Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van human natural killer cell metabolisme

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61466

⸱

22 juni 2020

 ,  , 
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.

Samenvatting

Natural Killer (NK) cellen bemiddelen voornamelijk aangeboren anti-tumor en anti-virale immuunreacties en reageren op een verscheidenheid van cytokinen en andere stimuli ter bevordering van overleving, cellulaire proliferatie, productie van cytokinen zoals interferon gamma (IFNγ) en / of cytotoxiciteit programma's. NK celactivering door cytokine stimulatie vereist een aanzienlijke remodellering van metabole trajecten ter ondersteuning van hun bio-en bio-synthetische eisen. Er is een grote hoeveelheid bewijs dat suggereert dat verminderde NK celmetabolisme wordt geassocieerd met een aantal chronische ziekten, waaronder obesitas en kanker, die het klinische belang van de beschikbaarheid van een methode om NK celmetabolisme te bepalen benadrukt. Hier beschrijven we het gebruik van een extracellulaire flux analyzer, een platform dat real-time metingen van glycolyse en mitochondriaal zuurstofverbruik mogelijk maakt, als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme van menselijke NK-cellen te monitoren. De hier beschreven methode maakt het ook mogelijk om metabole veranderingen te monitoren na stimulatie van NK-cellen met cytokines zoals IL-15, een systeem dat momenteel wordt onderzocht in een breed scala aan klinische studies.

Inleiding

Natural Killer (NK) cellen zijn aangeboren lymfocyten die anti-tumor en anti-virale reacties bemiddelen. NK-cellen bestaan uit 5-15% van alle lymfocyten in menselijk perifeer bloed, en kunnen ook worden gevonden in milt, lever, beenmerg en lymfeklieren. NK-cellen drukken geen polymorfe clonotyp receptoren uit, zoals T-celreceptoren (TCR) of B-celreceptoren (BCR). De activering van hun cytolytische functies daarentegen wordt ingegeven door de betrokkenheid van receptoren die onveranderlijke liganden herkennen op het oppervlak van een doelcel1,2.

Rustende menselijke NK cellen geïsoleerd uit perifeer bloed kan overleven voor meerdere dagen in cultuur medium aangevuld met menselijk serum. Activering van NK-cellen door cytokinen zoals IL-15 of IL-2 drijft de cellen tot proliferatie en tot een toename van hun moordvermogen, onder andere effecten3,4,5. Verschillende studies hebben een directe correlatie aangetoond tussen NK-celactivering en veranderingen in hun metabolische activiteit6. Deze metabolische veranderingen zijn bestemd om te voldoen aan de specifieke eisen van de cellen in termen van energie en biosynthese.

Aërobe cellen en organismen verkrijgen energie door middel van een reeks chemische reacties die de katabolisme en oxidatie van koolhydraten, vet en eiwitten te betrekken. Door een combinatie van glycolyse, de tricarboxylzuurcyclus (TCA) en oxidatieve fosforylatie voldoen eukaryotische cellen aan de meerderheid van hun ATP-vraag en verkrijgen ze tussenproducten die nodig zijn als bouwstenen voor macromolecules die essentieel zijn voor celgroei en proliferatie. Het proces van glycolyse (figuur 1A) begint met de invoer van glucose in de cel. In de cytosol wordt glucose gefossyleerd en omgezet in pyruvaat (met een nettoproductie van 2 moleculen ATP per glucosemolecuul), die kunnen worden gereduceerd tot lactaat of getransporteerd naar de mitochondriën om te worden omgezet in Acetyl-CoA en de TCA-cyclus binnen te gaan. De TCA-cyclus blijft fietsen gevoed met meer moleculen van Acetyl-CoA en produceert CO2 (die uiteindelijk buiten de cel zal verspreiden en, door te reageren met H2O in het medium, zal genereren koolzuur dat zal leiden tot de verzuring van het medium) en NADH, het molecuul belast met het doneren van elektronen aan de elektronentransportketen (ETC). De elektronen reizen door verschillende eiwitcomplexen en worden uiteindelijk geaccepteerd door zuurstof. Deze complexen (I, III en IV) pompen ook H+ van de mitochondriale matrix in de intermembrane ruimte. Als gevolg van de elektrochemische gradiënt gegenereerd, zal de H+ opnieuw in de matrix via de complexe V (ATP-synthase), het investeren van de potentiële energie verzameld in de generatie van ATP.

