Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gedwongen activering van enhancer-RNA's in situ via het dCas9 Synergistic Activation Mediator-systeem

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61460

⸱

5 juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Enhancer-RNA's (eRNA's) zijn niet-coderende RNA's die worden geproduceerd uit actieve enhancers. Een optimale benadering om eRNA-functies te bestuderen, is het manipuleren van hun niveaus in de natuurlijke chromatineregio's. Hier introduceren we een robuust systeem voor eRNA-studies door gebruik te maken van CRISPR-dCas9-gefuseerde transcriptionele activatoren om de expressie van interessante eRNA's te induceren.

Samenvatting

Enhancers zijn cruciale genomische elementen die verspreid zijn over het genoom van zoogdieren en dicteren weefselspecifieke genexpressieprogramma's. Toenemend bewijs heeft aangetoond dat enhancers niet alleen DNA-bindende motieven voor transcriptiefactoren (TF's) leveren, maar ook niet-coderende RNA's genereren die eRNA's worden genoemd. Studies hebben aangetoond dat eRNA-transcripten een belangrijke rol kunnen spelen bij genregulatie in zowel fysiologie als ziekte. Veelgebruikte methoden om de functie van eRNA's te onderzoeken, zijn beperkt tot "verlies-van-functie"-benaderingen door het uitschakelen van eRNA's of door chemische remming van de enhancer-transcriptie. Er is geen robuuste methode geweest om "gain-of-function"-studies van eRNA's uit te voeren om specifieke ziektetoestanden na te bootsen, zoals kanker bij de mens, waarbij eRNA's vaak tot overexpressie worden gebracht. Hier introduceren we een methode voor het nauwkeurig en robuust activeren van eRNA's voor functionele ondervraging van hun rol door het dCas9-gemedieerde Synergistic Activation Mediators (SAM)-systeem toe te passen. We presenteren de volledige workflow van eRNA-activering, van de selectie van eRNA's, het ontwerp van gRNA's tot de validatie van eRNA-activering door RT-qPCR. Deze methode vertegenwoordigt een unieke benadering om de rol van een bepaald eRNA in genregulatie en ziekteontwikkeling te bestuderen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor onbevooroordeelde CRISPR-screening om fenotype-sturende eRNA-doelen te identificeren in de context van een specifieke ziekte.

Inleiding

Het menselijk genoom bevat een constellatie van regulerende elementen 1,2,3. Hiervan komen versterkers naar voren als een van de meest kritische categorieën 4,5,6. Enhancers spelen een essentiële rol bij het reguleren van de ontwikkeling en zijn verantwoordelijk voor het genereren van ruimtelijk-temporele genexpressieprogramma's om de celidentiteit te bepalen 5,6,7. Conventioneel worden enhancers alleen beschouwd als DNA-elementen die bindende motieven leveren voor transcriptiefactoren (TF's), die vervolgens de expressie van het doelgenen regelen 6,8. Uit een reeks onderzoeken bleek echter dat veel actieve enhancers ook niet-coderende enhancer-RNA's (d.w.z. eRNA's) transcriberen4,9,10.

Het niveau van eRNA-transcriptie bleek te correleren met de activiteit van een enhancer 4,10. Actieve versterkers produceren meer eRNA-transcripten en vertonen hogere niveaus van epigenoommarkers geassocieerd met actieve transcriptie, zoals H3K27ac en H3K4me1 9,11,12. Sommige studies hebben aangetoond dat eRNA-transcripten een belangrijke rol kunnen spelen bij transcriptionele activering van doelgenen10,12. Er werd vastgesteld dat een groot aantal eRNA's gedereguleerd was in menselijke kankers 13,14,15,16, waarvan er vele een hoge specificiteit van het kankertype en klinische relevantie vertoonden. Deze bevindingen bieden kansen dat de opheldering van eRNA's die tumorigenese kunnen stimuleren/bevorderen, nieuwe doelen kan bieden voor therapeutische interventie13,15.

