Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Samenvatting

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Samenvatting

High-throughput transcriptome en epigenome profilering vereist voorbereiding van een enkele cel of enkele kernen schorsing. Voorbereiding van de suspensie met intacte cel of kernen omvat dissociatie en permeabilisatie, stappen die ongewenste ruis en ongewenste schade kunnen veroorzaken. In het bijzonder, bepaalde cel-types zoals neuronen zijn een uitdaging om te scheiden in individuele cellen. Bovendien, permeabilisatie van het cellulaire membraan om kernen vrij te geven vereist optimalisatie door trial-and-error, die tijdrovend, arbeidsintensief en financieel niet levensvatbaar kan zijn. Om de robuustheid en reproduceerbaarheid van monsterpreparaat voor hoge doorvoersequenties te verbeteren, beschrijven we een snelle enzym- en detergent-vrije kolomgebaseerde isolatiemethode op basis van kernen. Het protocol maakt een efficiënte isolatie van kernen van de hele zebravis hersenen binnen 20 minuten. De geïsoleerde kernen tonen intacte nucleaire morfologie en lage neiging tot aggregaat. Verder, flow cytometrie maakt kernen verrijking en klaring van cellulair puin voor downstream toepassing. Het protocol, dat moet werken op zachte weefsels en gekweekte cellen, biedt een eenvoudige en toegankelijke methode voor monstervoorbereiding die kan worden gebruikt voor high-throughput profiling, waardoor de stappen die nodig zijn voor succesvolle single-nuclei RNA-seq en ATAC-seq experimenten worden vereenvoudigd.

Inleiding

Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) en ATAC-seq zijn veelzijdige instrumenten om complexe biologische systemen te bestuderen op eencellige resolutie. Ze worden op grote schaal gebruikt om celsubtypes en toestanden, gennetwerken te definiëren en cellulaire heterogeniteit te beoordelen. Een voorwaarde voor het uitvoeren van scRNA-seq is de voorbereiding van een enkele cel suspensie door weefseldissociatie. Vanwege de variatie in de extracellulaire matrixsamenstelling en mechanische eigenschappen vereisen individuele weefsels optimalisatie van het dissociatieprotocol voor de voorbereiding van eencellige suspensie.

Dissociatie van weefsels in enkele cellen omvat meestal behandeling met spijsverteringsenzymen, waaronder collagenase, dispase of trypsine, bij 37 °C^1,2,3,4. Aangezien transcriptiemachines actief blijven bij 37 °C, kan enzymatische dissociatie mRNA-expressieartefacten en ruis^5,6introduceren . Met name langdurige incubatie kan stressresponsieve genen en warmteschokrespons op een niet-uniforme manier veroorzaken , wat leidt tot technische variabiliteit in het experiment⁷.

Een ander nadeel van het genereren van een eencellige suspensie is de moeilijkheid bij het verkrijgen van levensvatbare en intacte celtypes met complexe morfologieën. Met name neuronen, adipocyten en podocyten zijn een uitdaging om^8,9,10,,11te isoleren . Wu en collega's toonden bijvoorbeeld de afwezigheid van glomerulaire podocyten in scRNA-profielen van een volwassen muizennier¹². Soortgelijke niet-optimale waarnemingen zijn gedaan met betrekking tot het herstel van onderling verbonden neuronen uit hersenweefsel^8,13,14. Kortom, dissociatieprotocollen kunnen detectiebias introduceren in de richting van gemakkelijker te scheiden van celtypen, wat leidt tot een verkeerde voorstelling van de cellulaire architectuur van het orgaan.