Zowel glycolyse als mitochondriale ademhaling kunnen op verschillende punten worden geblokkeerd met behulp van remmers. De kennis en het gebruik van deze remmers was de basis voor de ontwikkeling van de extracellulaire fluxtest. Door twee eenvoudige parameters in real time te meten, zoals pH en zuurstof, leidt de extracellulaire flux analyzer de snelheid van glycolyse en mitochondriale ademhaling af in een 96-put plaat. De glycolysestresstest wordt uitgevoerd in een basaal medium zonder glucose (figuur 1B)7. De eerste metingen van de extracellulaire verzuring (ECAR) zijn indicatief voor glycolyse-onafhankelijke verzuring. Het wordt aangeduid als niet-glycolytische verzuring en correleert met CO2 geproduceerd door de TCA die, zoals eerder uitgelegd, combineert met H2O in het medium om H+ (TCA-gekoppelde ECAR) te genereren. De eerste injectie is glucose om glucosegebruik te induceren en glycolyse te stimuleren. De tweede injectie combineert zowel rotenone, een Complexe I-remmer, en antimycine A, een Complexe III-remmer samen, om de ETC. Cellen te blokkeren reageren op deze dramatische afname van mitochondriale ATP-productie door het activeren van glycolyse om cellulaire ATP-niveaus te handhaven, en dit vertegenwoordigt de hoeveelheid glycolyse die niet wordt gebruikt door de cel in de basale toestand, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op de toename van de ATP-vraag (compenserende glycolyse). De derde injectie is de glucose analoge 2-Deoxyglucose (DG), die concurreert met glucose als substraat voor het enzym hexokinase. Het product van deze fosforylatie, 2-deoxyglucose-6-fosfaat kan niet worden omgezet in pyruvaat, en daarom glycolyse wordt geblokkeerd, waardoor de ECAR tot zijn minimum wordt beperkt. De op dit punt gemeten ECAR omvat andere bronnen van extracellulaire verzuring die niet worden toegeschreven aan glycolyse of ademhalingsactiviteit, evenals eventuele resterende glycolyse die niet volledig door 2-DG (post 2-DG-verzuring) wordt geremd.

De mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd in een medium met glucose (figuur 1C)8. De eerste metingen van het zuurstofverbruik (OCR) komen overeen met de basislijn van mitochondriale ademhaling (basale ademhaling). De eerste injectie is oligomycine, die de terugkeer van protonen via de ATP-synthase (complex V) remt, de ATP-synthese blokkeert en zo snel het mitochondriale membraan hyperpolariseert, wat verdere protonpompen door ademhalingscomplexen voorkomt en leidt tot een afname van OCR. De vergelijking tussen de basisinademing en de waarde die wordt gegeven door toevoeging van oligomycine vertegenwoordigt de atp-gekoppelde ademhaling. De resterende oligomycine-ongevoeligheidsgraad van zuurstofverbruik wordt protonlek genoemd, dat de stroom van protonen door de lipidebilayer of eiwitten in het binnenste mitochondriale membraan vertegenwoordigt, zoals de adenine nucleotide translocase9. De tweede injectie is de ontkoppelaar 2,4-dinitrophenol (DNP), een ionofoër die een massale binnenkomst van H+ in de mitochondriale matrix induceert, wat leidt tot depolarisatie van het mitochondriale membraan en verstoring van mitochondriale ATP-synthese. Cellen reageren op de dissipatie van de proton-bewegingskracht door het verhogen van de snelheid van elektronentransport en zuurstofverbruik tot maximale niveaus in een vergeefse poging om membraan potentieel (maximale ademhalingscapaciteit) te herstellen. Het verschil tussen de maximale ademhalingscapaciteit en de basale ademhaling is de reserveademhalingscapaciteit van de cel, die de hoeveelheid ademhaling vertegenwoordigt die niet door de cel wordt gebruikt om ATP in de basale toestand te genereren, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op een toename van de ATP-vraag of onder stressomstandigheden8. De derde injectie is een combinatie van rotenone en antimycine A. Deze injectie stopt volledig de ETC en OCR daalt tot het laagste niveau, met de resterende zuurstofverbruik wordt niet-mitochondriaal (veroorzaakt door NADPH-oxidases, enz.).

