Dit protocol beschrijft de constructie van een goedkoop micro-injecttiesysteem, de stereotaxische implantatie in diepe hersenstructuren en de procedure voor getimede micro-injecties van tetrodotoxine bij wakkere en ongeremde ratten. Het doel is om de deelname van hypothalamische structuren aan de regulatie van de ovulatie te onthullen door hun neurale activiteit te remmen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontrafeling van de rol van discrete gebieden van het rattenbrein in de regulatie van ovulatie door omkeerbare inactivatie door tetrodotoxine micro-injecteringen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel experimentele benaderingen zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van de hersenen in de regulatie van de ovulatie. Voorbeelden zijn de laesie en deafferentatie van neuronale groepen, beide invasieve methoden die de integriteit van het doelgebied permanent aantasten. Deze methoden gaan gepaard met neveneffecten die van invloed kunnen zijn op de analyse van acute en temporele regulerende mechanismen. De stereotaxische implantatie van geleide canules gericht op specifieke hersengebieden, gevolgd door een herstelperiode, stelt onderzoekers in staat om verschillende geneesmiddelen te micro-injecteren na het verdwijnen van de ongewenste effecten van de operatie. Tetrodotoxine is gebruikt om de rollen van verschillende hersengebieden in diverse fysiologische processen te bepalen, omdat het tijdelijk de natriumafhankelijke actiepotentiaal remt, waardoor alle neurale activiteit in het doelgebied wordt geblokkeerd. Dit protocol combineert deze methode met strategieën voor de beoordeling van de oestruscyclus en ovulatie om de rol van discrete hersengebieden in de regulatie van de ovulatie op bepaalde tijdstippen van een bepaald stadium van de oestruscyclus te onthullen. Wakkere en ongeremde ratten (Rattus norvegicus) werden gebruikt om de blokkerende effecten te vermijden die anesthetica en stresshormonen uitoefenen op de ovulatie. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten, hersendoelen en farmacologische middelen om verschillende fysiologische processen te bestuderen. Toekomstige verbeteringen aan deze methode omvatten het ontwerp van een micro-injectiesysteem met glazen haarvaten met een kleine diameter in plaats van geleideules. Dit vermindert de hoeveelheid weefsel die tijdens de implantatie wordt beschadigd en vermindert de verspreiding van de geïnfundeerde geneesmiddelen buiten het doelgebied.
Inleiding
Ovulatie is het proces waarbij een of meer volwassen eicellen eenmaal per oestrale / menstruatiecyclus uit de eierstokken worden vrijgegeven. Omdat alle zoogdiersoorten afhankelijk zijn van de productie van gameten om te broeden, heeft het begrip van de mechanismen die de ovulatie reguleren een enorme impact op gebieden variërend van biogeneeskunde, de vee-industrie en het onderhoud van bedreigde soorten. Ovulatie wordt gereguleerd door de hypothalamus-hypofyse-ovariële as, die verschillende hypothalamische en extra-hypothalamische gebieden omvat, de gonadotropen in de voorste hypofyse en de theca- en granulosacellen die, samen met de eicellen, de ovariële follikels i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de ethische commissie van Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Deze instelling werkt in strikte overeenstemming met de Mexicaanse regels voor dierbehandeling, officiële norm: NOM-062-ZOO-1999, die overeenkomt met internationale richtlijnen.
1. Bouw van bilaterale canules
- Haal de roestvrijstalen as uit de naaf van twee 23 G hypodermische naalden met een drukpincet en verwijder vervolgens de resterende lijm met een scalpelmes.
- Teken een lijn 15 mm uit het stompe uiteinde van de schachten met een fijne permanente marker. Gebruik een snijpincet om de afg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hierboven beschreven protocol werd getest door de effecten van een enkel TTX of vehikel (kunstmatig hersenvocht; ACSF) micro-injectie in een van de twee verschillende kernen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de regulatie van de ovulatie bij de rat: de suprachiasmatische en de boogvormige kern. De suprachiasmatische kern werd gekozen omdat deze de centrale circadiane pacemaker bij zoogdieren bevat. Het is betrokken bij de regulatie van cyclische gebeurtenissen als de afscheiding van gonadotrofinen. De boogvo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een methode om op elk moment een discreet gebied in de hersenen van wakkere en ongeremde ratten tijdelijk te inactiveren. Een eenvoudige methode om hun oestruscyclus te volgen en de ovulatie te beoordelen, wordt ook aangeboden. Dit protocol maakt een eenvoudige analyse mogelijk van de bijdrage van specifieke hersengebieden aan de mechanismen die de ovulatie aansturen door de ovulatoire uitkomst van met TTX behandelde dieren te vergelijken met die van met voertuigen behandelde dieren. Met uitzonderi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen met betrekking tot dit artikel.
Dankbetuigingen
We zijn Raymond Sanchez van de Universiteit van Washington dankbaar voor zijn waardevolle hulp bij het redigeren van manuscripten en M.Sc. Georgina Cortés en M.Sc. Cintia Javier voor hun technische ondersteuning bij de standaardisatie van deze techniek. We zijn ook dankbaar voor de leden van de dierenartsdiensten van Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández en MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán voor het uitstekende onderhoud en de verzorging van proefdieren. De experimenten beschreven in dit protocol werden ondersteund door DGAPA-PAPIIT subsidienummer: IN216015 en door CONACyT subsidienummer: 236908 roberto Domínguez. Carlos-C....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" roestvrijstalen hypdermic naald | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" roestvrijstalen hypdermic naald | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" roestvrijstalen hypdermic naald | BD | 305106 | |
| Kunstmatige hersenvochtvloeistof | BASi | MD-2400 | |
| Bottrimmer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Boortje voor microboor | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Kniptang | Wahl | ||
| Schnijdisc | Dremel | SM5010 | |
| Snijtang | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylaatlijm | Kola loka | K-1 | |
| Tandartscement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosine | Sigma | E4009 | |
| Stereoscoop | Zeiss | ||
| Extra fijne Bonn schaar | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Gezichtsmasker | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe pincet | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxyline | Sigma | H3136 | |
| Hemostatische klemmen | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilisator | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Zoutzuur | Sigma | 320331 | |
| Hypromellose kunsttranen | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isofluraan | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Micro-injectiepomp | KD Scientific | 788380 | |
| Monomeer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrilhandschoenen | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Oorbars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidon-jodium | Dermo Dine | ||
| Povidon-jodium met zeep | Germisin espuma | ||
| Druktang | Truper | 17371 | |
| Rattenanesthesiemasker | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Zoutoplossing | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpelmes | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Natrium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standaard elektrodehouder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Roestvrijstalen draad | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotactisch apparaat | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Chirurgische schaar | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectoren | Basi | MD-1510 | |
| Teflon buizen | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxine | Alomone labs | T-500 | |
| Verdamper | Kent scientific | VetFlo |
Referenties
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
