgd door indirecte immunofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

DNA-beschadigend middelWerkingsmechanismeAanbevolen dosis
γ-stralen/röntgenstralenStraling
Vorming van dubbelstranden breekt met een aantal ongecontroleerde cellulaire effecten		1-4 Gy
36. Ar ionenStraling
Vorming van dubbelstranden		270 keV/μm
α-deeltjesStraling
Vorming van dubbelstranden		116 keV/μm
BleomycineRemmer van DE synthese van DNA0,4-2 μg/mL
CamptothecinRemmer van topoisomerase I10-200 nM
CisplatineAlkylating agent
(inducerende intrastrand crosslinks)		0,25-2 μM
DoxorubicineIntercalating agent
Remmer van topoisomerase II		10-200 nM
EtopozijdeRemmer van topoisomerase II10 μM
Hydroxyurea HydroxyureaRemmer van DE synthese van DNA
(door ribonucleotide reductase)		10-200 μM
MethymethfonaatAlkylating agent0,25-2 mM
Mitomycine CAlkylating agent0,25-2 μM
Ultraviolet (UV) lichtVorming van thymidine dimers
(het genereren van vervorming van de DNA-keten)		50-100 mJ/cm2

Tabel 1: Genotoxische middelen. Voorbeelden van DNA-schadelijke stoffen, hun werkingsmechanisme en de schade veroorzaakt op basis van de voorgestelde werkconcentratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. HeLa celcultuur

  1. Voorbehandel ronde glazen coverslips met 1 M HCl bij 50 °C gedurende 16-18 uur. Spoel af met ddH2O en bewaar in 100% EtOH.
  2. Bereid celkweekmedium voor: voeg 10% (v/v) FBS toe aan DMEM medium.
  3. Kweek 4,0 x 104 cellen/put in steriele 12-put plaat met een 18 mm ronde glazen coverslip bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Groei cellen tot 80% samenvloeiing (ongeveer 24 uur).

2. Celbehandeling met straling (IR)

  1. Om de vorming van dubbelstrengbreuken te veroorzaken, stelt u cellen bloot aan 4 Gy γ-bestraling (controle: Geen bestraling, t=0). In de Gamma Cell -40 komt dit overeen met 4,54 min, op 0,815 Gy per min.
  2. Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse voor de juiste tijdsduur (hier gekozen tijdstippen t=1, 2, 4, 16 h).

3. Nucleaire extractie en celfixatie

  1. Bereid voorraadoplossingen voor: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M sacharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Bereid nucleaire extractiebuffer (NEB) voor: los 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) en 0,5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix volledig opgelost.
  3. Bereid 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA) voor: los 10 mL van 16% PFA waterige oplossing op in 30 mL PBS. Meng tot volledig opgelost.
  4. Op het juiste tijdstip (t=0, 1, 2, 4, 16 h), was cellen twee maal met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig.
  5. Voeg 200 μL NEB toe aan elke put voor celkernenextractie (cytoplasma wordt afgebroken, alleen kern blijft over) (figuur 2). Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder volledig.
    LET OP: Niet langer dan 2 minuten.

figure-protocol-1
Figuur 2: Nucleaire winning.
Representatieve afbeeldingen van cellen voorafgaand aan (links) en post (rechts) nucleaire extractie. Cytoplasma moet worden verteerd, maar de nucleaire structuur moet intact blijven na de extractie (rechts). A) 20x vergroting; schaalbalk = 20 μm en (B) 40x vergroting; schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Was cellen met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig. Voeg PBS zorgvuldig, cellen zijn zeer kwetsbaar bij deze stap.
  2. Voeg 200 μL van 4% (v/v) PFA toe aan elke put voor celfixatie. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder PFA volledig.
  3. Voeg 1 mL PBS toe.
    LET OP: Cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C.