Veranderingen in metabole trajecten kunnen op de een of andere manier de werking van NK-cellen voorspellen, omdat is gesuggereerd dat continue activering van NK-cellen met cytokines in vitro kan leiden tot NK-celuitputting door de studie van verschillende metabole trajecten10,11. De correlatie tussen NK cel metabolische status en functie is zeer belangrijk vanuit het oogpunt van kanker immunotherapie. Op dit gebied is de activering van NK-cellen met infusie van IL-15, alleen of in combinatie met monoklonale therapeutische antilichamen getest om het doden van tumorcellen12,13,14te verbeteren . De kennis van de metabolische status van de NK-cellen in reactie op deze behandelingsstrategieën zou een waardevolle voorspeller zijn van de NK-celactiveringsstatus en de moordfunctie.

De studie van metabole trajecten in andere myeloïde en lymfoïde cellen zoals monocyten, T- en B-cellen is beschreven15 en geoptimaliseerde methoden zijn gepubliceerd16. In dit protocol bieden we een methode die zowel een NK isolatieprotocol combineert dat hoge aantallen zuivere en levensvatbare NK-cellen oplevert als een geoptimaliseerd protocol om metabole activiteit te meten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. Hier tonen we aan dat dit een geldige methode is voor de studie van metabole veranderingen in rust en IL-15 geactiveerde menselijke NK cellen. Voor de extracellulaire fluxtest zijn parameters zoals celnummer en medicijnconcentraties getest en geoptimaliseerd. Vergeleken met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is volledig geautomatiseerd en in staat om te testen in real time, met zeer lage hoeveelheden cellen, tot 92 monsters tegelijk, en dus maakt hoge doorvoer screenings (met meerdere monsters en repliceert) in een relatief snelle manier17.

Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van NK celfunctie door het bestuderen van NK celmetabolisme. Het kan ook worden toegepast op cellen geactiveerd door andere cytokinen, antilichamen of oplosbare stimuli.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes van medisch onderzoek van de Verklaring van Helsinki. Perifere bloedmonsters van donoren werden verkregen van de NIH Department of Transfusion Medicine onder het 99-CC-0168 IRB goedgekeurde protocol, met schriftelijke toestemming van de patiënt.

1. Reagenspreparaat

  1. Reagentia voor de isolatie van NK cellen
    OPMERKINGEN: Bereid deze reagentia voor in een celcultuurkap.
    1. Maak NK scheidingsbuffer voor: Supplement PBS (pH 7.4) met 1 mM EDTA en 2% Foetale kalfsserum (FCS) dat eerder is geïnactiveerd (bij 56 °C gedurende 30 min).
    2. Bereid NK cultuurmedium voor: Supplement Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) met 10% Human Serum (HS). Steriel filter en op te slaan bij 2-8 °C. Verwarm het medium tot 37 °C alvorens toe te voegen aan de cellen.
    3. Resuspend Human IL-15 in PBS op 200 μg/mL.
  2. Reagentia voor extracellulaire fluxtest
    1. Bereid testmedia voor: Voeg voor mitochondriale stresstestmedium 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine en 10 mM glucose toe aan het basismedium; voeg voor glycolyse stresstestmedium 2 mM L-glutamine toe aan het basismedium.
      OPMERKING: De concentraties glucose, pyruvaat en glutamine worden geleverd zoals aanbevolen door de fabrikant van extracellulaire fluxanalysator. Echter, media samenstelling kan worden gewijzigd door onderzoekers om perfect te passen bij die van het cultuurmedium, indien gewenst.
    2. Pas de pH van beide media aan op 7,4 met 0,1 N NaOH met een benchtop pH-meter, steriel filter door een poriegrootte van 0,2 μM en op te slaan bij 2-8 °C. Verwarm de media tot 37 °C, controleer de pH en bij te passen tot 7,4 voor gebruik indien nodig.
      LET OP: Alleen omgevingsCO2 is opgenomen in de atmosfeer van de extracellulaire flux analyzer, het gebruik van media zonder bicarbonaat is van cruciaal belang.
    3. Bereid voorraadoplossingen voor reagentia voor: Oligomycine (ATP synthase inhibitor), 10 mM stock solution in DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, ontkoppel), 1 M voorraadoplossing in DMSO; antimycine A (complexe III-remmer), 10 mM-voorraadoplossing in DMSO; rotenone (complex I inhibitor), 10 mM voorraadoplossing in DMSO. Maak 30 μL aliquots van alle reagentia en bewaar bij -20 °C.
      OPMERKING: Deze richtlijnen zijn bedoeld voor reagentia die individueel zijn gekocht en door de onderzoeker zijn voorbereid. Als reagentia in plaats daarvan worden gekocht bij de fabrikant van de analysator, volgt u hun richtlijnen voor de voorbereiding van reagens.