Om de technische ruis en vooringenomenheid te overwinnen die tijdens de monstervoorbereiding in scRNA-Seq zijn geïntroduceerd, biedt isolatie en profilering de kern een aantrekkelijk alternatief. Aangezien nucleaire morfologie vergelijkbaar is tussen verschillende celtypen, omzeilt isolatie van de kernen de kwestie van het isoleren van intacte en levensvatbare cellen met complexe morfologieën. Wu en collega's demonstreerden bijvoorbeeld succesvolle profilering van glomerulaire podocyten met de single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) van een volwassen muizennier, die ontbrak in scRNA-Seq¹². Intrigerend, vergelijkende studies tussen eencellige en single-nucleus RNA-seq hebben gesuggereerd een afname van de inductie van stress en warmte-shock response genen met snRNA-Seq¹². De studies suggereren verder een hoge correlatie tussen de genen gedetecteerd door de twee methoden. Echter, een recente studie over menselijke microglia niet op te sporen genetische activering bij de ziekte van Alzheimer¹⁵. In bepaalde contexten is snRNA-Seq dus een geschikt alternatief voor scRNA-Seq^16,17. Bovendien kan de nucleaire isolatie worden gebruikt voor eencellige ATAC-Seq., het verstrekken van informatie over de regio's van open chromatine binnen individuele cellen.

Het protocol voor kernisolatie omvat drie belangrijke stappen: i) wasmiddelgebaseerde lyse van celmembraan om de kern vrij te geven; ii) weefselhomogenisatie met behulp van een Dounce homogenisator; en iii) verrijking van kernen en verwijdering van celpuin met behulp van gradiëntcentrifugatie of stroomcytometrie^{18,19,20,21,22}. Onder deze, de eerste twee stappen zijn afhankelijk van het weefsel type en moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Mild wasmiddel leidt tot gedeeltelijke breuk van het celmembraan en het inefficiënt ophalen van kernen uit het weefsel²³. Aan de andere kant leidt een hoog niveau van wasmiddel en harde homogenisatie tot breuk van het kernmembraan en hun verlies^24,25. Gescheurde kernen hebben verder de neiging om samenklonteren en vormen aggregaten, die zo niet verwijderd kan leiden tot artefacten in de downstream profilering experiment.

Om de problemen met betrekking tot wasmiddeloptimalisatie voor kernisolatie te omzeilen, introduceren we een protocol om intacte kernen te isoleren van verse monsters met behulp van een op wasmiddel- en spinkolom gebaseerde methode. Het protocol levert kernen van het hele orgaan binnen 20 minuten, het beperken van de inductie van artefactuele transcriptie. De geïsoleerde kernen kunnen worden verrijkt met FACS voor single-nuclei RNA-Seq. en ATAC-seq, waardoor een eenvoudige en universele methode is die robuuste en reproduceerbare high-throughput profiling mogelijk maakt.

Protocol

Alle onderstaande procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele (Université Libre de Bruxelles (ULB)) en nationale richtlijnen en regelgeving op het gebied van ethisch en dierenwelzijn, die door de ethische commissie voor dierenwelzijn (CEBEA) van de Université Libre de Bruxelles (protocollen 578N-579N) zijn goedgekeurd.

1. Bereiding vóór weefseldissectie

1. Bereid 0,2% Tricaine oplossing in PBS voor het euthanaseren van de zebravis. Chill de oplossing op ijs.
2. Bereid een petrischaaltje van 30 mm voor het verminken van het weefsel.
3. Bereid ijskoude 1x PBS (10 mL per weefselmonster).
4. Koel de centrifuge af tot 4 °C.
5. Voor nuclei isolatie, gebruik maken van een wasmiddel-vrije kern isolatie kit(Tabel van materialen).
6. Voordat u met het protocol begint, worden buffer A en B vóór de koeling in de kit geleverd door ze ten minste 30 minuten in het ijs te plaatsen voordat ze zijn geïsoleerd.
7. Voor het hanteren van de geïsoleerde kernen, coat de plastic reagentia zoals buizen en pipet tips met 5% BSA oplossing. Bereid hiervoor de oplossing voor door 2 g BSA op te lossen in 40 mL PBS. Het coaten van kunststof items met 5% BSA vermindert kernen plakken aan plastic. Deze stap verbetert het herstel van geïsoleerde kernen.
8. Coat de pipet tips door pipetting 5% BSA oplossing 2-3 keer. Luchtdroog de uiteinden gedurende 2 uur. Bereid 10 kunststoftips per monster voor.
9. Bedek de buizen voor het verzamelen van kernen door ze te vullen met 5% BSA. Keer de buizen 3 keer om om een efficiënte coating te garanderen. Verwijder de oplossing en droog de buizen ondersteboven op een schoon tissue papier voor 2 uur. Coat per monster één opvangbuis in de kit. Bovendien, bereid gecoate 1,5 mL buizen voor kernen collectie na FACS.
   LET OP: Glazen tips zijn een aanrader voor de plastic pipettips om het plakken te minimaliseren.

