Amputatie voorspellen met behulp van lokale circulerende mononucleaire voorlopercellen bij met Angioplastie behandelde patiënten met kritieke ledemaatischemie

Samenvatting

Amputatie van de onderste ledematen kan zelfs optreden na angioplastiek van geblokkeerde vaten in Critical Limb Ischemia (CLI). Mononucleaire progenitorcellen (MPC's) weerspiegelen vasculair herstel. Het huidige protocol beschrijft de kwantificering van MPC's uit de circulatie dicht bij angioplastiek, en de relatie met endotheeldisfunctie en voorspelling van amputatie van de onderste ledematen.

Samenvatting

Kritieke limbischemie (CLI) vertegenwoordigt een vergevorderd stadium van de perifere arteriële ziekte. Angioplastiek verbetert de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat; sommige patiënten gaan echter onomkeerbaar over op amputatie van ledematen. De omvang van vasculaire schade en de mechanismen van vasculaire reparatie zijn factoren die van invloed zijn op de uitkomst van post-angioplastiek. Mononucleaire voorlopercellen (MPC's) zijn reactief op vasculaire schade en herstel, met het vermogen om vasculaire ziekten te reflecteren. Het huidige protocol beschrijft de kwantificering van MPC's verkregen uit de bloedcirculatie van het bloedvat in de buurt van de angioplastiekplaats, evenals de relatie met endotheeldisfunctie en het voorspellende vermogen voor amputatie van ledematen in de komende 30 dagen na angioplastiek bij patiënten met CLI.

Inleiding

Perifere arteriële ziekte (PAD) wordt gekenmerkt door een chronische en progressieve vasculaire obstructie met beperking van de bloedtoevoer¹. Op wereldschaal treft PAD van de onderste ledematen ongeveer 10% van de oudere bevolking, terwijl tot 7% van dergelijke gevallen worden onderworpen aan amputatie van ledematen^2,3.

Critical Limb Ischemia (CLI) vertegenwoordigt de ernstigste presentatie van PAD¹. Patiënten ervaren meestal pijn in rust, zweren of gangreen toe te schrijven aan verstopte slagaders; terwijl de klinische prognose ongunstig is en wordt gekenmerkt door een risico van 30% op amputatie en mortaliteit van ledematen gedurende 1 jaar^3,4,5.

Angioplastiek is een minimaal invasieve endovasculaire procedure die de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat kan herstellen bij patiënten met CLI; sommige patiënten zullen echter onvermijdelijk een grote amputatie van de ledematen nodig hebben, zelfs na angioplastiektherapie^1,5. Vroege identificatie van ongunstige uitkomsten na angioplastiek is vrij waardevol, vanwege de mogelijkheid van therapiehandhaving.

Traditionele risicofactoren kunnen een beperkt voorspellend vermogen bieden voor grote amputatie van ledematen bij patiënten met CLI die een angioplastiek ondergaan⁶. Pathofysiologisch georiënteerde biomarkers vertegenwoordigen nieuwe methoden met potentiële klinische toepassingen, die specifiek nuttig kunnen zijn bij ziekten die verband houden met vasculair letsel⁷. Tegenwoordig is de deelname van cellulaire populaties die endotheelhersteleigenschappen bezitten, op de plaats van de atherosclerotische plaque, steeds meer erkend^8,9.

Mononucleaire voorlopercellen (MPC's) zijn afgeleid van het beenmerg en eigen structurele en functionele kenmerken van stamcellen met vasculaire regeneratieve vermogens. Vanwege het vermogen van MPC om zich te verspreiden, te migreren en vasculaire therapietrouw te vertonen; deze cellen zijn goede kandidaten geworden om endotheelherstel te reflecteren als reactie op ischemie^10,11,12. Bovendien heeft de voortdurende belangstelling voor mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculair letsel het onderzoeken van de prognostische rol van lokale optredende biomarkers gemotiveerd, aangezien zij worden beschouwd als een weerspiegeling van vasculaire schade en herstel^7,13,14.

Het doel van deze studie is om te beschrijven hoe de hoeveelheid MPC's kan worden bepaald die dicht bij de vasculaire obstructie circuleren bij patiënten met CLI die een angioplastiek ondergaan; en hoe de relatie tussen MPC's te evalueren met indicatoren van endotheliale disfunctie en amputatie van ledematen.