2. NK-cellenisolatie van perifeer bloed

  1. Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) preparaat uit menselijk bloed
    OPMERKING: Voer deze stappen uit in een celcultuurkap. Ontsmetting van alle residuen en materiaal in contact met bloed met bleekmiddel en gooi ze in de juiste container te verbranden.
    1. Pipette 20 mL lymfocyten scheidingsmedium (LSM) in een conische buis van 50 mL.
    2. Voorzichtig, terwijl de buis in een hoek van 30°, pipet 20 mL bloed over de LSM, zeer voorzichtig en het aanraken van de wand van de buis. Vermijd het mengen van bloed met de LSM en maak een zichtbare en goed gedefinieerde interfase tussen de twee vloeistoffen.
      LET OP: Perifeer bloed of verrijkte leukaferese producten kunnen worden gebruikt.
    3. Centrifugeren de buizen gedurende 25 min, 1000 x g bij kamertemperatuur. Gebruik geen rem, omdat het beide fasen in de buis (LSM en bloed) zou kunnen laten mengen.
    4. Haal de buizen voorzichtig uit de centrifuge en leg ze in een rek. Controleer op de aanwezigheid van een opvallende laag cellen (mononucleaire cellen) die zich in de interfase tussen LSM (helder) en plasma (geel) zal vormen, terwijl rode bloedcellen aan de onderkant van de buis pellet.
    5. Draag de mononucleaire cellaag voorzichtig aan met een 10 mL plastic pipet (ongeveer 5-8 mL) en plaats deze in een nieuwe conische buis van 50 mL. De lymfocyten interfase van maximaal 2 verschillende buizen kan samen worden samengevoegd.
    6. Was de mononucleaire cellen 2x door resuspending in 45 mL PBS en centrifugeren op 800 x g gedurende 5 minuten, bij kamertemperatuur.
      LET OP: Na deze stap wordt een pellet van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) verkregen en kan de onderzoeker overgaan tot de NK isolatiestap.
  2. NK isolatie van PBMCs
    1. Tel de cellen van 2.1.6 en verstig ze opnieuw in NK Separation Buffer (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Neem 10 mL van de cel resuspension (109 PBMCs) en plaats ze in een 50 mL buis.
    3. Voeg 500 μL (50 μL/mL buffer) van NK celisolatie antilichaam mix en 10 μL (1 μL/ mL buffer) van anti-CD3 positieve isolatie antilichaam mix aan de PBMCs en incbaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    4. Draai de magnetische kralen en voeg 1 mL toe aan de mix van PBMCs met antilichamen (100 μL kralen/ml PBMCs). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met af en toe roeren.
    5. Voeg 35 mL NK isolatiebuffer (3,5 ml buffer/ml PBMCs) toe, meng en plaats op de magneet gedurende 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Na die tijd zullen de kralen en cellen positief geselecteerd (alle, behalve NK cellen) zich aan de wanden van de buis hebben gehouden.
    6. Verzamel de supernatant (met NK-cellen) voorzichtig met een 50 mL plastic pipet zonder de zijkanten of de onderkant van de buis aan te raken.
    7. Tel de cellen met behulp van een cel teller en centrifuge op 800 x g gedurende 5 min.
    8. Resuspend isoleerde NK-cellen op 5 x 106 cellen/mL in IMDM met 10% GS en plaats ze in een couveuse op 37 °C met 5% CO2 totdat het experiment wordt uitgevoerd.
      LET OP: In dit NK isolatieprotocol worden celnummers en reagensvolumes aangepast voor het gebruik van een buis van 50 mL en een grote magneet. Dit protocol kan worden opgeschaald (in het geval er meer PBMCs worden verkregen) door de isolatiestappen in verschillende buizen te herhalen of te verkleinen door het volume in de buis te verminderen. Voor de uiteindelijke volumes van 14-45 mL wordt een 50 mL polystyreenbuis gebruikt, voor volumes 4-14 wordt een 15 mL polystyreenbuis gebruikt en voor volumes 1-4 mL wordt een 5 mL polystyreenbuis gebruikt. De magneet is anders en past in elk geval op de juiste buis. De hoeveelheid antilichaammix en magnetisch kralen kan ook worden geschaald op basis van het aantal cellen en het uiteindelijke volume.
  3. NK celpopulatie kleuring voor stroomcytometrie
    1. Neem 0,25 x 106 cellen per monster uit stap 2.2.8, verwijder het medium door 800 x g gedurende 5 minuten te centreren bij kamertemperatuur en de celpellet opnieuw te openen in 500 μL PBS.
    2. Voeg levensvatbaarheidskleurstof toe volgens de aanbeveling van de fabrikant (1 μL dmso-gereconstitueerde kleurstof tot 1 mL celverzuim) en broed bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    3. Was 2x door resuspending in 5 mL PBS en centrifugeren op 800 x g gedurende 5 minuten, bij kamertemperatuur.
    4. Vlek met de overeenkomstige anti-menselijke antilichamen in 100 μL IMDM met 10% GS gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht (zie tabel 1). Alle antilichamen kunnen worden gecombineerd en gebruikt in een enkele kleuring stap.
    5. Analyseer de monsters door stroomcytometrie om de zuiverheid van de verkregen NK-celpopulatie te evalueren. Gebruik de celgating- en analysemethode die eerder is beschreven18,19.
  4. NK cellen stimulatie met oplosbare IL-15
    1. Resuspend 0,75 x 106 cellen uit stap 2.2.8 of 2.4.3 in 100 μL IMDM met 10% GS in een put van een 96 well-plate (ronde onder).
    2. Verdun menselijke IL-15 tot 1 μg/mL in IMDM met 10% GS. Voeg 100 μL van de verdunde menselijke IL-15 toe aan de cellen om een uiteindelijke concentratie van 0,5 μg/mL te bereiken.
      OPMERKING: 0,5 μg/mL is een verzadigende concentratie van IL-15. Lagere concentraties van IL-15 of andere cytokinen zoals IL-2, IL-12 of IL-18 kunnen indien gewenst door onderzoekers worden getest.
    3. Plaats de cellen in de couveuse op 37 °C en stimuleer gedurende 48 uur voordat u de extracellulaire fluxtest uitvoert. Niet-geprisuleerde (controle)cellen opnieuw opschort met dezelfde concentratie en volume in IMDM met 10% GS zonder IL-15, en plaats ze 48 uur in dezelfde incubator.