De huidige methoden om eRNA-functies te bestuderen zijn bijna uitsluitend gebaseerd op knockdown-strategieën die gebruik maakten van kleine interferentie-RNA's (siRNA), korte haarspeld-RNA's (shRNA's) of antisense-oligonucleotiden (ASO's, waarvan vergrendelde nucleïnezuren (LNA's) het meest gebruikte type zijn in onderzoek)10,12,17. Ziekten bij de mens, zoals kanker, vertonen echter voornamelijk overexpressie van eRNA's in vergelijking met hun aangrenzende normale weefsel15, waardoor hulpmiddelen nodig zijn om eRNA's tot "overexpressie" te brengen om hun ziekterelevante expressiepatronen na te bootsen voor functionele studies. Om dit te bereiken, is een op plasmide gebaseerd ectopisch overexpressiesysteem niet optimaal omdat de exacte start- en eindplaatsen van de transcriptie van eRNA's grotendeels onduidelijk blijven. Bovendien kan een plasmide-expressiesysteem de locatie van eRNA's veranderen, waardoor potentiële artefacten van hun functies ontstaan18. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om de functionele karakterisering van eRNA's te vergemakkelijken door hun "overexpressie" af te dwingen in de native genomische locus van hun productie (d.w.z. in situ), die is gebaseerd op het CRISPR/dCas9-Synergistic Activation Mediators System (SAM).

Het SAM-systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld voor het activeren van coderende genen en lange intergene niet-coderende RNA's (lincRNA's) geassocieerd met BRAF-remmerresistentie in melanoomcellen19. In tegenstelling tot andere CRISPR-activeringstechnologieën (CRISPRa), bestaat het SAM-systeem uit een combinatie van transcriptie-activatoren om robuuste transcriptie-activering van doelgebieden te verlenen. Deze activatoren omvatten: een enzymatisch dood Cas9 (dCas9) gefuseerd met VP64 (d.w.z. dCas9-VP64); een gids-RNA met twee MS2-RNA-aptameren en een MS2-p65-HSF1-fusie-activatoreiwit. De aanwezigheid van de MS2-aptameren in het gRNA kan het MS2-p65-HSF1-fusie-eiwit rekruteren in de buurt van dCas9/gRNA-bindingsplaatsen. Onder deze is VP64 een gemanipuleerde tetrameer van het herpes simplex VP16 transcriptionele activatordomein, waarvan is aangetoond dat het gentranscriptie sterk activeert door algemene transcriptiefactoren te rekruteren 20,21,22. Het fusie-eiwit MS2-p65-HSF1 bestaat uit drie delen. Het eerste deel, de MS2-N55K, is een mutante vorm van MS2-bindend eiwit met een sterkere affiniteit23; de andere twee delen van dit fusie-eiwit zijn het transactiveringsdomein van p65 en hitteschokfactor 1 (HSF1), beide transcriptiefactoren die sterke transactiveringsdomeinen bezitten en robuuste transcriptieprogramma's kunnen induceren24,25. Daarom creëerde het SAM-systeem in wezen een zeer krachtig activatorcomplex om de transcriptie van aangewezen coderende genen en lincRNA's te activeren19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De volledige workflow van dit protocol wordt weergegeven in Figuur 1.

1. Enhancer RNA (eRNA) selectie

  1. Identificeer een verondersteld enhancer-interessegebied door gebruik te maken van bindende pieken van chromatine-immunoprecipitatiesequencing (ChIP-Seq)-gegevens, d.w.z. van histonmodificaties (bijv. H3K4me1 en H3K27ac), of van transcriptiecoactivatoren (bijv. p300).
  2. Identificeer het eRNA van belang door de ChIP-Seq-piek te kruisen met RNA-seq-signalen (bijv. van totaal RNA-seq of van ontluikend RNA-seq zoals Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    OPMERKING: Het gebied dat wordt gekozen voor het ontwerpen van gRNA's moet meestal beperkt zijn tot het "enhancer core"-gebied, waar TF's of coactivatoren (bijv. p300) duidelijke ChIP-seq-pieken vertoonden (Figuur 2A). De dCas9 en zijn fusiecoactivatoren zullen door een gRNA naar deze regio worden gerekruteerd om de native binding van coactivatoren na te bootsen (Figuur 2A). Als er specifieke datasets beschikbaar zijn, zoals Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)4 of GRO-cap26, kunnen deze worden gebruikt om de "enhancer-kern" nauwkeurig te bepalen, het gebied tussen twee transcriptiestartplaatsen van de eRNA's die in tegengestelde richtingen zijn getranscribeerd 4,10,26.