In vergelijking met de prognose op basis van comorbiditeiten en intrinsieke vasculaire kenmerken, toont de hoeveelheid lokale MPC's specifiek vermogen om klinische resultaten te voorspellen met betrekking tot endotheeldisfunctie en amputatie van ledematen. Consequent hebben sommige studies de prognostische rol van vergelijkbare biomarkers beschreven tijdens de evaluatie van patiënten met PAD^15,16.

Op basis van eerdere resultaten⁷kan de hier beschreven methode nuttig zijn voor een vroege identificatie van de populatie met een risico op ongunstige vasculaire uitkomsten in verschillende klinische omgevingen, zoals onderste ledematen en coronaire ischemie, beroerte, vasculitis, veneuze trombose en anderen met vasculair letsel en herstel.

Protocol

De institutionele ethische onderzoekscommissie van Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE keurde dit toekomstige protocol goed, alle ingeschreven patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Evaluatie van vasculair blok van onderste ledemaat, bloedafname en ballonangioplastiek

OPMERKING: De studiesteekproef die voor dit experiment werd gebruikt, bestond uit 20 diabetespatiënten van 68 jaar oud en 10 van de 20 mannen. De helft van de steekproef bestond uit rokers en de meest voorkomende co-morbiditeiten waren diabetes mellitus type 2, systemische arteriële hypertensie en/of dyslipidemie. Het monster was bedoeld om gestandaardiseerd te worden voor leeftijds-, geslachts- en co-morbiditeiten. Mogelijke vooringenomenheid als gevolg van klinisch-demografische invloed op de relatie tussen MPC's en CLI kon niet worden uitgesloten.

1. Evalueer de klinische ernst van ischemie van ledematen volgens de Rutherford-classificatie¹³ (zie aanvullende tabel 1).
2. Voer angiografie van de onderste ledematen, bloedafname en ballonangioplastiek uit.
   1. Gebruik antistollingsmiddel en verdovingsmiddelen vóór de operatie.
   2. Plaats een naald van 18 G in het bloedvat op de geselecteerde liesplaats.
   3. Plaats een inzender en schuif een flexibele geleidingsdraad op. Vervolgens wordt de eerste gids verder gewijzigd voor een 6 Fr-introducer.
   4. Gebruik periodieke injectie van contrastmiddelen of CO₂ onder fluorscopische gids om slagaderbaan en vasculaire geblokkeerde plaatsen te identificeren (figuur 1).
      OPMERKING: Gebruik contrastmedia 40 cc, verdund 1:1 in 0,9% zoutoplossing, of CO₂ bij 10 tot 20 ml per schot bij een druk van 12 psi.
   5. Introduceer twee 0,014 Fr navigatiegeleidingsdraden en twee 0,014 Fr-ondersteuningsgeleidingsdraden in het schip en breng ze naar de geblokkeerde locatie.
      OPMERKING: Twee 0,014 Fr geleidingsdraden (260 cm lang) worden gebruikt voor navigatie en twee 0,014 Fr geleidingsdraden (260 cm lang) worden gebruikt voor ondersteuning, tijdens een enkele procedure.
   6. Introduceer 5 Fr en 3 Fr katheters opeenvolgend en verzamel 10 ml bloed van de dichtstbijzijnde plaats bij de vasculaire obstructie. Houd bloedmonsters op ijs.
      OPMERKING: Katheters maten kunnen 5 Fr en 3 Fr zijn, en ze worden gewijzigd tijdens de procedure.
   7. Maak opnieuw een geleidingsdraad. Introduceer vervolgens een angioplastieballonkatheter, die een opblaasbare ballon aan het einde van de katheter bevat. Vervroeg de angioplastiek ballonkatheter en plaats de ballon direct op de plaats van laesie. Voer de angioplastiek uit door de ballon op te blazen tegen de blokkerende plaque aan de vaatwand. Controleer het herstel van de bloedstroom.
      OPMERKING: Er kan een stent in het geblokkeerde gebied worden geplaatst om de slagader na de procedure open te houden.
   8. Breng een katheter aan en ga naar de dichtstbijzijnde plaats bij het vasculaire blok. Verzamel 10 ml bloed met een tijdsinterval van 30 minuten na angioplastiek. Houd bloedmonsters op ijs.
      OPMERKING: Het verzamelen van bloedmonsters voor en na de angioplastiek wordt aanbevolen om de invloed van de angioplastiek op het aantal MPC's verder te evalueren.
   9. Verwijder alle draden onder fluorscopische geleiding.
   10. Zorg voor postoperatieve zorgprocedures, waaronder anti-stollingstherapie met enoxaparine bij 1 mg/kg subcutaan om de 12 uur, aspirine 100 mg, statine en analgesie. Kompres op de plaats van vasculaire punctie gedurende 24 uur.