3. Hydratatie van sensorcartridge

OPMERKING: De 96 sondetips van de sensorcartridge bevatten individuele solid-state fluoroforen voor O2 en H+ die gehydrateerd moeten worden om veranderingen in O2 en pH te detecteren.

  1. Zet de analyzer aan en laat hem opwarmen tot 37 °C.
  2. Open het sensorcartridgepakket en scheid de sensorcartridge van de hulpplaat. Voeg 200 μL van de calibrantoplossing toe in elke put van de hulpplaat en zet de sensorcartridge terug op de plaat, waarbij wordt gevalideerd dat de sensoren volledig in de oplossing zijn ondergedompeld. Voor optimale resultaten ontvoed de cartridge 's nachts bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator die goed bevochtigd is om verdamping te voorkomen. Voorkom bellenvorming onder de sensoren tijdens hydratatie.
    LET OP: De minimale hydratatietijd van de cartridge is 4 uur bij 37 °C in een CO2-vrijecouveuse. U ook 's nachts hydratatie van de sensorcartridge met 200 μL steriel water bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator, gevolgd door een incubatie van de sensorcartridge met 200 μL voorverwarmde calibranteoplossing 45 – 60 min vóór het begin van de run, worden gebruikt.

4. Extracellulaire fluxtest

  1. Bereiding van met lijm beklede platen
    OPMERKING: Aangezien de meting van metabolische parameters plaatsvindt in een microkamer gevormd aan de onderkant van de 96-bronplaat, moeten suspensiecellen eerst aan de onderkant van de put worden vastgetrokken. Er wordt gebruik genomen van een cellijm uit de mossel Mytilus edulis. De fabrikant van de cellijm beveelt een coatingconcentratie van 1 tot 5 μg/cm2aan. De put van de analysecelkweek microplaat heeft een oppervlak van ongeveer 0,110 cm2. Voor een concentratie van 5 μg/cm2 is dus ongeveer 0,55 μg lijm nodig. Aangezien 25 μL van de lijmoplossing zal worden gebruikt om elke put te coaten, is de optimale concentratie van lijmoplossing voor de analysecelkweek microplaten ongeveer 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Bereid 2,5 mL celkleefoplossing (22,4 μg/mL) voor in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 8.0. Bicarbonaat biedt de optimale pH voor celaanhangende prestaties die volgens de fabrikant tussen de 6,5 en 8,0 ligt.
    2. Pipette 25 μL van de celkleefoplossing voor elke put van de testplaat en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder daarna de oplossing en was 2x met 200 μL steriel water/put. Laat de putten drogen door de plaat 15 minuten open te houden in een celkweekkap.
      LET OP: Gecoate platen mogen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
  2. Celzaaien in platen bekleed met lijm
    1. Centrifugecellen van stap 2.4.3 bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatants en was cellen in opgewarmde mitochondriale stresstest medium (als een mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd) of glycolyse stress test medium (als een glycolyse stress test wordt uitgevoerd). Pelletcellen opnieuw en opnieuw opsplitsen naar de voorkeurscelconcentratie in hetzelfde medium (resuspensievolume is afhankelijk van de gekozen celconcentratie; aangezien elke put 180 μL van de celsuspensie zal bevatten, bereid 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 en 8,33 x 10 6 cellen/mL-celsuspensie voor10 0,047 x 106, 0,094 x 106,0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 en 1. 5 x10 6 cellen per put respectievelijk).
    2. Plaat 180 μL celsuspensie per put langs de zijkant van elke put. Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen. Gebruik putten A1, A12, H1 en H12 van de analyzer kweekplaat als controleputten voor achtergrondcorrectie. Voeg 180 μL van het testmedium toe in deze putten (geen cellen). Extra controleputten kunnen indien gewenst worden gebruikt en als er voldoende ruimte in de plaat zit.
      OPMERKING: De aanwezigheid van serum kan een slechte celbevestiging veroorzaken.
    3. Incubeer de plaat 30 min bij 37 °C in een CO2-vrijecouveuse. Bereid ondertussen 10x verbindingen voor (zie stap 4.3 hieronder).
