Droge poederformuleringen voor inhalatie hebben een groot potentieel bij de behandeling van luchtwegaandoeningen. Voordat men aan menselijke studies begint, is het noodzakelijk om de werkzaamheid van de droge poederformulering in preklinische studies te evalueren. Een eenvoudige en niet-invasieve methode voor de toediening van droog poeder bij muizen via de intratracheale route wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intratracheale toediening van droge poederformulering bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bij de ontwikkeling van inhaleerbare droge poederformuleringen is het essentieel om hun biologische activiteiten te evalueren in preklinische diermodellen. Dit artikel introduceert een niet-invasieve methode voor intratracheale toediening van droge poederformulering bij muizen. Een droog poederlaadapparaat dat bestaat uit een 200 μL gellaadpipettip die via een driewegkraan op een spuit van 1 ml is aangesloten, wordt gepresenteerd. Een kleine hoeveelheid droog poeder (1-2 mg) wordt in de pipetpunt geladen en door 0,6 ml lucht in de spuit verspreid. Omdat pipettips wegwerpbaar en goedkoop zijn, kunnen verschillende droge poederformuleringen van tevoren in verschillende tips worden geladen. Verschillende formuleringen kunnen in hetzelfde dierproef worden geëvalueerd zonder apparaatreiniging en dosisvulling, waardoor tijd wordt bespaard en het risico op kruisbesmetting door restpoeder wordt geëlimineerd. De mate van poederdispersie kan worden geïnspecteerd door de hoeveelheid poeder die in de pipetpunt achterblijven. Een protocol van intubatie in muis met een op maat gemaakte lichtbron en een geleide canule is inbegrepen. Een goede intubatie is een van de belangrijkste factoren die de intratracheale afgifte van droge poederformulering aan het diepe longgebied van de muis beïnvloedt.
Inleiding
De longroute van toediening biedt verschillende voordelen bij het leveren van therapeutische voor zowel lokale als systemische acties. Voor de behandeling van longziekten kan een hoge lokale medicijnconcentratie worden bereikt door longafgifte, waardoor de vereiste dosis wordt verlaagd en de incidentie van systemische bijwerkingen wordt verlaagd. Bovendien kunnen de relatief lage enzymatische activiteiten in de long het voortijdige medicijnmetabolisme verminderen. De longen zijn ook efficiënt voor drugabsorptie voor systemische actie toe te schrijven aan het grote en goed-doordrenkte oppervlakte, de uiterst dunne epitheliale cellaag en het hoge bloedvolume in longcapillairen1.
Geïnhaleerde droge poederformuleringen zijn op grote schaal onderzocht voor de preventie en behandeling van verschillende ziekten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, diabetes mellitus en longvaccinatie2,3,4. De drugs in de vaste staat zijn over het algemeen stabieler dan in de vloeibare vorm, en de droge poederinhalatoren zijn draagbaarder en gebruiksvriendelijker dan vernevelaars5,6. Bij de ontwikkeling van inhalatie droge poederformuleringen moeten de veiligheid, het farmacokinetische profiel en de therapeutische werkzaamheid worden geëvalueerd in preklinische diermodellen na longtoediening7. In tegenstelling tot mensen die droog poeder actief kunnen inademen, is longlevering van droog poeder aan kleine dieren een uitdaging. Het is noodzakelijk om een efficiënt protocol vast te stellen voor het leveren van droog poeder aan de longen van dieren.