2. gRNA-ontwerp

  1. Gebruik veelgebruikte CRISPR-gRNA-ontwerptools zoals CRISPOR27 om gRNA's te selecteren met een laag potentieel off targeting (http://crispor.tefor.net/).
    OPMERKING: Andere hulpmiddelen zoals Benchling28 of CHOPCHOP29 kunnen ook worden gebruikt als extra opties voor gRNA-ontwerp.
  2. Plak de DNA-sequentie van de enhancer core in de kolom Stap 1 op de CRISPOR-website en klik vervolgens op de vervolgkeuzeknop om het bijbehorende genoom (bijv. mens) in de kolom Stap 2 te kiezen. Klik op de vervolgkeuzeknop om de Protospacer Adjacent Motif (PAM)-sequentie in te stellen als "NGG" in de kolom Stap 3 en klik vervolgens op de knop "Verzenden" om geleidingsreeksen met een lengte van 20 bp te genereren.
  3. Kies gidsen met de hoogste specificiteitsscores in de CRISPOR-tool, dwz een laag off-target potentieel, en voeg vervolgens respectievelijk "CACCG" toe aan het 5'-uiteinde en "C" aan het 3'-einde.
    OPMERKING: Selecteer de hulplijnen met de hoogste specificiteitsscores (>85 in CRISPOR heeft de voorkeur).
  4. Bestel oligonucleotiden voor elke sense en antisense sequentie uit commerciële bronnen.
    OPMERKING: Aanvullende instructies over het CRISPR/Cas9 gRNA-ontwerp zijn te vinden in andere onderzoeken 30,31. De overhangen in stap 2.2 maken het gRNA compatibel met de SAM gRNA-backbone (Addgene #61427), die het BsmBI-restrictie-enzym gebruikt.

3. Kloon gRNA's in een lentiviraal construct

  1. Meng voor het gloeien van oligo's 1 μL van elk gepaarde oligo bij 100 μM, 1 μL 10x T4 ligatiebuffer, 0,5 μL T4 DNA Ligase (400.000 eenheden/ml) en 6,5 μL H2O om een totaal volume van 10 μL te bereiken. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min, vervolgens 95 °C gedurende 5 min, en aflopen tot 25 °C bij 5 °C/min. Verdun tot 100 μL met H2O.
  2. Verdien de gRNA-ruggengraat door 2 μL 10x restrictie-enzym (RE) Buffer, 300 ng lenti_gRNA (MS2)_zeo ruggengraatplasmide (Addgene #61427) te mengen in 1 μL, 1 μL BsmBI-enzym en 16 μL H2O om een totaal volume van 20 μL te bereiken. Incubeer gedurende 55 °C gedurende 15 minuten.
  3. Meng ligatiecomponenten met 20 μL digestieproduct door 2,5 μL 10x T4 ligatiebuffer, 1 μL verdund gloeiproduct en 1,5 μL T4 DNA-ligase (400.000 eenheden/ml) toe te voegen aan een 25 μL systeem. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Transformeer 2 μL van de ligatiemix uit stap 3.3 in Stbl3-competente E.coli-cellen . Leg ze op een ampicilline LB-agarplaat en incubeer ze een nacht bij 37 °C.
  5. Pluk en inoculeer een enkele bacteriekolonie en extraheer plasmide. Stuur het op voor Sanger-sequencing om te bevestigen dat de gRNA-sequentie correct is ingevoegd.
    OPMERKING: Sequenties voor de primers en gRNA's zijn beschikbaar in aanvullende tabel 1. Stbl3 chemisch competente E.coli-cellen worden aanbevolen om hier te worden gebruikt omdat ze een hogere plasmide-DNA-opbrengst en een hogere plasmidestabiliteit hebben bij het genereren van instabiliteitsgevoelige lentivirusplasmiden32.

4. gRNA-efficiëntietest

OPMERKING: Hoewel het misschien niet voor elk gRNA nodig is, wordt aanbevolen dat onderzoekers de kwaliteit van gRNA onderzoeken door een Surveyor-test uit te voeren (d.w.z. mismatch-splitsingstest) om indels of mutaties te detecteren die alleen efficiënt kunnen worden gegenereerd door gRNA's van goede kwaliteit33,34. Andere methoden, zoals Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) kunnen ook worden gebruikt om de gRNA-efficiëntie te bepalen30,35. Landmeternuclease is een lid van een familie van mismatch-specifieke endonucleasen die dubbelstrengs DNA met mismatches kunnen knippen (Figuur 3A). De kwaliteit van gRNA's kan worden onthuld door de werkzaamheid van het produceren van kleinere DNA-soorten. In de praktijk kan de snij-efficiëntie van landmeters ook worden beïnvloed door de transfectie-efficiëntie van gRNA's en Cas9.