2. Dissectie van zebravissen hersenen

1. Voor het euthanaseren van de zebravis, bereiden een 90 mm petrischaal met 25 mL van ijskoude Tricaine oplossing.
2. Haal voorzichtig de zebravis uit de tank met een visnet en plaats deze in de petrischaal.
3. Euthanaseer de vis door het 5 minuten in Tricaine achter te laten.
4. Onthoofd het dier met een scherp scheermesje.
5. Met behulp van tangen, voorzichtig breken de schedel en verwijder zachte weefsels, huid en botten van ventrale en dorsale kant van de schedel.
6. Breng de hersenen voorzichtig over in een verse schaal van 30 mm met ijskoude PBS.
7. Hak de hersenen in kleine stukjes met behulp van een scheermesje om het laden van het monster op de spin kolom te verlichten.

3. Isolatie van enkele kernen

1. Breng het gehakte weefsel over op de filtercartridge in de isolatiekit van de kernen en voeg 200 μL koude buffer A toe om het weefsel te sensibiliseren. Maal het weefsel met behulp van de plastic staaf die door de kit voor 2 min.
2. Voeg 300 μL koude buffer A toe en broed de filtercartridge op ijs met dop 10 min open.
3. Dop de cartridge af en verleg het weefsel door de buis 5 keer om te keren.
4. Centrifuge op 16.000 x g voor 30 s. In deze stap worden cellen gescheurd bij het passeren van het filter en wordt de centrifugale kracht met hoge snelheid toegepast. De stroom door bevat intacte kernen, die pellet aan de onderkant van de buis.
5. Gooi het filter weg en verleg de pellet door 10 s krachtig te wervelen.
6. Pellet de kernen door centrifugeren de oplossing op 500 x g gedurende 3 min. Gooi de supernatant zorgvuldig als de kernen pellet is kleurloos.
7. Resuspend de pellet in 0,8 mL koude buffer B en centrifuge op 600 x g gedurende 10 min. In deze stap worden kernen gescheiden van membraanrest. De kleurloze pellet verkregen bevat geïsoleerde kernen.
8. Resuspend de geïsoleerde kernen in 500 μL PBS met 5% BSA. Houd de kernenusopening op ijs om FACS uit te voeren na de kwantificering.

4. Visualisatie van kernmorfiologie

1. Bevestig nucleaire morfologie door Hoechst kleuring. Verwijder hiervoor 100 μL enkele kernenveer in een nieuwe buis met bsa-gecoate tips. Om de kernen te bevlekken, voegt u 0,1 μL Hoechst (1 mg/mL) toe. Voorzichtig vortex de buis.
2. Breng de kernpensie over op glazen bodemschotel voor beeldvorming.
3. Beeld de kernen met behulp van een fluorescentie microscoop met laser excitatie instellingen van ~ 405 nm (Violet) golflengte.