4. Kleuring van immunofluorescentie

  1. Voormaken van blokkeringsoplossing: los 5% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.
  2. Bereid verdunningsbuffer voor: los 1% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.
  3. Voeg voor het blokkeren 200 μL blokkeringsoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 16-18 uur bij 4 °C.
    OPMERKING: Als geitenantilichaam wordt gebruikt, voegt u 5% geitenserum toe aan de blokkeringsoplossing.
  4. Verdun het primaire antilichaam in verdunningsbuffer (1:500; zie tabel 2 voor de lijst met antilichamen) en vortex tot ze goed gemengd zijn.
    OPMERKING: Als geitantilichaam wordt gebruikt, voeg dan 1% geitenserum toe aan de verdunningsbuffer.
  5. In een vochtigheids-/incubatiedoos, hechten een stuk parafilm. Voeg 10 μL primair antilichaam toe (in één druppel). Lijn een rand van de coverslip met de druppel en langzaam lager op de parafilm, voor de vloeistof te verspreiden over (vermijd bubbels indien mogelijk). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  6. Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.
  7. Verdun secundair antilichaam in verdunningsbuffer (uiteindelijke concentratie: 2 μg/mL) en vortex tot het goed gemengd is.
  8. Breng 10 μL secundair antilichaam aan zoals beschreven voor de primaire antilichamen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    LET OP: Bescherm tegen licht.
AntilichaamBedrijfVerwijzingBron
53BP1Celsignalering4937Konijn
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcam Abcamab150103Ezel
Anti-fosfo-Histone H2A. X (Ser139), kloon JBW301Millipore Millipore05-636Muis
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcam Abcamab150081Geit

Tabel 2: Gebruikte antilichamen. Lijst van antilichamen die in deze studie worden gebruikt.

  1. Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.
  2. Was coverslips met H2O gedurende 1 minuut.
  3. Counterstain DNA met DAPI: breng 10 μL van 300 nM DAPI (zoals beschreven voor antilichamen), incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en monteer vervolgens op glazen schuif met een op glycerol gebaseerde montagemedia. U ook één druppel (10 μL) van commerciële antifademontagemedia met DAPI op een dia toevoegen en een coverslip aanbrengen. Druk voorzichtig op de coverslip en verwijder overtollig vocht eromheen met een papieren handdoek.
  4. Verzegel coverslips met transparante nagellak en laat ze 20 minuten drogen.
  5. Bewaar dia's bij 4 °C.

5. Beeldacquisitie

  1. Plaats een druppel onderdompelingsolie op de 60x objectieve lens. Gebruik DAPI om de kernen te lokaliseren door middel van oogstuk.
    1. Voor XYZ-beeldacquisitie, open acquisitiesoftware en geselecteerde parameters: Scannertype: Galvano; Scannermodus: rondreis; Afbeeldingsgrootte: 512×512; PMT-modus: VBF; PMT gemiddeld: frame (4 keer); PMT sequentiële scan: lijn.
    2. Selecteer de kleurstof en de detectoren:
      Kanaal (CH1), Kleurstof (DAPI), Detector (SD1)
      Kanaal (CH2), Kleurstof (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Kanaal (CH3), Kleurstof (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
    3. Selecteer AAN in 'Z'.
  2. Pas de live-afbeelding aan. Druk op de knop Live in het live-venster.
    1. Pas de focus aan en stel laserintensiteit in (%), gevoeligheid (HV), gain en offset op het gereedschapsvenster "PMT".
      1. Pas de laserintensiteit aan (%): voor helderheid en bleken. Hoe hoger de laserintensiteit, hoe sterker het signaal, maar het monster zal fotobleach.
      2. Pas de gevoeligheid (HV): geluidsniveau aan. Hoe hoger de HV, hoe sterker het signaal, maar het beeld zal luidruchtig zijn als te hoog.
        LET OP: Houd de spanning altijd constant.
      3. Pas de verschuiving aan: achtergrondniveau.
    2. Selecteer Start/einde (15 segmenten) voor Z-stapels.
  3. Start de overname.
    1. Selecteer de map om afbeeldingen op te slaan. Druk op de LSM-startknop om de afbeelding te verkrijgen. Druk op de knop Series Done om de afbeeldingsverwerving te voltooien.

