Methodenartikel

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

DOI:

10.3791/61491

⸱

14 juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 3Human Visual Function Core, National Eye Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het retinale pigment epitheel (RPE) is een gespecialiseerde monolaag van cellen strategisch gelegen tussen het netvlies en de choriocapillaris die de algehele gezondheid en structurele integriteit van de fotoreceptoren te behouden. De RPE is gepolariseerd, vertoont apically en basaal gelegen receptoren of kanalen, en voert vectoraal transport van water, ionen, metabolieten, en scheidt verschillende cytokinen.

In vivo kunnen niet-invasieve metingen van de RPE-functie worden uitgevoerd met behulp van direct-coupled ERG's (DC-ERG's). De methodologie achter de DC-ERG werd gepionierd door Marmorstein, Peachey, en collega's met behulp van een op maat gebouwd stimulatie opnamesysteem en later aangetoond met behulp van een commercieel beschikbaar systeem. De DC-ERG techniek maakt gebruik van glazen haarvaten gevuld met Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) om de tragere elektrische reacties van de RPE te meten die ontlokt worden van lichtopgevraagde concentratieveranderingen in de subretinale ruimte als gevolg van fotoreceptoractiviteit. De langdurige lichte stimulus en lengte van de DC-ERG opname maken het kwetsbaar voor drift en ruis wat resulteert in een lage opbrengst van bruikbare opnames. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare methode voor het verbeteren van de stabiliteit van de opnames, terwijl het verminderen van ruis met behulp van vacuümdruk te verminderen / te elimineren bellen die voortvloeien uit outgassing van de HBSS en elektrode houder. Bovendien, power line artefacten worden verzwakt met behulp van een spanningsregelaar / power conditioner. We bevatten de nodige lichtstimulatieprotocollen voor een commercieel beschikbaar ERG-systeem en scripts voor analyse van de DC-ERG-componenten: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. Vanwege het verbeterde gemak van opnames en snelle analyse workflow, dit vereenvoudigde protocol is vooral nuttig bij het meten van leeftijdsgebonden veranderingen in RPE functie, ziekte progressie, en bij de beoordeling van farmacologische interventie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het retinale pigment epitheel (RPE) is een monolaag van gespecialiseerde cellen die het achterste segment van het oog lijn en kritische functies uit te oefenen om retinale homeostase1te behouden. De RPE ondersteunt fotoreceptoren door hun foton-vastleggen visuele pigment in een proces genaamd de visuele cyclus2, door deel te nemen aan de dagelfcytose van schuur buitenste segment tips3, en in het vervoer van voedingsstoffen en metabole producten tussen fotoreceptoren en de chocaprioillaris4,5. Afwijkingen in RPE functie liggen ten grondslag aan tal van menselijke retinale ziekten, zoals leeftijdsgebonden macula degeneratie6, Leber's aangeboren amaurosis7,8 en Beste vitelliform macula dystrofie9. Aangezien donoroogweefsels vaak moeilijk te verkrijgen zijn uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden, kunnen diermodellen met genetische modificaties een alternatieve manier bieden om de ontwikkeling van netvliesziekten te bestuderen10,11. Bovendien, de opkomst en toepassing van CRISPR cas9-technologie maakt nu genomische introducties (knock-in) of schrappingen (knock-out) mogelijk in een eenvoudig proces in één stap dat de beperkingen van eerdere gentargetingtechnologieën overtreft12. De hausse in de beschikbaarheid van nieuwe muismodellen13 vereist een efficiënter opnameprotocol om de RPE-functie niet-invasief te evalueren.

Meting van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de RPE kan worden bereikt met behulp van een direct-gekoppelde elektroretinogram (DC-ERG) techniek. Bij gebruik in combinatie met conventionele ERG-opnames die de fotoreceptor (a-wave) en bipolaire (b-wave) celreacties14meten, kan de DC-ERG definiëren hoe de responseigenschappen van de RPE veranderen met retinale degeneratie15,16,17 of dat RPE-disfunctie voorafgaat aan fotoreceptorverlies. Dit protocol beschrijft een methode aangepast aan het werk van Marmorstein, Peachey, en collega's die voor het eerst ontwikkelde de DC-ERG techniek16,18,19,20 en verbetert de reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak.