5. FACS gebaseerde verrijking van kernen

1. Voordat u FACS uitvoert, filtert u de kernen met een 40 μm celzeef in de met BSA gecoate buis.
2. Verdun de gefilterde suspensie door PBS met 5% BSA toe te voegen aan een eindvolume van 1.000 μL.
3. Label twee ronde FACS buis aan de onderkant als 'control' en 'gekleurd'. De 'control' buis zal niet-gekleurde kernen bevatten, terwijl de 'gekleurde' buis hoechst gekleurde kernen zal hebben.
4. Breng 250 μL van de kernenveersie in de 'controle'-buis met behulp van BSA gecoate pipetpunt.
5. Breng de resterende 750 μL-oplossing over op facs-buis met het label 'gekleurd' en voeg 1 μL Hoechst-kleurstof toe om de kernen te bevlekken. Meng door langzame vortexen.
6. Laad het niet-bevlekte besturingselementmonster op celsorteerder. Record 5000 evenementen.
7. Laad de gekleurde monsters en neem 5000 gebeurtenissen op.
8. Teken FACS-poorten die identificatie van enkele kernen mogelijk maken. Kernen kunnen worden geselecteerd door het Hoechst fluorescentiesignaal te vergelijken tussen controle en gekleurd monster.
9. Sorteer Hoechst-positieve kernen van de gekleurde buis in nieuwe 1,5 mL buis met 50 μL PBS met 5% BSA.
   OPMERKING: Geïsoleerde kernen kunnen worden verzameld in een gewenst medium volgens de vereisten van de downstream-toepassing.

Resultaten

--Het hierboven beschreven protocol werd gebruikt om enkele kernsussuspensie rechtstreeks te genereren van zebravis hersenweefsel. De isolatie vereist meestal 20 minuten en vermijd het gebruik van wasmiddel of spijsverteringsenzym. Een schematische samenvatting van de afzonderlijke stappen van het protocol is opgenomen in figuur 1, die kan worden afgedrukt om te worden gebruikt voor begeleiding.

Figuur 1: Schematisch van wasmiddelvrije spin-kolomgebaseerde methode voor kernisolatie.
Grafische weergave van de individuele stappen uitgevoerd tijdens de extractie van kernen uit verse zebravis hersenweefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Visualisatie van nucleaire morfologie

Voor kwalitatieve bevestiging van de nucleaire morfologie werden de geïsoleerde kernen bevlekt met Hoechst en gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. De kernen verschenen intact, rond en goed gescheiden (figuur 2). Belangrijk is dat nucleaire aggregatie, een teken van nucleaire membraanbreuk, afwezig was.

Figuur 2: Enkele kernen isolatie van zebravis hersenen.
Fluorescentie microscopie beeld van Hoechst-gekleurde kernen tonen hun intacte morfologie. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

FACS-gebaseerde verrijking van de intacte kernen

Verrijking van geïsoleerde kernen en verwijdering van cellulair puin werd uitgevoerd door stroomcytometrie door gating op de aanwezigheid van een Hoechst fluorescentiesignaal. Het Hoechst signaal werd gedetecteerd bij opwinding met violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Niet-gekleurde kernen vertoonden achtergrondfluorescentie (figuur 3A, aanvullende figuur 1A), terwijl gekleurde kernen een sterk fluorescerend signaal vertoonden ( figuur3B, aanvullende figuur 1B). Zoals geïllustreerd in figuur 3C, de onbevlekte en Hoechst gekleurde kernen waren goed gescheiden in het violette kanaal.

Figuur 3: Geïsoleerde kernen tonen een sterk en specifiek Hoechst fluorescerend signaal in flow cytometrie.
Histogram plots voor enkele kernen schorsing weergeven van de verdeling van Hoechst kleuring. Hoechst is enthousiast over violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Het niet-gekleurde monster(A) geeft een signaal weer in het bereik van 10⁰-10^3,terwijl de in Hoechst gekleurde kernen(B)signaal afgeven in het bereik van 10³-10^5. Een overlay van fluorescentieintensiteit die wordt uitgestoten door niet-gekleurde (grijs) en gekleurde (blauwe) monsters(C)toont een duidelijke scheiding aan tussen de twee populaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Flow cytometrie gating strategie voor geïsoleerde kernen. Representatieve stroompercelen voor geïsoleerde kernenschorsing. Geïsoleerde kernen werden geanalyseerd met behulp van voorwaartse scatter en Violet laser BV421 die Hoechst opwindt op 405 nm. Het onbevlekte monster(A)vertoonde bv421-signaal in het bereik van^{10 0-10 3.} Van de 13130 gebeurtenissen werden 141 gebeurtenissen gedetecteerd als enkele kernen op basis van FSC-A (1,07% van totaal) en 0 gebeurtenissen voor niet-gekleurde kernen op basis van BV421-signaal (0% van het totaal). De Hoechst gekleurde kernen (B) weergegeven BV421 signaal in de 10³-10⁵ bereik. Van de 50000 gebeurtenissen werden 2418 gebeurtenissen gedetecteerd als enkele kernen op basis van FSC-A (4,84% van het totaal) en 2414 gebeurtenissen voor Hoechst-positieve kernen op basis van BV421 signaal (4,83% van het totaal). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Discussie

