Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Samenvatting

We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.

Samenvatting

Chorioamnionitis is een veel voorkomende precipitant van vroeggeboorte en wordt geassocieerd met veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder necrotiserende enterocolitis (NEC). Een mechanistisch verband tussen deze twee aandoeningen moet echter nog worden ontdekt. We hebben een murien model van chorioamnionitis aangenomen waarbij lipopolysaccharide (LPS) wordt veroorzaakt door foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Dit model van FEMI induceert een steriele maternale, placenta en foetale inflammatoire cascade, die ook aanwezig is in veel gevallen van klinische chorioamnionitis. Hoewel er modellen bestaan die levende bacteriën gebruiken en nauwkeuriger de pathofysiologie van een oplopende infectie nabootsen die resulteert in chorioamnionitis, kunnen deze methoden indirecte effecten hebben op de ontwikkeling van het onrijpe darmkanaal en het bijbehorende ontwikkelende microbioom. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat LPS-geïnduceerde FEMI resulteert in een dosisafhankelijke toename van zwangerschapsverlies en vroeggeboorte, evenals verstoring van de normale darmontwikkeling bij nakomelingen. Verder hebben we aangetoond dat FEMI darmletsel en serumcytokinen bij nakomelingen aanzienlijk verhoogt, terwijl tegelijkertijd de bokaal- en Paneth-cellen afnemen, die beide een eerste lijn van aangeboren immuniteit tegen darmontsteking bieden. Hoewel een soortgelijk model van LPS-geïnduceerde FEMI is gebruikt om de associatie tussen chorioamnionitis en daaropvolgende afwijkingen van het centrale zenuwstelsel te modelleren, is dit protocol voor zover wij weten het eerste dat probeert een mechanistisch verband tussen chorioamnionitis en latere verstoringen in de darmontwikkeling op te helderen als een potentieel verband tussen chorioamnionitis en NEC.

Inleiding

De chorionmembranen spelen een integrale rol bij de zwangerschap van zoogdieren. Ze omvatten het koraal en amnion, die meerdere functies vervullen. Ze omringen en beschermen de foetus, vergemakkelijken paracrinesignalering tussen de maternale en foetale^{compartimenten 1}, en creëren lokale feedbacklussen binnen de chorionmembranen, die betrokken kunnen zijn bij het initiëren van de bevalling¹. Huidig begrip van de membranen geeft aan dat het amnion een structurele barrièrefunctie biedt, en het chorion biedt een immunologische buffer voornamelijk om de zich ontwikkelende foetus te beschermen tegen het maternale immuunsysteem². Ontsteking van deze membranen staat bekend als chorioamnionitis. Historisch gezien werd de diagnose van klinische chorioamnionitis gesteld na de aanwezigheid van maternale koorts plus een of meer foetale of maternale klinische bevindingen^3,4. Hoewel deze definitie klinisch nuttig is, heeft het gebrek aan precisie het onderzoek naar chorioamnionitis uitdagend gemaakt. In 2015, in een poging om de diagnose te verduidelijken, definieerde een workshop van een deskundigenpanel door het Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis als intra-uteriene ontsteking, of infectie, of beide (triple I)³. Deze verduidelijking is belangrijk omdat, hoewel microbiële geïnduceerde infectie een belangrijke oorzaak is van baarmoeder/vruchtwaterontsteking, het minder vaak voorkomt dan steriele baarmoeder/vruchtwaterontsteking^5,6,7. Over het algemeen blijft chorioamnionitis een significant probleem voor de volksgezondheid, zoals blijkt uit 2\u20124% van de termijnleveringen en 25\u201230% van de te vroeg geleverde leveringen^8,9.