De DC-ERG opname is moeilijk uit te voeren vanwege de lange aanschaftijd (9 min) waarin elke onderbreking of introductie van ruis de interpretatie van de gegevens kan bemoeilijken. Het voordeel van deze nieuwe methode is dat de basislijnen binnen een kortere tijd stabiel bereik bereiken, waardoor de kans dat het dier voortijdig ontwaakt uit anesthesie vermindert en minder gevoelig is voor bellenvorming in de capillaire elektroden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging die zijn beschreven in het dierproevenprotocol dat is goedgekeurd door het Comité Dierverzorging en Gebruik van het Nationaal Ooginstituut.

1. Het invoeren van lichtstimulatieprotocollen voor DC-ERG

OPMERKING: Volg de onderstaande aanwijzingen om de lichtstimulatieprotocollen voor de DC-ERG te importeren in de ERG-systeemsoftware(Tabel van materialen). Het protocol bestaat uit een interval van 0,5 min voor de stimulus, gevolgd door een stap licht (10 cd/m2) gedurende 7 minuten en eindigt met een interval van 1,5 min na de stimulus. De lichtintensiteit van 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) werd geselecteerd omdat het ongeveer de helft van de maximale respons oproept voor alle componenten van de DC-ERG in WT-muizen18,21. De c-wave en snelle oscillatie zijn van bijzonder belang omdat de oorsprong van deze elektrische reacties goed worden gekarakteriseerd en verder geïsoleerd en bestudeerd kan worden in vitro RPE-modellen (bijvoorbeeld iPSC-RPE). De toepassing van andere lichtintensiteiten kan extra informatie extraheren, bijvoorbeeld, de off response ondergaat een omkering van polariteit bij helderder licht stimuli en kan verschillen vertonen bij de intensiteit waarop deze omkering plaatsvindt. De gebruiker is vrij om de instellingen van de lichtintensiteit naar eigen inzicht te wijzigen.

  1. Open de ERG-systeemsoftware.
  2. Klik op Database Center.
  3. Klik op Nieuw (geef een nieuwe databasebestandsnaam op). Klik op Opslaan. In het pop-upvak wordt weergegeven: 'Database gemaakt, wilt u verbinding maken met het nieuwe databasebestand.' Klik op Ja. De huidige databasenaam moet nu de nieuwe bestandsnaam weergeven.
  4. Klik op Inzetten in het venster Database Control Center.
  5. Selecteer Aanvullend Bestand 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Klik op Openen.
  6. Klik op Sluiten (Database Control Center) na voltooiing van de voortgangsbalk.
  7. Klik op de groene startknop.
  8. Klik op Nieuw in het venster Patiënt selecteren. Maak een nieuwe naam van de patiëntfamilie die het muismodel beschrijft, voer de geboortedatum in (DOB, mm/dd/yy), schakel de knop geslacht (M/V) in op de juiste beschrijving. Klik op Sluiten om de experimentele details op te slaan.
  9. Klik op Protocollen. De donker-aangepaste ERG en DC-ERG protocollen moeten nu zichtbaar zijn.
  10. Tot slot plaatst u het bestand Long Flash.col in de volgende map C:\ERG-gebruikersbestanden\Lange Flash.col.

2. Capillaire elektrodepreparaat

  1. Snijd de 1,5 mm glazen haarvaten doormidden door middel van een keramische tegel(Tabel van materialen) om het glas te scoren en breek ze netjes met behulp van een tafel om fysieke tegenkracht te bieden en om het glas te stabiliseren.
    LET OP: Stomp de snede eindigt als dat nodig is.
  2. Met behulp van een Bunsen brander (Tabel van materialen) laat de warmte om een kleine bocht te maken in de capillaire terwijl het bedrijf over de vlam met tangen.