  1. Transfect gRNA samen met het pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) plasmide dat het Cas9-eiwit tot expressie brengt in 293T-cellen met behulp van een op lipiden gebaseerd transfectiereagens. Gebruik 1,2 μg/ml voor elk plasmide per putje in een plaat met 6 putjes. Ga door met het kweken van de cellen gedurende 3 dagen na transfectie. Oogst en extraheer genomisch DNA volgens het protocol van de fabrikant36.
  2. Gebruik polymerasekettingreactie (PCR) om het beoogde enhancergebied uit genomisch DNA te amplificeren. Gebruik de PCR-omstandigheden die worden weergegeven in aanvullende tabel 2. Gebruik primers in aanvullende tabel 1 voor een voorbeeldverbeteraar, NET1e. Denatureer de PCR-producten door ze gedurende 10 minuten bij 95 °C te incuberen en hybridiseer ze opnieuw door ze met een snelheid van -0,3 °C/s te verlagen van 95 °C naar 25 °C om het enkelstrengs DNA (ssDNA) met en zonder gRNA-geïnduceerde indels of mutaties aan elkaar te laten gloeien.
  3. Verteer het gehybridiseerde DNA door de Surveyor-nuclease (Figuur 3A) volgens het protocol van de fabrikant37. Meng 400 ng gehybridiseerd DNA uit stap 4.2, 1 μL Surveyor-nuclease, 1 μL Surveyor-enhancer en 5 μL 0,15 M MgCl2 in een systeem van 50 μL. Incubeer gedurende 60 minuten bij 42 °C. Analyseer het DNA op een agarosegel. Gebruik negatieve controle, zoals cellen met alleen Cas9 maar zonder gericht op gRNA's, in de test en gelelektroforese (Figuur 3B).

5. Genereren van lentivirussen

  1. Voeg psPAX2, pMD2.G en een doelplasmide (bijv. lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; of lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) toe in een verhouding van 3 μg : 1 μg : 4 μg in een polypropyleen buis van 1,5 ml. Meng ze met 500 μL Opti-MEM en incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  2. Doe in een afzonderlijke buis 10 μL van het op lipiden gebaseerde transfectiereagens in 500 μL Opti-MEM en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Combineer de producten uit stap 5.1 en 5.2 en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Plaat 293T cellen één dag vóór de transfectie en laat hen een samenvloeiing van ~30% in een 10 cm schotel op het ogenblik van transfectie bereiken. Voeg 4 ml regulier medium (DMEM met 10% FBS) toe en voeg vervolgens het complex uit stap 5.3 druppelsgewijs toe aan de cellen. Voeg DMEM toe met 10% FBS om het uiteindelijke volume op 6 ml te brengen. Incubeer een nacht in een celincubator bij 37 °C met 5% CO2 .
  5. Vervang het medium de volgende dag door 10 ml nieuwe DMEM met 10% FBS. Oogst het medium 24 uur na de mediumwissel. Gebruik een spuitfilter (bijv. 0.45 μm) om het virushoudende medium te filteren en ga dan verder met stap 6 of bewaar het virus bij -80 °C.
    OPMERKING: Voor lentivirusbewerkingen is een kast van bioveiligheidsniveau II vereist. Voorzichtigheid is geboden om de virusgerelateerde experimenten veilig af te handelen; En als een container direct in contact komt met het virale medium, moet deze meer dan 20 minuten worden gebleekt voordat deze als biologisch gevaar wordt weggegooid.

6. Celcultuur

  1. Houd de cellen in een CO2 -celcultuurincubator bij 37 °C met 5% CO2 .
  2. Kweek MCF7- en 293T-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium met 10% FBS.
  3. Kweek cellen in schaaltjes van 10 cm en splits ze in een verhouding van 1:3 tot 1:5 wanneer ze samenvloeien.