    4. Wijzig de instellingen voor centrifugeren in nul remmen. Centrifugeren de plaat op 200 x g gedurende 5 minuten. Observeer de cellen onder de microscoop om te controleren of ze een monolaag vormen aan de onderkant van de put. Breng de platen 25 minuten terug naar de CO2-vrijecouveuse. Voor de beste resultaten mag de totale tijd na beplating niet groter zijn dan ongeveer 1 uur.
  3. Voorbereiding van 10x werkende oplossingen om in sensorcartridge te laden
    OPMERKING: Elk van de 96 sondetips van de sensorcartridge herbergt 4 poorten (A, B, C en D) die kunnen worden gebruikt om verbindingen sequentieel in afzonderlijke putten te injecteren.
    1. Om mitochondriale stresstest uit te voeren, bereidt u 2,5 mL elk van 10 μM oligomycine, 1 mM DNP en een mengsel van 10 μM rotenone en 10 μM antimycine A, in mitochondriaal stresstestmedium (gebruik de voorraadoplossingen vanaf stap 1.2.3). De uiteindelijke concentraties in de put na injectie zijn 1 μM oligomycine, 0,1 mM DNP en 1 μM antimycine A/rotenone.
    2. Om glycolyse stresstest uit te voeren, bereidt u 2,5 mL van een mengsel van 10 μM rotenone en 10 μM antimycine A in glycolyse stress testmedium (gebruik de voorraadoplossingen vanaf stap 1.2.3). Los glucose op in glycolyse stresstest medium voor een 100 mM oplossing en 2-deoxy-glucose (2-DG) in glycolyse stress test medium voor een 500 mM oplossing. De uiteindelijke concentraties in de put na injectie zijn 10 mM glucose, 1 μM antimycine A/rotenone en 50 mM 2-DG.
    3. Verwarm de oplossingen tot 37 °C, controleer de pH en bijstel indien nodig naar 7,4. Laadverbindingen bereid in stap 4.3.1. (voor een mitochondriale stresstest) of 4.3.2 (voor een glycolysestresstest) in de poorten A, B en C van de gehydrateerde sensorcartridge (vanaf stap 3.2) met behulp van een micropipettor met meerdere kanalen en de poortbeladingshulplijnen die bij de cartridge zijn voorzien, zoals aangegeven in tabel 2.
      OPMERKING: Om tijdens de test een goede injectie in alle putten te garanderen, moet elke reeks poorten die worden gebruikt (bijvoorbeeld alle poorten A) hetzelfde injectievolume bevatten over de gehele sensorcartridge. Dit geldt voor achtergrondcorrectie putten en zelfs voor die putten niet gebruikt in het experiment.
    4. Incubeer de geladen sensorcartridge bij 37 °C in een CO2-vrijeincubator tijdens het opzetten van het programma.
  4. Extracellulaire fluxtestprotocollen instellen
    1. Open de extracellulaire flux analyzer software, en met behulp van de Groep Definities en Plate Map tabbladen geven groepen van putten die vergelijkbare voorwaarden hebben (bijvoorbeeld putten met hetzelfde aantal cellen, of putten met rustende cellen of IL-15-gestimuleerd cellen). Geef ook achtergrondcorrectieputten aan (standaard A1, A12, H1 en H12 worden ingesteld, maar extra putten kunnen worden gebruikt) en lege putten.
    2. Stel het programma in dat in tabel 3 in de software wordt beschreven met behulp van het tabblad Protocol.
    3. Begin het programma met het tabblad Assay uitvoeren. Plaats de sensorcartridge (gehydrateerd en geladen met 10x verbindingen) en hulpplaat op de lade. Vervang na de kalibratiestap (15 – 20 min) desgevraagd de rembrantplaat voor de testplaat (zonder deksel) door bijgevoegde cellen. Hierna is de run volledig geautomatiseerd (de machine voert alle metingen en injecties uit).
      OPMERKING: Het is mogelijk om een mitochondriale stresstest en een glycolytische stresstest uit te voeren in dezelfde plaat, zolang de specifieke verbindingen in de juiste poorten worden geladen (oligomycine, DNP en antimycine/rotenone in havens A, B en C respectievelijk van de putten waar een mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd; glucose, antimycine/rotenone en 2-DG in de havens A, B en C van respectievelijk de putten waar een glycolyse stresstest wordt uitgevoerd), dezelfde volumes voor injecties worden gebruikt in elke reeks poorten en putten voor elke test worden correct geïdentificeerd met behulp van de groepsdefinities en de lipjes van de kaart van de software.
    4. Na de voltooiing van de run, haal de gegevens op en analyseer ze met behulp van de software.