3. Vullen van capillaire elektroden

  1. Sluit de vacuümdesiccator aan op de vacuümlijn van het laboratorium via een in-line filter(Tabel van materialen).
  2. Giet 30 mL van Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Tabel van materialen) in een open 50 mL conische buis en plaats deze (met de dop verwijderd) in de vacuümkamer.
  3. Zet het vacuüm aan en ontgt de HBSS terwijl u de computer en de opnameapparatuur inschakelt.
  4. Na 5\u201210 min zet u het vacuüm uit en gebruikt u de ontgassde HBSS om een 12 mL spuit te vullen door een bijgevoegde 25 G naald. Gebruik het om de basissen van de elektrodehouders te vullen die extra voorzorgsmaatregelen nemen om geen bellen te introduceren.
    1. Verwijder hiervoor de schroefdop met schroefdraad en schuif de spuitnaald voorzichtig door de siliconen rubberen pakking om de achterwand (zilver/zilverchloridepelel) van de houder te bereiken.
      OPMERKING: De zilver/zilverchloridepellets zijn voordelig ten opzichte van houders die zilverdraad gebruiken omdat ze meer oppervlakte bieden, wat resulteert in een stabiele geluidsarme basislijn. Echter, zilver / zilver chloride pellets vereisen een vloeibare interface vrij van luchtbellen om een goede verbinding te bereiken. Zorg er daarom voor dat u tijdens dit proces geen luchtbellen introduceert.
    2. Geleidelijk injecteren HBSS om de gehele micro-elektrodrode te vullen, terwijl langzaam intrekken van de spuitnaald. Sluit de schroefdraaddop opnieuw vast, maar draai niet aan. Plaats de spuitnaald opnieuw om de lege ruimte in de dop te vullen met HBSS. Vul vervolgens de glazen capillaire terwijl het horizontaal om te voorkomen dat de oplossing ontsnappen uit het andere uiteinde.
    3. Houd de glazen capillaire van het gebogen uiteinde en steek langzaam het tegenovergestelde uiteinde door de losgemaakte dop en draai de schroefdop op zijn plaats.
      OPMERKING: Glazen elektroden gevuld met HBSS handhaven smering van het oog van de muis en voorkomen dat hoornvlies uitdroging die zou optreden bij het gebruik van standaard gouden lus elektroden.
  5. Plaats de elektrodehouders met de capillaire elektroden naar boven gekanteld om bellen naar boven te laten stromen. Voer het vacuüm voor 5\u201210 min op ontgassen. Gas dat ontsnapt uit de glas- en kunststofoppervlakken zal HBSS uit de elektrodehouders duwen.
  6. Stop en laat het vacuüm langzaam los. Vul de elektrodehouders en glasvattillaries zoals eerder beschreven.
    OPMERKING: Bubbels hebben de neiging om te verzamelen op of in de buurt van de siliconen rubberpakking en kan ook verbergen in de groeven van de schroefdraad dop, dus speciale aandacht moet worden besteed aan deze gebieden bubble-free te houden.
  7. Installeer en bevestig de micro-elektrodenhouder in de op maat gemaakte T-clip/Magnetic ball joint stand(Figuur 1A, inzet). Wijzig een T-clip (5/16"-11/32" OD Tubing) #8doorde zwarte polyacetale clips aan één kant te verwijderen door de zwarte polyacetale clips te verwijderen. Laat de cilinderbasis van de magnetische kogelgewrichten in tweeën werken om de hoogte(Tabel van materialen)aan te passen. Zet de gemodificeerde T-clips vast aan de magnetische kogelmontageschroeven met M3-formaat moeren.
  8. Plaats de micro-elektrodenhouder in de gewijzigde T-clip en houd deze stevig op zijn plaats door in ongeveer een 1-inch taps toelopende houten handvat te schuiven gemaakt van het breken van een katoenen kip reinigingsstok(Tabel van materialen)onder een hoek. Gebruik de zeldzame aardmagneetcilinderbasis om de aangepaste elektrodehouder stevig op de metalen plaat van het podium te plaatsen, waardoor 360° rotatie op een 180° as mogelijk is.

4. Testelektroden

  1. Giet HBSS in een kleine container (bijvoorbeeld de dop van de 50 mL conische buis).
  2. Laat de volledig gemonteerde, met HBSS gevulde capillaire micro-elektroden voorzichtig in de dop met HBSS zakken om de elektroden vooraf te equiliberen en plaats de naaldgrondelektrode (staart/achterbeen) en de Ag/AgCl gesinterde pelletreferentie (mond) in dezelfde HBSS om het circuit te voltooien (Figuur 1A).
    OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder zwak rood licht. Gebruik een roodlichtzaklamp om de muis en capillaire elektroden te positioneren. Vergeet niet om alle lichtbronnen volledig uit te schakelen voordat u met de opname begint.
  3. Selecteer of maak een geschikte id (familienaam) om de te testen muis te beschrijven en selecteer het DC-ERG-protocol dat moet worden uitgevoerd door de registratie volgens de volgende volgorde in te vullen.
    1. Klik op Protocollen. Selecteer DC-ERG. Klik op Uitvoeren. Er verschijnt een dialoogvenster: "Current patient is XXX [DOB: XX/XX/XX) Is dit correct voor de test die wordt uitgevoerd?" Klik op Ja. Ga dan naar 'Stap 1/6'.
  4. Sluit de deuren naar de kooi van Faraday.
  5. Geef de impedantiemodus weer door op Impedantie te klikken en te controleren of de waarden voor de mondverwijzing, de staartgrond en de registratie van elektroden aanvaardbaar zijn (zie figuur 1B).
  6. Test de stabiliteit van de basislijn (ruis en drift) door op Stap (pijl-voorwaarts) te klikken om Stap 4/6 'Long Flash No Light' te selecteren.
    OPMERKING: De hoeveelheid drift die wordt waargenomen wanneer de elektroden in het HBSS-bad worden geplaatst, is over het algemeen minder dan 500 μV per 80 s zodra ze gestabiliseerd zijn en is gelijk aan de drift die wordt waargenomen wanneer de elektroden op de muis zijn aangesloten. Zo zijn de elektrische uitlezing van de elektroden in het HBSS-bad een belangrijke indicator voor de status van de elektroden. Het geluid, gemeten als piek-to-peak, is over het algemeen ~ 10\u201215% groter in de muis dan in het HBSS-bad. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de toevoeging van beweging artefacten uit de ademhaling.
  7. Begin met het bekijken van de sporen door op Voorbeeldte klikken. De sporen moeten weinig ruis hebben met een piek-tot-piek amplitude <200 μV. Een lichte afwijking (<500 μV/80 s) die geleidelijk vervaagt naar de basislijn is aanvaardbaar(figuur 1C).