7. Celinfectie en selectie

  1. Zaai de doelcellen (bijv. MCF7) rechtstreeks in een viraal mediummengsel dat 0,5 ml lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) en 0,5 ml lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426) bevat. Voeg 8 μg/ml hexadimethrinebromide toe om de efficiëntie van de infectie te verhogen. Gebruik een put met niet-geïnfecteerde cellen als negatieve controle voor het onderzoeken van de werkzaamheid van antibioticaselectie.
    OPMERKING: De hoeveelheid viraal medium wordt als volgt aanbevolen: 6 ml viraal medium voor een schaal van 10 cm, 1 ml voor een putje van een bord met 6 putjes en 0.5 ml voor een putje van een bord met 12 putjes.
  2. Voeg 24 uur na de infectie een nieuw medium toe aan de cellen dat blasticidine (5 μg/ml voor MCF7-cellen) en hygromycine (200 μg/ml voor MCF7-cellen) bevat.
  3. Bewaar de cellen in een antibioticumselectiemedium totdat de negatieve controlecellen uitsterven.
    OPMERKING: De tijd kan variëren voordat verschillende cellijnen stabiel worden. Voor MCF7 duurt het meestal 5-7 dagen voordat niet-geïnfecteerde cellen volledig zijn uitgestorven. Een dodingscurve met behulp van een reeks antibioticaconcentraties moet voorafgaand aan de experimenten worden getest op een nieuwe cellijn. Het is acceptabel om een celmengsel te gebruiken voor de volgende stappen, maar een alternatief is om eencellige kolonies te kiezen die homogeen zijn in termen van expressie van de twee effectoreiwitten. De verkregen stabiele lijn wordt in dit artikel de SAM-effector ouderlijn genoemd (bijv. MCF7 SAM-effectorlijn). Het wordt aanbevolen om een gedeelde SAM-effector ouderlijke cellijn te gebruiken voor infectie door verschillende gerichte of niet-gerichte gRNA's, vooral als hun effecten worden vergeleken.
  4. Gebruik western blotting om te bepalen of de cellen de twee effectoreiwitten stabiel tot expressie brengen (een voorbeeld wordt getoond in figuur 4A). Gebruik reverse transcriptie van totale RNA's gevolgd door kwantitatieve PCR (RT-qPCR) als alternatieve methode om de expressieniveaus van de twee mRNA's te onderzoeken (dCas9-VP64 en MS2-p65-HSF1, Figuur 4B).
    OPMERKING: Primers voor het onderzoeken van de mRNA-niveaus van de twee dCas9-effectoren zijn beschikbaar in aanvullende tabel 1.
  5. Genereer lentivirus van gRNA's die in stap 3.5 zijn geconstrueerd en infecteer de stabiele SAM-cellijn die dCas9-VP64 en MS2-p65-HSF1 dubbel tot expressie brengt met individueel gRNA-lentivirus. Voeg zeocine (100 μg/ml voor MCF7-cellen) toe aan het medium 24 uur na virale gRNA-transductie. Genereer een negatieve controle die niet-gericht gRNA (NT-gRNA) tot expressie brengt in de ouderlijke SAM-cellijn.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het selectiemedicijn specifiek is voor het construct van belang.

8. RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR om eRNA-niveaus te onderzoeken

  1. Extraheer totale RNA's uit SAM-cellijnen die NT-gRNA tot expressie brengen of gericht zijn op gRNA's met behulp van een RNA-extractiekit38 of een andere op fenolchloroform gebaseerde methode. Gebruik cellen met ~80% confluentie in één putje van een plaat met zes putjes voor RNA-extractie.
    OPMERKING: Er werd geen significant verschil waargenomen in onze praktijk voor eRNA-detectie wanneer RNA's worden geëxtraheerd door commerciële bindingskolommen of door fenolchloroformreagentia.
  2. Maak complementair DNA (cDNA) van het gezuiverde RNA door middel van een omgekeerde transcriptiereactie met een willekeurige hexamator, volgens het protocol van de fabrikant39. Gebruiksvoorwaarden in aanvullende tabel 2.
    OPMERKING: Omdat de meeste eRNA's niet-gepolyadenyleerd zijn 1,2,4,9,10, wordt willekeurig hexameren routinematig gebruikt voor het genereren van cDNA.
  3. Ontwerp primers voor RT-qPCR voor het meten van doel-eRNA's met behulp van een gerenommeerde primerontwerptool (bijv. Primer 3). Test de amplificatielineariteit van de primerparen door te onderzoeken of de primers seriële verdunde cDNA's lineair zullen versterken en de verwachte verschillen in qPCR-cyclus zullen laten zien. Gebruiksvoorwaarden in aanvullende tabel 2.
    OPMERKING: De primers voor RT-qPCR moeten gericht zijn op het sterk getranscribeerde gebied in de ontluikende RNA-seq, en de lineariteitstest van primers moet een breed scala aan cDNA-verdunningen bevatten om ervoor te zorgen dat alle mogelijk tegenkombare eRNA-niveaus worden getest. Een voorbeeld van een lineariteitstest wordt getoond in figuur 5A.
  4. Voer RT-qPCR uit en analyseer de eRNA-expressieniveaus in controlecellen (SAM-cellijn met NT-gRNA) en in SAM-cellijn met eRNA-gerichte gRNA's (bijv. NET1e gRNA#1) (bijv. Figuur 6A). Primers voor NET1e RNA worden weergegeven in aanvullende tabel 1. Gebruiksvoorwaarden in aanvullende tabel 2.  