5. Bepaling van het celnummer

OPMERKING: De resultaten kunnen worden genormaliseerd om rekening te houden met mogelijke verschillen in celnummer. Twee belangrijke benaderingen die hieronder worden beschreven, kunnen worden gebruikt.

  1. DNA-inhoud bepaling
    1. Verwijder het resterende testmedium met een pipet uit elke put. Let er bij het oppirerend medium op dat de cellen niet storen. De plaat kan worden opgeslagen bij -20 °C tot analyse.
      LET OP: De vriesstap is belangrijk voor de efficiënte cellyse en DNA-inhoudsbepaling.
    2. Bereid een 1x oplossing voor van celproliferatietestcellysebuffer (20x) in gedestilleerd water (200 μL/well).
    3. Voeg de cel proliferatie test kleurstof voorraad oplossing (400x) in de 1x cel-lyse buffer. Voor de detectie van 50 tot 50.000 cellen per put, gebruik 1x cel proliferatie testkleurstof. Voor hogere celnummers wordt het gebruik van de celproliferatieteststof bij een uiteindelijke concentratie hoger dan 1x aanbevolen. Gebruik in dit geval de celproliferatieteststof bij een 5x eindconcentratie (verdun de celproliferatietestvoorraadoplossing 80-voudig in 1x cellysebuffer).
    4. Voeg 200 μL van de celproliferatietestreage aan elke put toe. Incubeer de monsters gedurende 2-5 min bij kamertemperatuur. Bescherm tegen licht.
    5. Meet de fluorescentie van de monsters bij excitatie: 480 nm; emissie: 520 nm met behulp van een fluorescentie microplate lezer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  2. Bepaling van het eiwitgehalte
    1. Voorzichtig, aspirate volledig de test medium van elke put zonder het aanraken van de cellen en bevriezen van de cellen op -20 °C voor ten minste 1 uur. Als alternatief kunnen de cellen langer (tot 1 week) bevroren worden bewaard totdat de analyse wordt uitgevoerd.
    2. Voeg 50 μL radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lyse medium toe aangevuld met 1x proteaseremmers (van een 100x voorraadoplossing) aan elke put. Plaats de plaat 5 minuten op een shaker bij kamertemperatuur en broed de plaat vervolgens 30 minuten op ijs voor een volledige cellyse.
    3. Centrifugeren de plaat gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur. Deze stap zal pellet cellulaire puin om interferentie met de eiwitmeting te voorkomen.
    4. Meet de eiwitconcentratie door bicinchoninic acid (BCA) test volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie van NK-cellen uit perifeer bloed zorgt voor een zuivere en levensvatbare populatie