5. Muis- en elektrodepositionering

  1. Houd de muizen 's nachts in een goed geventileerde lichtdichte doos voor donkere aanpassing.
  2. Verdoven de dieren door intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (8 mg/kg).
  3. Breng een daling van 0,5% proparacaïne HCl actueel aan om het hoornvlies te verdoven, evenals een daling van 2,5% fenylephrine HCl en 0,5% tropicamide om de leerlingen te verwijden.
  4. Trim de muis snorharen met een schaar om te voorkomen dat onbedoeld trillen van het verstoren van de glazen capillaire elektroden tijdens de opname.
    OPMERKING: Het DC-ERG stimulusprotocol binnen het ERG-systeem heeft verschillende ingebouwde stimulusroutines die kunnen worden geselecteerd door op de Stap (pijl naar voren) of Stap (pijl naar achteren) te klikken. Alleen stappen 1, 4 en 5 in de software zijn vereist om de DC-ERG-opname voor te bereiden en uit te voeren.
  5. Controleer in het ERG-systeem software of de juiste patiënt is geselecteerd. Klik op de groene protocollenknop. Selecteer DC-ERG onder Protocolbeschrijving. Klik vervolgens op Uitvoeren. Controleer of dit de juiste test is die wordt uitgevoerd door op Jate klikken.
  6. Gebruik Stap 1/6 aangewezen Roodlicht stimulus om het rode licht in de koepel in te schakelen om de muis en elektroden te helpen plaatsen terwijl de veranderingen in impedantie worden waargenomen.
  7. Plaats de muis op een verwarmde opnametafel en zet de huid van het achterbeen voorzichtig in de gaten met tangen. Houd de naaldelektrode stevig in één hand en steek deze onderhuids in het achterbeen om deze op zijn plaats te zetten.
  8. Plaats de referentie Ag/AgCl elektrode(Tabel van materialen) in de mond, zodat de gesinterde pellet rust langs de rug wang en wordt gehouden op zijn plaats achter de tanden.
    OPMERKING: Gouden draadelektroden mogen niet worden gebruikt als de mondreferentieelektrode omdat ze verschillende impedantiekenmerken hebben en het piek-tot-piekgeluid verhogen.
  9. Voordat u de haardige elektroden op het oog van de muis plaatst, houdt u de elektrodehouder met de glazen haarvaten verticaal, veegt u met de wijsvinger met de wijsvinger om eventuele bellen te verwijderen die mogelijk zijn geïntroduceerd. Vul de tip met HBSS met behulp van een 25 G naald bevestigd aan een spuit en inspecteren om ervoor te zorgen dat er geen luchtbel gevangen aan de tip. Plaats de elektrodehouderstandaard zodat de open punt van de met HBSS gevulde haarvaten in contact komt met het hoornvlies.
  10. Gebruik speciale voorzorgsmaatregelen om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd door de glijmiddelooggeldispenser te houden en de eerste druppels weg te gooien. Plaats een druppel glijmiddel ooggel op elk oog om de geleidbaarheid te behouden en uitdroging tijdens de opname te voorkomen.