9. dCas9 ChIP en qPCR

OPMERKING: Deze stap is een optioneel experiment om de binding van dCas9/SAM-gRNA-complex aan de doelversterker door de specifieke gRNA's te valideren. Hoewel het wordt aangemoedigd dat gebruikers deze stap uitvoeren, is het niet nodig om elk gRNA afzonderlijk te testen. Raadpleeg een voorbeeld in afbeelding 5B. Raadpleeg de inleidingen in aanvullende tabel 1.

  1. Cellen kruisen
    1. Verwijder het medium uit de cellen en voeg 1% formaldehyde toe opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Laat 10 minuten intrekken.
    2. Voeg 2,5 M glycine toe in volume 1:20 om de verknoping te doven en was de cellen twee keer met ijskoude PBS. Voeg 700 μL ijskoude PBS toe en schraap de cellen in een tube van 1,5 ml.
    3. Centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Ga verder met stap 9.2, of vries snel in en bewaar bij -80 °C.
  2. Sonicaat
    1. Maak nieuwe LB1-, LB2- en LB3-buffers. LB1: 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-X 100 en 1x Proteaseremmer. LB2: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA en 1x Proteaseremmer. LB3: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Na-Deoxycholaat, 0,5% N-lauroylsarcosine en 1x Proteaseremmer. Voeg 1x proteaseremmer vers aan de buffer toe voor het experiment.
    2. Voeg 1 ml buffer LB1 toe aan de celpellets, pipetteer goed, draai 10 minuten op 4 °C en draai 5 minuten op 2.000 x g bij 4 °C. Giet het supernatant af, voeg 1 ml LB2-buffer toe, draai 10 minuten op 4 °C en draai 5 minuten op 2.000 x g bij 4 °C. Giet het bovenstaande af en verwijder het overtollige LB2-buffer. Voeg 300 μL buffer LB3 toe.
    3. Sonificeer en fragmenteer het chromatine-DNA tot een gemiddelde grootte van ~200-400 bp met behulp van een geschikt sonicatorsysteem. Voeg na de sonicatie 30 μL 10% Triton-X 100 toe en meng goed. Test de juiste sonicatietijd als een nieuwe cellijn wordt gebruikt.
    4. Centrifugeer bij 14.000 x g om de pellet te verwijderen. Breng het bovenstaande over in de nieuwe buis en voeg 630 μl LB3 en 70 μl 10% Triton X-100 toe aan een totaal volume van 1 ml. Voeg 2 μg Cas9-antilichaam toe aan het bovenstaande en draai een nacht bij 4 °C.
  3. Immuno-complex capture en reverse cross-linking
    1. Bereid RIPA-buffer (50 mM HEPES pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,7% Na-deoxycholaat, 1% NP-40, 0,5 M LiCl) en elutiebuffer (1% SDS en 0,1 M NaHCO3) voor.
    2. Was Protein G dynabeads 3 keer met 1% BSA in PBS en LB3 buffer één keer.
    3. Voeg 30 μL proteïne G-dynabeads toe aan het monster en incubeer gedurende 4 uur bij 4 °C.
    4. Was het beads-immuno-complex 6x in 500 μL RIPA buffer. Laat de kralen niet uitdrogen.
    5. Was het kralen-immuno-complex één keer met TE-buffer; Verwijder de buffer.
    6. Voeg 200 μL elutiebuffer toe aan het kralen-immunocomplex en de vortex; Plaats het vervolgens in een temperatuurregelbare verwarmde shaker die is ingesteld op 65 °C met 600 tpm en schud gedurende 6-16 uur om de verknoping om te keren.
  4. DNA-extractie
    1. Haal de buisjes uit de shaker, draai de kralen kort naar beneden en plaats ze op een magnetische standaard. Breng 200 μl van het bovenstaande over in een nieuwe buis en voeg 200 μl TE-buffer toe.
    2. Voeg 1 μL RNase A (1 mg/ml) toe aan de buis en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Voeg na 1 uur incubatie 2 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe aan het monster en incubeer het gedurende 2 uur bij 65 °C.
    4. Centrifugeer kort en voeg 400 μL mengsel van fenol-chloroform-isoamylalcohol toe. Meng goed en centrifugeer vervolgens 5 minuten op 10.000 x g.
    5. Verplaats 400 μL van de bovenste laag naar een tube van 1,7 ml met 16 μL 5 M NaCl en 1 μL glycogeen (20 μg/μL) en meng goed.
    6. Voeg 800 μL 100% ethanol toe en laat een nacht staan bij -20 °C.
    7. Centrifugeer de buisjes de volgende ochtend gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 14.000 x g .
    8. Verwijder het bovenstaande en was de pellet met 1 ml 70% ethanol. Draai 10 minuten naar beneden op 14.000 x g .
    9. Verwijder ethanol, laat de pellet aan de lucht drogen en resuspendeer in 50 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
  5. Voer ChIP-qPCR uit om de rekrutering van het SAM-complex naar de targeting-site te onderzoeken door een paar enhancer core-targeting-primers. Gebruik een primerpaar dat gericht is op een irrelevant gebied als negatieve controle.