Chorioamnionitis kan aanzienlijke effecten hebben op de foetus en neonaat. Het is goed gedocumenteerd in de literatuur dat chorioamnionitis geassocieerd is met een verhoogd risico op veel van de morbiditeiten van prematuriteit, waaronder bronchopulmonale dysplasie¹⁰, cerebrale wittestofletsel¹¹, intraventriculaire bloeding¹², retinopathie van prematuriteit¹³, en zowel vermoede als bevestigde vroeg beginnende neonatale sepsis^14,15. Aangezien we geïnteresseerd zijn in verwondings- en herstelmechanismen van het onrijpe darmkanaal, is het belangrijk op te merken dat chorioamnionitis ook wordt geassocieerd met latere ontwikkeling van necrotiserende enterocolitis (NEC)^15,16. NEC is een verwoestende gastro-intestinale ziekte van premature zuigelingen die resulteert in een ontregelde gastheerrespons op ontsteking en daaropvolgende intestinale necrose¹⁷. Elk jaar treft NEC meer dan 4000 zuigelingen in de Verenigde Staten, en tot een derde van deze zuigelingen sterft aan de ziekte¹⁸. De pathogenese van NEC omvat waarschijnlijk een combinatie van intestinale onvolwassenheid, dysregulatie van het onrijpe immuunsysteem, darmontsteking en bacteriële translocatie¹⁹, culminerend in een laatste gemeenschappelijke route van intestinale necrose. Belangrijk is dat het begin van NEC vaak weken na de geboorte optreedt en mogelijke blootstelling aan chorioamnionitis, waardoor het mechanistische verband tussen chorioamnionitis en de daaropvolgende ontwikkeling van NEC onduidelijk^{is 20}. Een potentieel mechanisme waarmee chorioamnionitis kan bijdragen tot de pathofysiologie van NEC is door upregulatie van het maternale immuunsysteem, waardoor vervolgens een sterke foetale ontstekingsreactie ontstaat die normale foetale ontwikkelingspatronen kan verstoren^21,22,23.

Meerdere zoogdiermodellen van chorioamnionitis bestaan bij knaagdieren en schapen^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Er bestaan echter weinig gegevens over de ontwikkeling van het darmkanaal na de eerste pasgeboren periode na chorioamnionitis-geïnduceerde foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI). Om de relatie tussen FEMI en de daaropvolgende ontwikkeling van letsel van het onrijpe darmkanaal te onderzoeken, hebben we het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde FEMI-model aangepast. Lipopolysachariden zijn een belangrijk onderdeel van het extracellulaire oppervlak op gramnegatieve bacteriën en zijn een krachtig stimulerend middel van het aangeboren immuunsysteem van meerdere eukaryotische soorten, waaronder mensen³³. Maternale LPS-injectie resulteert in een steriele ontstekingscascade zonder de verstorende effecten van levende bacteriën, en het is een bekend model voor inductie van vroeggeboorte³⁴, evenals een model van acute chorioamnionitis en het foetale inflammatoire responssyndroom (FIRS), de meest ernstige vorm van chorioamnionitis^24,35. Het is ook aangetoond dat zowel cerebrale witte als grijze stof letsel veroorzaken in een schapenmodel³⁶ en een murien model^37,38,39,40. Voor zover wij weten, zijn we echter de eersten die dit model van chorioamnionitis en FEMI gebruiken om de effecten ervan op de ontwikkeling van het maagdarmkanaal na de geboorte te onderzoeken, evenals om een mogelijk mechanistisch verband te onderzoeken tussen chorioamnionitis en latere ontwikkeling van NEC^41,42.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alle dieren werden ondergebracht in een door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) goedgekeurd vivarium aan de Universiteit van Iowa. Alle muizen waren wilde type stam C57Bl/6J.