Muizen worden veel gebruikt als onderzoeksdiermodellen omdat ze economisch zijn en ze goed fokken. Ze zijn ook gemakkelijk te hanteren en veel ziektemodellen zijn goed ingeburgerd. Er zijn twee belangrijke benaderingen om droog poeder toe te dienen aan de long van de muis: inhalatie en intratracheale toediening. Voor inademing wordt de muis in een kamer met alleen het hele lichaam of de neus geplaatst waar droog poeder wordt verneveld en de dieren de aerosol inademen zonder sedatie8,9. Dure apparatuur is vereist en de efficiëntie van de medicijnafgifte is laag. Hoewel de kamer voor het hele lichaam technisch minder uitdagend kan zijn, kan de blootstellingskamer alleen voor de neus de blootstelling van geneesmiddelen aan het lichaamsoppervlak minimaliseren. Hoe dan ook, het is nog steeds moeilijk om de dosis die aan de longen wordt geleverd nauwkeurig te controleren en te bepalen. Het droge poeder wordt voornamelijk afgezet in het nasopharynxgebied waar mucociliaire klaring prominent aanwezig is10. Bovendien staan muizen in de kamer tijdens het toedieningsproces onder aanzienlijke druk omdat ze beperkt zijn en geen voedsel- enwatervoorziening hebben 11. Voor intratracheale toediening verwijst het over het algemeen naar het rechtstreeks inbrengen van de stof in de luchtpijp. Er zijn twee verschillende technieken om dit te bereiken: tracheotomie en orotracheale intubatie. De eerste vereist een chirurgische procedure die een incisie in de luchtpijp maakt, die invasief is en zelden wordt gebruikt voor poedertoediening. Alleen de tweede techniek wordt hier beschreven. In vergelijking met de inhalatiemethode is intratracheale toediening de meest gebruikte methode voor longafgifte bij de muis vanwege de hoge afgifte-efficiëntie met minimaal medicijnverlies12,13. Het is een eenvoudige en snelle methode om precies een kleine hoeveelheid poeder binnen een paar milligram aan de muis te leveren. Hoewel de muis anatomisch en fysiologisch verschilt van de mens en anesthesie vereist is tijdens het intubatieproces, omzeilt intratracheale toediening de bovenste luchtwegen en biedt een effectievere manier om de biologische activiteiten van de droge poederformulering te beoordelen, zoals de longabsorptie, biologische beschikbaarheid en therapeutische effecten14,15.
Om droog poeder intratracheally toe te dienen, moet de muis worden geïntubeerd, wat een uitdaging kan zijn. In dit artikel wordt de fabricage van een op maat gemaakte droge poederinsufflator en een intubatieapparaat beschreven. De procedures van intubatie en insufflatie van droog poeder in de long van de muis worden gedemonstreerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), de Universiteit van Hong Kong. Droge poederformuleringen bereid door spray freeze drying (SFD) met 0,5% luciferase messenger RNA (mRNA), 5% synthetisch peptide PEG12KL4 en 94,5% van mannitol (m/w) worden in deze studie gebruikt om mRNA-expressie in de long aan te tonen16. De massa mediane aerodynamische diameter (MMAD) van SFD poeder is 2,4 μm. Spray gedroogd (SD) mannitol poeder worden gebruikt om het effect van luchtvolume gebruikt in poeder dispersie16te onderzoeken . De MMAD van SD poeder is 1,5 μm.
1. Vervaardiging van droge poeder insufflator en het laden van droog poeder
- (Optioneel) Neutraliseer de statische ladingen van droog poeder (in een flacon) en de 200 μL niet-filter ronde gel-laden pipet tip. Gebruik een antistatisch pistool of een balans met deïstiserende functie volgens de instructies van de fabrikant.
- Maak een weegpapier met een afmeting van ongeveer 4 cm x 4 cm. Vouw het papier diagonaal doormidden en vouw het vervolgens uit.
- Weeg 1-2 mg droog poeder op het weegpapier.
- Vul een gelbelading pipetpunt met poeder door de bredere opening van de punt. Tik zachtjes om het poeder in te pakken totdat het poeder losse agglomeraten vormt aan het smalle uiteinde van de punt (Figuur 1A). Vermijd het te strak verpakken van het poeder, omdat dit de poederdispersie kan belemmeren.
- Sluit de poederbelaste punt aan op een spuit van 1 ml via een driewegskraan (afbeelding 1B). De grootte van de spuit kan worden gewijzigd op basis van het volume lucht dat wordt gebruikt om het poeder te verspreiden. Houd de punt en spuit verticaal tijdens de aansluiting om morsen van poeder te voorkomen. Als de toediening niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, gebruik dan parafilm om de openingen van de punt af te dichten en bewaar deze tijdelijk onder geschikte omstandigheden tot toediening.