10. Celgroeitest en andere functionele tests van overactivering van eRNA

  1. Trypsiniseren SAM-cellijnen die de niet-gerichte gRNA- of eRNA-gerichte gRNA's tot expressie brengen en plaat ~3.000 cellen per putje in een plaat met 96 putjes.
  2. Meet de celgroei met behulp van een live-cell imager of andere methoden (bijv. celtelling of wateroplosbare tetrazoliumzout-1-test).
  3. Gebruik de halfmaximale remmende concentratie (IC50) om de cellulaire responsen op specifieke kankergeneesmiddelen te testen in cellen met of zonder NET1e-overexpressie door SAM15.
    OPMERKING: Resultaten van celgroeitesten en geneesmiddelgevoeligheidstests van borstkankercellen worden gepresenteerd na overexpressie van een eRNA dat naast het NET1-gen is getranscribeerd, dat NET1e15 werd genoemd. Andere tests kunnen worden uitgevoerd op cellulair of organismaal niveau op basis van de behoefte van elk specifiek project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 illustreert de algemene workflow van dit protocol. Onze focus lag op een representatief eRNA, NET1e15, dat tot overexpressie wordt gebracht bij borstkanker, waarvoor het SAM-systeem werd gebruikt om zijn biologische rol bij het reguleren van genexpressie, celproliferatie en respons op kankergeneesmiddelen te activeren en te bestuderen. Voor deze NET1-enhancer werden verschillende p300 ChIP-Seq-pieken, geflan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op basis van onze gegevens concluderen we dat het SAM-systeem geschikt is voor het bestuderen van de rol van eRNA's bij het reguleren van cellulaire fenotypes, bijvoorbeeld celgroei of resistentie tegen geneesmiddelen. Om de volgende redenen is echter een zorgvuldig gRNA-ontwerp vereist voor robuuste eRNA-activering. Allereerst blijft de transcriptiestartplaats (TSS) van eRNA in elke specifieke cellijn/type minder duidelijk geannoteerd. Daarom moet epigenomische informatie (bijv. ChIP-Se...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het Cancer Prevention and Research Institute of Texas.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door subsidies aan WL (Cancer Prevention and Research Institute of Texas, CPRIT RR160083 en RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; De UT Stars Award van de Universiteit van Texas; en de Welch Foundation AU-2000-20190330) en een postdoctorale fellowship aan J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Post-doctoral Fellowship, CPRIT RP160015). We erkennen de oorspronkelijke publicatie15 waar sommige van onze huidige figuren uit zijn overgenomen (met wijzigingen), die de Creative Commons-licentie volgt (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

Referenties

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

dCas9 SAM-systeemeRNA-activatieCRISPR-screeningRT-qPCR-validatiegRNA-ontwerpbinding van transcriptiefactorengenregulatieziektemodelleringgain-of-function-studies

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.