6. DC-ERG opname

  1. Klik op Stap (pijl-vooruit) om Stap 4/6 'Lange Flash No Li' te selecteren.
  2. Klik op Impedance. Gebruik het impedancecontrolescherm om de weerstanden van de linker- en rechterogen te onderzoeken. De impedantiewaarden voor de opnameelektroden aan elk oog zullen naar verwachting vergelijkbaar zijn (~39 kΩ). De impedantiewaarden voor zowel de grond- als de referentieelektroden zullen naar verwachting minder dan 10 kΩ bedragen).
  3. Klik op Voorbeeld om de sporen voor het linker- en rechteroog te bekijken. Wacht tot er een stabiele basislijn is bereikt (<10 min). Klik op Stoppen om de trace preview af te sluiten.
    OPMERKING: Abrupte veranderingen in driftrichting of afwijkend geluid in de opname zullen niet met de tijd verbeteren en vereisen het identificeren van de capillaire elektrode die aandacht vereist. De meest waarschijnlijke oorzaak is een bel geïntroduceerd op het puntje van de elektrode. Vul de tip bij met HBSS. Klik nogmaals op Voorbeeld om de basislijn te controleren.
  4. Klik op Stap (pijl-vooruit) om Stap 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min" te selecteren.
  5. Klik op Uitvoeren om de opname te starten(figuur 1D).

7. Gegevensexport

  1. Selecteer de 'Patiënt' (Familienaam) waarin de muisopname wordt beschreven die moet worden geëxporteerd.
  2. Klik op Oude tests.
  3. Selecteer DC-ERGonder Protocolbeschrijving . Klik op de groene knop Laden om de eerder verkregen gegevens te laden.
  4. Klik op Stap (pijl-voorwaarts) om door te gaan naar Stap 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
  5. Klik op Exporteren.
  6. Geef de bestandsnaam op (bijvoorbeeld bestandsnaam.csv). Een geldige bestandsnaam moet beginnen met een letter, gevolgd door letters, cijfers of underscores. Gebruik geen speciale tekens of koppeltekens. Het data-analyseprogramma (DCERG_Analysis.exe) vereist dat tabelgegevens voldoen aan de vereisten voor variabele namen.
  7. Plaats een vinkje naast gegevenstabel. Selecteer naast scheidingsteken deoptie Tab . Plaats vinkjes naast Opties(Titels, Verticaal), Alle(Stappen, Chans, Resultaten),Gegevenskolommen (Inhoud, Resultaten, Vegen) en Opmaak(Bestand).
  8. Klik vervolgens op Exporteren (Figuur 1E). Hiermee wordt het bestand *.csv opgeslagen in de map C:\Multifocal.

8. Gegevensanalyse

  1. Download en installeer de juiste runtime installer(Tabel van materialen)
  2. Download en installeer de DCERG_Analysis.exe installer.
    OPMERKING: Hiermee wordt het script geïnstalleerd waarmee de analyse van de DC-ERG-componenten wordt uitgevoerd en wordt een snelkoppeling gemaakt om het programma uit te voeren in de map Startmenu.
  3. Klik op de sneltoets die is gemaakt in het menu Start > Programma's.
  4. Selecteer het geëxporteerde gegevensbestand of de geëxporteerde bestanden (*.csv) voor analyse. Klik ctrl +links op de muis om meer dan één bestand te selecteren.
    OPMERKING: Het uitvoerbare bestand genereert twee soorten plots: 1) de ruwe gegevens worden uitgezet met een best passende lijn die de gemeten afwijking aangeeft; 2) de drift gecorrigeerd reactie wordt uitgezet na te zijn gladgestreken met een voortschrijdend gemiddelde (met een spanwijdte van ~ 5 s). Vanuit deze plot worden de amplitudes en time-to-peak van de DC-ERG componenten geïdentificeerd: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd in tabelindeling om uit te blinken waar elk blad overeenkomt met een andere muisopname. Deze bladen worden gevolgd door twee overzichtsbladen: i) gecompileerde DC-ERG amplitudes (mV); ii) gecompileerde DC-ERG time-to-peaks (licht begin, t = 0 min).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 is een voorbeeldgegevensset van miR-204 ko/ko cre/+ (voorwaardelijke KO) en wild type (WT) muizen. MiR-204 ko/ko cre/+ zijn muizen met een voorwaardelijke knock-out van microRNA 204 in het retinale pigment epitheel. Deze muizen worden gegenereerd door het kruisen van floxed miR-204 muizen (geproduceerd door NEIGEF)22 met VMD2-CRE muizen23. MiR-204 wordt sterk uitgedrukt in de RPE waar het regelt de expressie van eiwitten die cruciaal z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen

Een goede DC-ERG opname vereist stabiele elektroden die vrij zijn van bellen die artefacten en ongewenste drift te creëren als ze zijn zeer gevoelig voor outgassing en temperatuurveranderingen. Het is essentieel dat een stabiele basislijn wordt bereikt wanneer de elektroden in de HBSS-badoplossing worden geplaatst voordat u verder gaat met de muisopname. Kleine belletjes hebben de neiging om te verzamelen aan de basis van de capillaire elektrode of rond de sil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door nei intramurale fondsen. De auteurs erkennen oprecht Dr. Sheldon Miller voor zijn wetenschappelijke begeleiding, technisch advies, en deskundigheid in fysiologie RPE en ziekte. De auteurs bedanken Megan Kopera en de dierenverzorging personeel voor het beheer van de muis kolonies, en Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, en Yuan Wang voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ag/AgCl (mond) ElektrodeWPI IncEP1Mondreferentie-elektrode voor muis
Keramisch tegelSutter InstrumentCTSWordt gebruikt om de glazen capillaire buis op een geschikte maat te snijden
SchuimwipstokjePuritan Medical Products867-WC Geen lijmTe gebruiken als afstandhouder om de pasvorm van de elektrodehoudersamenstelling te verbeteren
Elektroretinogram (ERG) SysteemDiagnosys LLCE3 SysteemVisueel elektrofysiologisch systeem om oogheelkundige aandoeningen te diagnosticeren in visuele onderzoeken en geneesmiddelenproeven
BunsenbranderArgos TechnologiesBW20002460Of equivalent om glas onder vlam te vormen
Glazen capillaire buis (1,5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75Voor het vullen met HBSS en om contact te maken met het hoornvlies
Hank’s gebufferde zoutoplossing (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercieel verkrijgbaar. Bewaar bij kamertemperatuur
Inline FilterWhatman6722-5001Om de vacuümpomp te beschermen tegen aërosol
Lage-ruis kabel voor micro-elektrodehoudersWPI Inc5372Aangeraden voor het verbeteren van de lengte en plaatsing van de kabels en elektrodehoudersamenstellingen
MagneetbalgewrichtWPI Inc500871Voor het magnetisch positioneren van de elektrodehoudersamenstelling op het podium
MatLabMathworksMatLab: Voor het bewerken van de analysesoftware
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox voor MatLab (alleen vereist voor het bewerken van de analysesoftware)
MatLab CompilerMathworksToolbox voor MatLab (alleen vereist voor het bewerken en opnieuw vrijgeven van de analysesoftware)
MatLab Runtime versie 9.5MathworksR2018b (9.5)Vereist om de analysesoftware te draaien: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Micro-elektrodehouders (45 graden)WPI IncMEH345-15Voor het vasthouden van de capillairen
Naald (25 ga)Covidien8881250313Voor het vullen van de capillaire buizen met HBSS
Naald (aard) ElektrodeRhythmlink13mm - één elektrodeSubdermale naaldelektrode (aard) voor muis (13mm lang, 0,4mm diameter naald, 1,5m draad)
Regelaar/stroomvoorwaardeFurmanP-1800Of equivalent om DC-offset van ruis te verwijderen die door de stroomlijn wordt geïntroduceerd
Spuit (12 mL)Monoject1181200777Voor het vullen van de capillaire buizen met HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20Voor elektrodehoudersamenstelling
VacuumdesiccatorBel-Art420120000Duidelijke polycarbonaatbodem & deksel
Farmacologische behandeling
Smeermiddel ooggelAlcon0078-0429-47Helpt bij het smeren van het hoornvliesoppervlak en het handhaven van elektrische contact met capillaire elektroden
Fenylephrine Hydrochloride 2,5%Akorn17478-201-15Korte mydriatic oogdruppels (voor pupilverwijding)
Proparacaine Hydrochloride 0,5%Akorn17478-263-12Lokaal anestheticum voor oogdruppels
Tropicamide 0,5%Akorn17478-101-12Korte mydriatic oogdruppels (voor pupilverwijding)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgeticum en spierverslapper
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anestheticum voor intramusculaire injecties

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568(2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651(2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Direct gekoppeld ERGRPE functie bij muizenlichtopgewekte responsenpreparatie van capillaire elektrodenmet HBSS gevulde capillairentesten van electrode impedantiefotoreceptoractiviteitc golfanalyseleeftijdsgerelateerde RPE veranderingen

Gerelateerde artikelen