2. Fabricage van intubatieapparaat
- Lichtbron (figuur 2)
- Bereid een op maat gemaakte lichtbron voor met een led-toorts (light emitting diode) en een flexibele optische vezel met een diameter van 0,8-1 mm.
- Maak een gecentreerde opening op de heldere lens van de LED-toorts met een handboor of een boor zodat de optische vezel er nauwelijks doorheen kan.
- Steek de optische vezel door de opening. Schakel de LED-toorts in om de positie en de insteekdiepte aan te passen voor maximale helderheid aan de andere kant van de glasvezel.
- Breng de optische vezel op zijn plaats aan met heldere epoxylijm.
- Geleide canule (figuur 3)
- Neem een plastic Pasteur pipet van 1 ml(afbeelding 3A)en houd de pipet aan beide uiteinden vast.
- Gebruik een alcohollamp (of andere warmtebronnen in het laboratorium zoals een Bunsen-brander) om het midden van de pipet te verwarmen door deze op 5-10 cm boven de vlam te plaatsen (Figuur 3B). Draai de pipet om ervoor te zorgen dat deze gelijkmatig wordt verwarmd.
- Wanneer het plastic zacht en vervormbaar wordt, beweegt u de pipet weg van de vlam en rekt u de pipet voorzichtig uit.
- Knip de uitgerekt pipet in het midden met een schaar in deel A en deel B (afbeelding 3C-E). Gebruik deel A als fijne tippipet en deel B als geleide canule. Om de kans op succesvolle intubatie met de geleide canule te vergroten, maakt u een schuine kant (niet te scherp die het risico op verwonding van het dier kan verhogen) aan het einde van deel B (figuur 3F). Wanneer een 200 μL gel-ladende pipettip (voor poederlading) in de geleidekanule wordt gestoken, moet deze de canule 1-2 mm uitsteken.
OPMERKING: Een geleide canule (deel B) met de juiste afmeting (interne en externe diameter) voor intubatie kan een naald van 21 gauge erin hebben, terwijl deze ook in een naald van 17 gauge past. Meerdere pogingen kunnen nodig zijn om de pipetten uit te rekken om de juiste dimensie te bereiken. - (Optioneel): Knip een kleine opening aan het bredere uiteinde van de geleidekannula om deze flexibeler te maken, zodat het gemakkelijker is om de optische vezel vast te houden(figuur 3F). Deze opening maakt het ook mogelijk om een microsprayer aan te sluiten voor de toediening van vloeibare aerosol.
3. Intubatie
- Verdoof de muis (BALB/c, 7-9 weken) met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door intraperitoneale injectie.
- Maak een platform van plexiglas klaar en monteer het met een klem op een standaard (afbeelding 4A). Plaats de verdoofde muis op het platform (bij ongeveer 60° helling) in een liggende positie. De hoogte en hellingshoek van het platform kunnen worden aangepast door de positie van de klem op de standaard.
- Hang de muis op door de snijtanden aan een nylon floss te haken (figuur 4B). Bevestig de positie van de muis met een stuk tape of een elastiekje.
- Steek de optische vezel in de geleidekanule vóór intubatie met de punt van het vezelniveau met de opening van de geleidekanule. Schakel de LED-toorts in om op te lichten.
- Steek voorzichtig de tong van de muis uit met een tang om de luchtpijp bloot te leggen.
- Gebruik de andere hand om de geleidekanule met optische vezel erin te houden. Steek ze door de mondholte. Met de verlichting van de optische vezel kan de opening van de luchtpijp worden gevisualiseerd als een opening tussen de stembanden.
- Lijn de schuine kant van de geleidekanule uit naar de middellijn van de opening (figuur 5A). Intubeer de geleide canule voorzichtig met optische vezels in de luchtpijp door de fijnste punt van de canule op de luchtpijpopening te richten.
- Verwijder bij intubatie snel de optische vezel en laat de geleide canule in de luchtpijp (figuur 5B). Een normale ademhaling moet in acht worden genomen.