1. Oprichting van FEMI bij zwangere muizen

1. LPS voorbereiding
   1. Gebruik LPS afgeleid van Escherichia coli O55:B5 (stamconcentratie 2 mg/ml).
   2. Verdun lps-stamconcentratie 1:100 met steriele zoutoplossing voor een werkconcentratie van 20 μg/ml.
2. Maternale LPS injectie
   1. Injecteer zwangere moederdieren op zwangerschapsdag e15. Dit tijdspunt is ongeveer 75% door de muriene zwangerschap, waardoor dit model ontwikkelingsgericht vergelijkbaar is met het vroege derde trimester van menselijke zwangerschappen, dat is wanneer de meerderheid van de vroeggeboorten als gevolg van chorioamnionitis optreedt.
   2. Weeg zwangere muizen onmiddellijk voorafgaand aan de injectie om de juiste LPS-dosering te bepalen.
   3. Bereken de dosis werkconcentratie met behulp van de volgende formule: 5 μL x gram lichaamsgewicht (gbw), voor een totale dosis LPS van 100 μg/kg. Gebruik voor controledieren een equivalent volume normale zoutoplossing voor injectie.
   4. Vortex LPS-oplossing driemaal gedurende 15 seconden op hoog voorafgaand aan elke injectie.
   5. Trek het LPS-volume op in een spuit van 1 ml.
   6. Houd zwangere muis in bedwang met scruffing techniek. Houd de dorsale lighouding vast en voer de injectie uit.
      1. Plaats een 30 gauge 8 mm naald afschuining over het rechter onderste kwadrant van de buik (om blaas en buikvaten te voorkomen) onder een hoek van 30\u201240°. Steek ongeveer 1/4 tot 1/2 van de lengte van de naald in.
      2. Trek de zuiger van de spuit terug om een negatieve druk te garanderen voordat u gaat injecteren. Ga verder met de injectie als er een negatieve druk aanwezig is.
      3. Controleer na injectie muizen ongeveer 30 minuten en keer vervolgens terug naar kooien voor de rest van de zwangerschap.

2. Levering en verzorging van nakomelingen, en darmoogst

1. Lever pups normaal via vaginale bevalling op e20.
   OPMERKING: Dit model heeft een verwachte dosisafhankelijke foetale verliessnelheid die te zien is in figuur 1 en wordt besproken in de onderstaande resultaten.
2. Laat pups bij moeders blijven en ad libitum feeds ontvangen.
3. Op de dag van de oogst, meestal postnatale dag 14 (P14), euthanaseren pups via cervicale dislocatie in overeenstemming met de protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee.
4. Maak met behulp van een schaar en tang een verticale incisie langs de middellijn van de buik, door de huid en het buikvlies, over de hele lengte van de buik. Verwijder de dunne darm van de maag naar de cecum met een schaar en verwijder de mesenterie met een tang.
5. Isoleer en houd de distale 1/3 van de dunne darm (sectie representatief voor menselijk ileum), waarbij de proximale dunne darm, het cecum en de dikke darm worden weggegooid.
6. Verdeel het ileumgedeelte doormidden met een schaar.
7. Plaats de proximale helft in een RNA-stabilisatieoplossing voor latere RNA-kwantificering.
8. Plaats de distale helft in 10% neutrale gebufferde formaline voor diavoorbereiding.

3. Darmblessure scoren

1. Sectie paraffine ingebed weefsel in 5 μm dikke plakjes en monteren op glazen dia's.
   
   OPMERKING: We sturen de specimens naar een histologiekern voor paraffine-inbedding, doorsneden en montage op dia's.
2. Dia's deparaffiniseren volgens standaardprocedures.
3. Vleksecties met hematoxyline en eosine volgens standaardprocedures.
4. Scoresecties op een 3-puntsschaal voor darmletsel zoals eerder beschreven^42,43.
   1. Beoordeel met behulp van lichtmicroscopie gegeneraliseerd darmletsel door twee afzonderlijke geblindeerde onderzoekers op een 3-puntsschaal die de villus-integriteit en scheiding van het keldermembraan evalueert⁴³ (Aanvullende figuur 1). Darmletsel kan het best worden beoordeeld bij 20x vergroting en numerieke opening 0,50.
   2. Wijs een score van 0 toe om het normale slijmvlies te beschrijven.
   3. Wijs een score van 1 toe die milde verwonding beschrijft die de ontwikkeling van subepitheliale Gruenhagen's ruimte, vacuolisatie of subepitheliale lifting omvat die beperkt is tot de lamina propria of uiteinden van villi.
   4. Wijs een score van 2 toe om ernstig letsel te beschrijven, aangegeven door epitheliale lifting en vacuolisatie groter dan de helft van de villi, villi vervorming of mucosale ulceratie en desintegratie van de lamina propria.