2. Kwantificering van circulerende mononucleaire voorlopercellen (MPC's) (figuur 2)

1. Breng in een verse conische buis van 15 ml 6 ml van het verzamelde bloed over en verdun 1:1 (v/v) met PBS.
   OPMERKING: Verwerk het bloed binnen 1 uur na het verzamelen.
2. Bereid u voor op de scheiding van de dichtheidsgradiënt door elk 2 ml van het dichtheidsgradiëntmedium toe te voegen aan 3 reageerbuizen. Voeg vervolgens 3 aliquots van het verdunde bloed toe aan elke reageerbuis.
   OPMERKING: Niet meer dan driekwart van de maximale capaciteit van de reageerbuis.
3. Centrifugeren bij 1.800 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Verzamel de interfacelaag die aanwezig is als een ring met behulp van een pipet en breng over in een nieuwe buis. Voeg 2 ml PBS toe en draai op 1.800 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Sla de pellet op omdat deze MPC's bevat.
4. Was de pellet met MPC's met PBS door middel van centrifugatie zoals beschreven in stap 2.3. Gebruik verse PBS voor elke wasbeurt en draai op 1.800 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Herhaal het proces gedurende 6 keer.
5. Gebruik na de laatste wasbeurt 1 ml PBS om de celpellet opnieuw te gebruiken. Verdun 20 μL van de celsuspensie met 20 μL van 0,4% trypan blauw, 1:1 (v/v). Gebruik 10 μL van deze celsuspensie voor het tellen van cellen met behulp van hemocytometer en een lichtmicroscoop.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPC's in eerder gelabelde 5 ml flowcytometriebuizen.
   OPMERKING: Bereid overeenkomstige isotype-afgestemde controleantilichamen voor.
7. Centrifugeer de buizen bij 1.800 x g gedurende 6 min bij 4 °C. Aspirateer en gooi het supernatant weg.
8. Verdun primair antilichaam in 100 μL antilichaam incubatieoplossing [1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] en voeg toe aan de buis. Resuspend gedurende 10 s en incuber gedurende 20 min bij 4 °C, in het donker.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentraties primaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Het protocol kan bij deze stap worden gestopt door lymfocyten in 4% paraformaldehyde in PBS te fixeren en monsters tot 24 uur bij 4 °C op te slaan.
9. Centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 2 min bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspend in 500 μL van 1x PBS, pH 7,4, EDTA 2 mM.
10. Voer flowcytometrie analyse uit.
    1. Stel de achtergrond in met isotype-afgestemde controle antilichamen. Vervolgens, bij de FSC / SSC plot select lymfocyten verspreid, proberen uit te sluiten cellulair puin, resterende granulocyten, en andere deeltjes. Een dergelijke verdeling wordt beschouwd als 100%.
       OPMERKING: Lymfocyten verspreiden zich meestal in het linkerondergebied van het perceel.
    2. Gebruik een poort met gemeenschappelijk immunofenotype met een hoog aantal cellen CD45⁺ en CD34⁺. Selecteer vervolgens voor dubbele positieve immunofenotypen met behulp van gate die eerder CD45⁺, CD34⁺identificeerde en voeg KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ of CD184⁺toe. Identificeer MPC's subpopulaties aan de den van hun specifieke celoppervlakmarkeringen. Rapporteer als het percentage gated events.
11. Identificeer de belangrijkste subpopulaties van MPC's. In deze studie waren de geanalyseerde immunofenotypen CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ en CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    OPMERKING: Deze celoppervlakmarkers werden gebruikt voor het onderzoek: CD45 (lymfocyten), CD34 (endotheel- en/of vasculaire cellen), KDR (VEGFR-2) (membraanmarker van endotheelcellen), CD133 (endotheelvereditorcellen) en CD184 (hematopoëtische stamcellen en endotheelcellen).