6. Gegevensanalyse

  1. Open de analysesoftware voor beeldanalyse.
    1. Druk op het gereedschapsvenster Batch, selecteer de afbeeldingen die u wilt analyseren en selecteer uitvoermap.
    2. Druk op het venster Van het gereedschap Analyse en selecteer Projectie (geeft de maximale intensiteitsprojectie van 15 segmenten weer).
    3. Selecteer onder Instelling invoer/uitvoerde gemaakte batch.
    4. Druk op Proces om afbeeldingen te verwerken.
    5. Afbeeldingen exporteren als .tiff-bestanden.
  2. Voor nucleaire foci kwantificering, open CellProfiler.
    1. Open de γH2AX en 53BP1 foci quantification pipeline (zie Aanvullende informatie).
    2. Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.
  3. Open CellProfiler voor colokalisatieanalyse.
    1. Open de Colocalisatiepijplijn (zie Aanvullende informatie). Er wordt een spreadsheetbestand gemaakt en opgeslagen op de gewenste locatie. Grafieken zelf worden echter niet automatisch opgeslagen. Er wordt voorgesteld om een momentopname van de vensters te nemen om bij te houden voor het registreren van de resultaten.
    2. Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Op dag 2, of 24 uur na het zaaien van cellen op coverslips, cellen hebben ondergaan een verdeling en zijn 80% confluent. Specifieke knock downs of mutaties in DNA-hersteleiwitten kunnen de verdubbelingstijd verhogen of cellen sensibiliseren voor genotoxische behandeling, en de zaaidichtheid en behandelingsdoses moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Om de beste werkomstandigheden te bepalen, kan de timing van de DNA-schaderespons worden vastgesteld door westerse blotting van γH2AX in de tijd, en de gevoeligheid voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Analyse van de timing en efficiëntie van DNA schade reparatie door microscopie is essentieel gebleken om te begrijpen hoe de DNA-reparatie machines functioneren, in normale cellen en in menselijke pathologieën zoals kanker.

De ontwikkeling van specifieke antilichamen die detectie van actieve eiwitten in hun fosforyleerde versie mogelijk maken (zoals γH2AX, pRPA, pRAD50 en anderen10,23,39,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de San Antonio Area Foundation. Het Mays Cancer Center wordt ondersteund door NCI kankercentrum ondersteuning kern subsidie P30 CA054174. We willen Stephen Holloway bedanken voor zijn hulp bij het inkopen van de reagentia, en het Sung laboratorium voor het verstrekken van ruimte en microscopie capaciteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) waterige oplossingElectron Microscopy Sciences15710Microscopie kwaliteit van de PFA zorgt voor de beste beelden. Als u 'zelfgemaakte PFA' gebruikt, filter dan voor gebruik.
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-AldrichA3059Heat-shock fractie wordt aanbevolen om precipitatie/achtergrond te voorkomen.
Dekglaasje #1, 18 mm rond (dekglasjes)NeuvitroNC0308920Dekglasjes moeten worden gereinigd en gesteriliseerd voor gebruik, met HCl of ethanol.
DMEM, Hoge Glucose [(+) 4,5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Natrium Pyruvaat]Gibco11965118Pas het groeimedium aan de behoeften van de gebruikte cellijn aan.
DPBS, geen calcium, geen magnesiumGibco14190144PBS voor weefselkweek.
Ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA)Research Products InternationalE57060Kernextractiebuffer.
Fetaal bovien serum (FBS)Life Technologies104370028De kwaliteit van FBS kan worden beoordeeld door gH2AX foci vorming te testen. Als er sporen van genotoxische endotoxinen in de batch aanwezig zijn, zal gH2AX positief zijn bij afwezigheid van stress.
Magnesiumchloride (MgCl2)Research Products InternationalM24000Kernextractiebuffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES)Research Products InternationalP40150Kernextractiebuffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant met DAPIInvitrogenS36973300 nM DAPI met VECTASHIELD Antifade Montage Medium kan in plaats daarvan worden gebruikt.
Natriumchloride (NaCl)Research Products InternationalS23020Kernextractiebuffer.
SucroseResearch Products InternationalS24060Kernextractiebuffer.
Superfrost Plus MicroscoopglaasjesFisherbrand1255015Polysine glaasjes kunnen in plaats daarvan worden gebruikt.
TC-Behandelde Meerdere Welborden, maat 12 welvenCostar3513Zaden op dekglaasjes wordt gedaan in 12-welven plaat.
Triton X-100AmericanBioAB02025Kernextractiebuffer.
TrypLE Express Enzym (1X), Geen Fenol RoodGibco12604021Trypsin-EDTA kan in plaats daarvan worden gebruikt.
Trypsin-EDTA (0,5%), Geen Fenol RoodGibco15400054TrypLE kan in plaats daarvan worden gebruikt.

Referenties

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428(2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740(2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819(2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Immunofluorescentietechniekdetectie van prote nefocicolocalisatieanalysegamma H2AX fociHeLa celkweekgammabestralingantilichaamkleuringmicroscopie imagingnucleaire kwantificering
Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.