- Houd de fijne tippipet (deel A) bij de opening van de geleidekannula en insufflaat een kleine luchtwolk (ongeveer 0,2 ml) in de long van de muis. Een lichte inflatie in de borst van de muis duidt op een goede intubatie. Verwijder de fijne tippipet voordat u poedertoedient.
4. Poedertoediening
- Houd de poederbelaste punt vast die op de spuit is aangesloten, zoals beschreven in stap 1.5. Zorg ervoor dat de luchtstroom tussen de spuit en de punt is losgekoppeld.
- Trek de zuiger van de spuit naar achteren om 0,6 ml lucht terug te trekken.
OPMERKING: De hoeveelheid lucht die wordt gebruikt om het poeder te dispergeren is afhankelijk van de eigenschappen van het poeder en de hoeveelheid geladen poeder. Dit wordt verder beschreven in de resultatensectie. - Draai aan de klep van de driewegkraan om de luchtstroom tussen de spuit en de poederbelaste punt aan te sluiten.
- Steek de met poeder geladen punt in de geleidekanule die al in de luchtpijp van de muis is geplaatst (afbeelding 5C). Houd de geleide canule vast en duw de zuiger van de spuit krachtig in één continue actie om het poeder als aerosolen in de long te verspreiden.
OPMERKING: Elke voorwaartse beweging van het apparaat moet worden geminimaliseerd om verwonding van het dier te voorkomen. - Verwijder de punt en controleer of het poeder in de punt is geleegd. Zo niet, herhaal dan stap 4.1 tot en met 4.4.
OPMERKING: Als het poeder te strak is verpakt als gevolg van overmatig tikken, kan het zijn dat het niet goed wordt verspreid. - Zodra de toediening is voltooid, verwijdert u de geleidekanule uit de luchtpijp.
- Laat de muis herstellen door hem horizontaal in een liggende positie te plaatsen met zijn tong half uitsteekt om de blokkade van de luchtwegen te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer een droge poederinsufflator wordt gebruikt om poederaërosol aan de long van een dier te leveren, is het gebruikte luchtvolume van cruciaal belang omdat het de veiligheid en de efficiëntie van de poederdispersie beïnvloedt. Om de methode te optimaliseren, werden verschillende luchtvolumes (0,3 ml, 0,6 ml en 1,0 ml) gebruikt om het droge poeder (1 mg gespoten gedroogde mannitol) te dispergeren en werd het gewicht van muizen gedurende 48 uur na toediening gecontroleerd (figuur 6). Het g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel worden op maat gemaakte apparaten voor droge poedersufflatie en intratracheale intubatie gepresenteerd. In de poederlaadstap wordt droog poeder in een pipetpunt van 200 μL gel geladen. Het is belangrijk om voorzichtig op de punt te tikken om de losse verpakking van poeder aan het smalle uiteinde van de punt mogelijk te maken. Als het poeder echter te strak is verpakt, komen ze vast te zitten in de punt en kunnen ze niet goed worden verspreid. Het wordt aanbevolen om de statische ladingen van het poeder en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om openbaar te maken.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de heer Ray Lee, de heer HC Leung en de heer Wallace So bedanken voor hun vriendelijke hulp bij het maken van de lichtbron en poederinsufflator; en de Facultaire Kernfaciliteit voor de hulp bij dierbeeldvorming. Het werk werd ondersteund door de Research Grant Council, Hong Kong (17300319).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BALB/c-muis | Vrouwelijk; 7-9 weken oud; Lichaamsgewicht 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Lichtemitterende diode (LED) zaklamp | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| Een milliliter spuit zonder naald | Terumo | SS-01T | |
| Optische vezel | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4-peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Kunststof Pasteur-pijpje met fijne punt | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Driewegstopkraan | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 antistatische pistool | MILTY | 5036694022153 |
Referenties
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
- Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
- de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
- Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
- Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
- He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
- Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
- Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454(2017).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Price, D. N., Muttil, P. Delivery of Therapeutics to the Lung. Methods in Molecular Biology. 1809, 415-429 (2018).
- Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
- Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
- Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
- Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
- Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
- Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
- Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
- Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
- Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
- Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
- Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
- Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