3. Relatie van MPC's met wijziging van endotheelfunctie en hemodynamische test (FMD)

1. Bepaal flow-gemedieerde dilatatie (FMD), pre- en post-angioplastiek.
   1. Gebruik een vasculaire lineaire transducer om de diameter van de brachiale slagader te meten.
   2. Plaats de manchet van de sphygmomanometer boven de meetplaats in de onderarm en insufflaat gedurende 5 minuten op 50 mmHg boven de systolische bloeddruk en leeg.
   3. Bepaal opnieuw de diameter van de brachiale slagader binnen de volgende 60 s. Gebruik de onderstaande vergelijking om MKZ te schatten.
      OPMERKING: Bereken de mate van dilatatie met behulp van de vergelijking (%) = (maximale diameter na voorbijgaande ischemie - basale diameter) × 100 / basale diameter.
2. Correleer het aantal MPC's met de baseline FMD-waarde en post-angioplastie delta van FMD.

4. Prognostisch vermogen van MPC's voor amputatie van ledematen

1. Plan periodieke medische afspraken na ballonangioplastiek en patiëntontlading, om de kwaliteit van de bloedtoevoer naar het onderste ledemaat te evalueren.
2. Evalueer de klinische ernst van ledemaatischemie na 2 weken na angioplastiek. Evalueer het oplossen van rustpijn, lagere ischemie en het behoud van een functionele voet, volgens de Rutherford-classificatie¹³.
3. Vergelijk de klinische ernst van ledemaatischemie, bij aanvang versus follow-up. Identificeer die gevallen die een grote amputatie vereisen als gevolg van een ongunstige uitkomst.
4. Correleer het aantal MPC's met het percentage patiënten dat een grote amputatie van het onderste ledemaat nodig heeft.

Resultaten

Bloedmonsters van geblokkeerde slagaders, op de plaats gericht voor angioplastiek, werden verzameld bij 20 diabetespatiënten, 68 jaar oud en 10 van de 20 mannen. De helft van de steekproefpopulatie was roker. Vasculaire laesies werden voornamelijk gescoord als Rutherford klasse VI; overwegende dat patiënten een hogere prevalentie van type 2 Diabetes Mellitus (100%), hypertensie (70%) dyslipidemie (55%).

Een klinische follow-up van 30 dagen na angioplastiek van de onderste ledematen werd uitgev...

Discussie

Bloedafname op de precieze plaats van het vasculaire blok kan technische problemen vertonen; daarom hebben we bloedafname uitgevoerd in de nabijheid van vasculair blok. Evenzo lijkt de hoeveelheid MPC's dicht bij de vasculaire plaque zeer dynamisch te zijn en kan variaties ontstaan voor en na angioplastiek. Volgens onze observaties wordt aanbevolen om baseline- en 30min-post-angioplastieveranderingen in het aantal MPC's te evalueren, omdat ze verschillende patofysiologische processen kunnen weerspiegelen die optreden bij...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumine (BSA) als buffermiddel, stabilisator, standaard en voor blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant kalibratiekralen worden geleverd in een waterige oplossing die 0,05% natriumazid bevat. 3,5 ml voor maximaal 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antilichaam geconjugeerd aan R-Fycoerytrine in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoklonaal, Isotype recombinant humaan IgG1, geconjugeerd
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antilichaam geconjugeerd aan R-Fycoerytrine in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	De monoklonale antilichaamklon AC136 detecteert een klasse III epitoop van de CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoklonaal CD45 antilichaam, humaan geconjugeerd
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conische centrifugebuizen
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyreen Ronde-Bodembuis. 12x75 stijl. Stérile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Zware metalen, (als Pb) <10ppm, Fe<0,01%, As<1ppm, Onoplosbare stoffen<0,005%
Improved Neubauer	Zonder merk	Zonder catalogusnummer	Hemocytometer voor celtelling. (bereik 0,1000mm, 0,0025mm2)
K2 EDTA Bloedopnamebuizen	BD Vacutainer	#367863	Lila plastic vacutainerbuis (K2E) 10,8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Stérile en gecontroleerd op de aanwezigheid van endotoxinen. Dichtheid: 1.077±0,001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixatie van biologische monsters, (poeder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	De overdrachtspijp is een hulpmiddel dat vloeistofoverdracht met grotere nauwkeurigheid vergemakkelijkt.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Hittebestendige testbuizen. MAAT/DECKSEL 13 x 100 mm