De extracellulaire fluxtest is gebaseerd op de meting van de H+ en O2-concentratie in de put en zal geen onderscheid maken tussen verschillende populaties cellen of hun levensvatbaarheid. Om deze reden was het verkrijgen van een zeer zuivere en levensvatbare populatie van de cel van belang de belangrijkste stap om te slagen in deze experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit document hebben we een protocol opgesteld voor het efficiënt isoleren en kweken van zuivere en levensvatbare primaire menselijke NK-cellen uit perifeer bloed. We hebben ook de voorwaarden geoptimaliseerd voor de meting van de metabolische activiteit van deze NK cellen beoordeeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring met behulp van een extracellulaire flux analyzer. In vergelijking met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is snel, vereist kleine aantallen cellen, en maakt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie. Deze studie werd ondersteund door de intramurale onderzoeksprogramma's van de National Institutes of Health, National Cancer Institute en National Heart, Lung, and Blood Institute. JT wordt ondersteund door het Ramon y Cajal programma (grant RYC2018-026050-I) van MICINN (Spanje).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with LidCostar3799NK cell culture
Antimycin AMilliporeSigmaA8674Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesFlow data acquisition
BD LSR FortessaBD BiosciencesFlow data acquisition
Cell-TakCorning354240Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assayThermoFisher ScientificC7026Cell proliferation Assay voor DNA kwantificering. Bevat cell-lysis buffer en CyQUANT GR kleurstof
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IIStemcell technologies17851NK cell isolatie uit PBMC's
EasySep Human NK cell Enrichment KitStemcell technologies19055NK cell isolatie uit PBMC's
EasySep MagnetStemcell technologies18001NK cell isolatie uit PBMC's
EDTA 0.5 M, pH 8Quality Biological10128-446NK cell scheidingsbuffer
FACS tubesFalcon-Fisher Scientific352235Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubesFalcon-Fisher Scientific14-432-22NK cell scheiding
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437-028NK cell scheidingsbuffer
FlowJo SoftwareBD BiosciencesFlow data analyse
GlucoseMilliporeSigmaG8270Component van mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Protease inhibitor 100X. Gebruik in RIPA lysis buffer
Human IL-15Peprotech200-15-50ugNK cell stimulatie
Human serum (HS)Valley Biomedical9C0539NK cell cultuurmedium supplement
IMDMGibco12440053NK cell cultuurmedium
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Component van stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Viabiliteitskleurstof voor flow cytometry staining
LSMmpbio50494XPBMC's scheiding uit menselijk bloed
Mouse anti-human CD3 BV711BD Biosciences563725T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PEBD Pharmingen555516NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PEBD Pharmingen557991NK flow cytometry staining
OligomycinMilliporeSigma75351Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4Gibco10010-023NK cell scheidingsbuffer
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225Voor bepaling van eiwitconcentratie
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115Cel lysis
RotenoneMilliporeSigmaR8875Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentController voor de Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentVoor data analyse
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Extracellular Flux assay basismedium
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentExtracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Bevat 20 XF96 celcultuurplaten, 18 XFe96 sensor cartridges, belastingsgidsen voor het overbrengen van verbindingen naar de testcartridge en 1 fles calibratieoplossing (500 ml).
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS5761Voor de bereiding van de Cell-Tak oplossing
Sodium pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Component van mitochondrial stress test medium

Referenties

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016(2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Natural Killer-cellenExtracellular Flux AnalyzerGlycolysemetingMitochondriale RespiratieIL-15-stimulatieLymfocytenseperatieFlowcytometrieZuurstofconsumptiesnelheidExtracellulaire VerzuringAnalyse van het Celmetabolisme
Analyse van human natural killer cell metabolisme
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.