4. Kwantificering van Paneth- en bokaalcellen

1. Na deparaffinisatie worden vlekdia's van weefselsecties uit stap 2.8 met Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek weergegeven om zowel bokaal- als Paneth-cellen aan te duiden zoals eerder beschreven^44,45 volgens de volgende stappen.
   OPMERKING: Hoewel Alcian Blue/Periodic Acid Schiff-vlek niet specifiek is voor Paneth- of bokaalcellen, hebben geblindeerde ervaren onderzoekers in onze ervaring een gelijkwaardige cellulaire kwantificering met behulp van deze vlek in vergelijking met cellulaire gerichte antilichamen, met aanzienlijk minder achtergrondkleuring⁴⁶.
2. Dia's als volgt deparaffiniseren, bevlekken en uitdrogen.
   1. Dompel dia's twee keer 10 minuten onder in xyleen.
      LET OP: Xyleen dient in een zuurkast te worden gebruikt.
   2. Spoel af met 100% EtOH.
   3. Dompel dia's 3 minuten onder in 100 % EtOH, vervolgens in 90% EtOH gedurende 3 minuten, gevolgd door 70% EtOH gedurende 3 minuten, en ten slotte dompelt u dia's in 50% EtOH gedurende 3 minuten onder.
   4. Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min.
      LET OP: Wijs het gedeelte uit de buurt van het stromende water om verlies van weefselmonsters te voorkomen.
   5. Filter Alcian blauwe vlekoplossing met een standaard koffiefilter.
   6. Vlek glijdt in Alcian blauwe vlek gedurende 15 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 2 min.
   7. Verdun 1 mg periodiek zuur in 200 ml dubbel gedestilleerd water. Dompel dia's gedurende 5 minuten onder in deze oplossing. Was vervolgens 1 minuut onder stromend leidingwater.
   8. Vlek met Schiff's reagens gedurende 10 min. Wassen onder stromend leidingwater gedurende 5 min.
   9. Bevlek de dia's met hematoxyline gedurende 1 min en was vervolgens 2 min onder stromend leidingwater.
   10. Dompel ze gedurende 1 min onder in zure alcohol (1 ml zoutzuur gemengd in 99 ml van 70% EtOH).
   11. Dompel onder in Scott's kraanwater (0,1% concentratie Van NaHCO₃ in leidingwater) gedurende 1 min en was vervolgens onder stromend leidingwater gedurende 1 min.
   12. Droog de dia's uit.
       1. Dip elke dia 10 keer in 70% EtOH, dip dan 10 keer in 90% EtOH en 10 keer in 100% EtOH.
       2. Dompel dia's 100% EtOH onder gedurende 10 minuten, gevolgd door tweemaal onderdompelen in verse xyleen gedurende elk 3 minuten.
   13. Plaats een druppel montagemedia op het monster en plaats er een afdeklip overheen.
3. Het tellen van de gobletcel
   1. Tel met behulp van lichte microscopie bokaalcellen (Aanvullend figuur 2). Tel voor elk stukje darmweefsel het aantal bokaalcellen en 500 epitheelcellen en druk de gobletcelverhouding uit als een verhouding per 100 epitheelcellen. Bokaalcellen kunnen het beste worden geteld bij 20x vergroting en numeriek diafragma 0,5.
4. Paneth-celtelling
   1. Tel met behulp van lichtmicroscopie Paneth-cellen (Aanvullend figuur 2). Voor elk stukje darmweefsel, uitdrukken als een verhouding van Paneth cellen per intestinale crypte. Tel 100 darm crypten per stuk darmweefsel. Paneth cellen kunnen het beste geteld worden bij 20x-60x vergroting en numeriek diafragma 0,50-1,30.

Resultaten

Blootstelling aan FEMI op embryonale dag 15 leidt tot een dosisafhankelijk zwangerschapsverlies en een dosisafhankelijk percentage vroegtijdige arbeid (Figuur 1)⁴². Voor de experimenten kozen we ervoor om een LPS-dosis van 100 μg/kg te gebruiken om zwangerschapsverlies en prematuriteit (50% verlies tussen zowel prematuriteit als intra-uteriene foetale ondergang) te minimaliseren, terwijl we de foetussen blootstelden aan een significante ontstekingsbelediging.

Discussie

Chorioamnionitis beïnvloedt 2\u20124% van termijn en 25\u201230% van preterm leveringen^8,9. De impact van chorioamnionitis kan echter lang na de geboorte duren, omdat is aangetoond dat het significante effecten heeft op de foetus en neonaat^{10,11,12,13,14,15,}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J muizen	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxyline kleurstof	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscoop	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagens	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xyleen	Sigma	534056