Profilering van de transcriptoom en epigenoom op een eencellige resolutie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van biologische systemen. Studies bij de resolutie van een enkele cel voor een vast weefsel zijn afhankelijk van de dissociatie van het orgaan in individuele cellen of kernen. Dissociatie is een destructieve procedure die technische artefacten kan introduceren, die de ontwikkeling van een nauwkeurige weergave van het systeem^5,6kunnen voorkomen . Enzymatische dissociatie kan bijvoorbeeld cellen met complexe morfologieën schaden, zoals neuronen of podocyten, en kan expressie van stress en warmteschokreactiegenen^{veroorzaken 7,12}. Bovendien kan het gebruik van wasmiddel tijdens dissociatie het nucleaire membraan scheuren en leiden tot aggregatie^23,25. Het optimaliseren van de dissociatie voor het verkrijgen van een enkele cel of kernensuspensie van de hoogste kwaliteit is dus van het grootste belang voor het succes van high-throughput profiling experimenten.

Hier demonstreren we een wasmiddel- en enzymvrije nuclei-isolatiemethode die extractie van intacte kernen uit zebravissen hersenen in minder dan 20 minuten mogelijk maakt. Het protocol levert kernen op met typische morfologie en robuuste integriteit(figuur 2). Van een enkele zebravis hersenen met een gewicht van 6 mg, het protocol levert een totaal van 60.000 kernen bepaald door een hemocytometer tellen. De geïsoleerde kernen kunnen worden gebruikt voor meerdere downstream toepassingen, waaronder snRNA-seq, ATAC-seq en immunostaining. De geïsoleerde kernen kunnen kruisbesmetting van cytoplasmische breuken omvatten, met name van componenten van endoplasmisch reticulum en mitochondriën. Voor high-throughput profilering experimenten, speling van cellulair puin, met name mitochondriën, wordt sterk aanbevolen. Flow cytometrie(figuur 3) biedt een haalbare optie voor de zuivering van kernen. Als alternatief kan de sacharosegradiënt ook worden gebruikt voor het verwijderen van puin.

Het protocol is getest op de schildklier van de muis (gegevens niet getoond) en biedt resultaten vergelijkbaar met zebravis hersenweefsel. Over het geheel genomen biedt het protocol een robuuste, reproduceerbare en universele methode voor de voorbereiding van enkele nucleus-ophanging, waardoor de logistiek voor high-throughput profiling-experimenten wordt vereenvoudigd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovine serum albumin (BSA)	Carl Roth	90604-29-8	Albumine fractie V
Cell sorter	BD Biosciences		FACSAria III
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Eppendorf buisjes (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Corning	352096	Polypropyleen centrifugebuisjes
Falcon (5 mL )	Corning	352052	Polystyreen rondbodem testbuisjes
Fijne pincetten	Fine Science Tools	11295-10
Flowmi cel zeef (40 μm)	Sigma	BAH136800040
Fluorescentiemicroscoop	Leica	DMI6000 B
Glazen fles (250 mL)	VWR	215-1593
Glazen bodem schaal	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Glazen Pasteur pipetten	VWR	612-1701
Glazen pipetsteun	Carl Roth	388.1	Pipetteerhulp pi-pomp 2500
Hoechst kleuringsoplossing	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit	Invent Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
Petrischaal (30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
Petrischaal (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Pipettips	VWR	89079	10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipetten	Gilson	F167380	Pipetman
Vleesmesje	Swann-Morton	7981809
Tricaine methaansulfonaat	Sigma	E10521
Vortex machine	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2